citocromo ossidasi e NADH attività riduttasi citocromo c sono stati analizzati biochimicamente in gingiv.il hiops & gt; i campioni ottenuti da 22 pazienti di sesso maschile (età 23-72) sottoposti a trattamento parodontale. Istologicamente. 13 esemplari esposti lieve infiammazione, mentre 9 hanno mostrato una risposta infiammatoria più gravi. ossidasi citocromo era significativamente maggiore nel leggermente infiammata che in campioni di tessuto marcatamente infiammate. NADH citocromo c reduttasi invece non è risultata significativamente modificata dalla crescente grado di infiammazione. La possibilità di coinvolgimento degli effetti di infiammazione su enzimi ossidativi è discusso in relazione al degenerative e proliferative cambiamenti che si verificano in entrambi i tipi di tessuto.
Introduzione
citocromo ossidasi (E.C1.9.3.1 .) e NADH reduttasi citocromo C (ECI, 6. 2. I.) sono stati determinati essenzialmente normale gengiva umana (Eichel & amp; Sharhrik 1964), tuttavia questi parametri non sono stati precedentemente analizzati in relazione agli effetti imposti da infiammazione gengivale. studi respirazione endogena hanno rivelato che il QOj è stimolata in lieve infiammazione gengivale e depresso in gengiva altamente infiammata (Glickman El Al 1949, Manhold & amp;. Volpe 196,1). Sulle recenti studi polarographie altra parte (Zajieck & amp; Kindlova 1972) hanno rivelato che QO_ iniziale. I valori sono rimasti costanti in gengiva umana e non altera in modo significativo il grado di infiammazione. Alla luce di questi punti di vista divergenti, vogliamo segnalare l'effetto di infiammazione su citocromo ossidasi e NADH citocromo c riduttasi attività in omogenati totali di gengiva umana.
Metodi e materiali
Preparazione del tessuto
campioni bioptici gengivali umani sono stati ottenuti irom 22 pazienti di sesso maschile (età 23-72), sottoposti a trattamento parodontale. anestesia blocco regionale è stato somministrato per evitare l'infiltrazione del tessuto. Il tessuto è stato chirurgicamente rimosso e tagliato in due porzioni di cui una è stata preparata per lo studio istologico. L'altro è stato lavato a freddo 0,075 M tampone fosfato pH 7,0. per rimuovere il sangue aderendo e rapidamente congelati a - 70 & deg; C in ghiaccio secco. Il fro /it campioni gengivali sono stati analizzati per la loro attività enzimatica entro un giorno dopo la loro rimozione. omogenati gengivali sono stati preparati da una modifica dei metodi (Hoober & amp; Bernstein 1966) utilizzati tor l'omogeneizzazione della pelle di ratto. Il tessuto gengivale congelati (25 mg -5U peso bagnato.) È stato immerso in un liquido N, (-270'C) per 3 minuti, e polverizzato per piccoli frammenti granulari. I frammenti gengivali sono stati omogeneizzati in tampone freddo in Ten Broeck omogeneizzatori vetro smerigliato che sono stati macinati per adattarsi con una tolleranza di liquidazione o ((1,1-0,15 mm. Le attività enzimatiche sono stati determinati subito dopo omogeneizzazione dei tessuti.
Enzyme Analisi
citocromo ossidasi (CE 1. 9. 3. 1.) (Wainio et al 1951.) è stata determinata spettrofotometricamente HY dopo l'ossidazione del ditionito ridotto citocromo c * a I al 25 & deg; C in Gilford Modello 2400 spettrofotometro. in esperimenti nil tasso auto-ossidazione di lerrocytoehrome c prima dell'aggiunta dell'enzima era trascurabile. la E.VHI "", i valori di assorbanza per omogenato sedimentazione sono stati per la maggior parte trascurabile (0.0% in 16 campioni), e in caso di scoperta che variavano da 0, (12-13,0 ';. del valore enzimatica il valore medio di assestamento è stata del 2,5 & plusmn; 0.9. Ci per i 22 campioni che sono stati analizzati di assestamento valori sono stati determinati da ri-riducendo la reazione media con eccesso ditionito, risospendere l'omogeneizzato in mezzi di reazione, e in seguito alla variazione di assorbanza ottica a Ejaonni VS- tempo graficamente. I valori di sedimentazione sono stati sottratti dal valore di assorbanza totale osservato ottenuti nei saggi enzimatici interessati e le specifiche attività sono stati determinati dai valori corretti. La miscela di reazione conteneva: 75 mm KH..PO |-Na, .HPO4 tampone pH 6,75. 5,6 uM citocromo ce (25-150) proteine dima (homogenale) in un volume finale di 300 u. concentrazione citocromo c è stata determinata dal coefficiente di estinzione millimolare del citocromo c H - ,, -,,, t] ll = 18,5 mm 'cm' per la riduzione meno ossidato cvtoehrome c
NADH citocromo c reduttasi.. NADH citocromo c reduttasi (E. C. 1. 6. 2. 1.) (Jeng et al. 1968) è stato determinato seguendo la riduzione del citocromo c in Er ,, TNM a 25'C. Il coefficiente di estinzione millimolare utilizzato per citocromo c nel test citocromo ossidasi è stata utilizzata per questo test. Il sistema di analisi contenuta: 33 mm KHiPOi-NaoHPO, pH 7,75 tampone, S.2 FTM citocromo c, 3.0mm KCN, 85 /LIM NADH ** e (25-150) ^ g di proteine (omogeneizzato) nel volume finale di.. 300 II.
attività specifiche
attività specifiche sono espressi come nanomoies di citocromo c ossidato (citocromo ossidasi) o ridotto (NADH citocromo c reduttasi) per mg di proteina per min.
proteine Determinazione
omogenati tissutali (10-20 /a) sono stati digeriti in 0,05 N NaOH (concentrazione finale) per un'ora a 25 & deg; C, e analizzati per la proteina con il metodo di Lowry et al .. ( 1951). Cristallino albumina *** è stato utilizzato come standard.
Statistica
La media, la deviazione standard ed errore standard sono stati determinati per ciascun gruppo. I valori superiori ai limiti & plusmn; 1,96 SD sono stati scartati. La differenza tra ciascun gruppo è stato analizzato con il test "t di Student" e tutti i valori p. polverizzazione del (emissione, scongelamento e successiva omogeneizzazione sembra perturbare adeguatamente le cellule. La prova per questa interpretazione risiede nell'osservazione che la distribuzione di NADH citocromo c reduttasi sia gengiva leggermente infiammata e marcatamente infiammata non variano significativamente. Se il calo citocromo ossidasi è stato influenzato dalle nostre tecniche di preparazione del tessuto, risultati simili devono essere osservate nelle NADH citocromo distribuzioni c reduttasi. la quantità di assestamento nostro sistema dosaggio è stato ritenuto trascurabile per la maggior parte e non potrebbe spiegare il netto calo attività di citocromo ossidasi osservato in gengiva marcatamente infiammata.
L'attività cylochiomc ossidasi elevata osservata nel nostro studio coincide con le osservazioni fatte da Manhold e Volpj (1963) nei loro studi QCK respirazione endogena di leggermente infiammata e proliferanti gengiva umana. L'aumento della QOL & gt; e citocromo ossidasi in gengiva può rispecchiare un aumento sintesi mitocondriale elevata adesione energia (ATP), che è richiesto per sostenere i processi altamente synthelic associati con la sintesi del DNA, la mitosi, così come la proliferazione cellulare. Ulteriore evidenza per l'aumento dei requisiti bioencrgelic nel pre-proliferante e stadi di sviluppo delle cellule proliferative è l'osservazione che l'aumento QOL. (Respirazione endogena) (Glickman El Al. 1949), e citocromo ossidasi (Fine 197 (1) raggiunge picchi di attività in un momento in cui i principali aumenti dell'indice mitolic e la proliferazione (epitheiialization) si verificano nella rigenerazione gengivali e la pelle ferite. Sul d'altra parte IHE forte calo di citocromo ossidasi e endogena qoo osservato in marcatamente infiammato (Manhold & amp;. Volpe 1963 Giickman et al 1949) gtngiva sembrano essere riflessi di cambiamenti che si verificano all'interno dei mitocondri e altri componenti subcellulari durante significativa distruzione del tessuto gengivale . non è stato possibile delect un aumento della citocromo ossidasi in gengiva marcatamente infiammata e proliferanti. sebbene aumenti del QO endogena. è stata rilevata da Giickman et al. (1949) in questo tipo di patologia gengivale. Tuttavia, è lhal concepibile come infiammazione sussidi, una fase preproliferativo (fase S della mitosi) si verifica all'interno delle cellule che migrano ai margini della ferita che richiede un aumento della sintesi di ATP. in seguito un aumento della qualità della vita endogena. si osserva anche. I nostri dati citocromo ossidasi, ed i dati riportati per la respirazione endogena QOj non coincidono con la QO polarografica. osservazioni fatte da Zajieek e Kindlova (1972), che ha riportato thai iniziale QO_ & gt; I valori sono rimasti costanti in gengiva umana, e non altera in modo significativo il grado di infiammazione.
NADH citocromo c reduttasi attività non era marcatamente alterata dal grado di infiammazione gengivale umana. I nostri dati per gengiva umana parallele l'osservazione fatta da Eichel e Shahrik (1964), per la gengiva infiammata non umana. NADH cylochrome c reduttasi attività è risultato essere significativamente maggiore rispetto cytohrome ossidasi nei nostri studi che correla con l'osservazione fatta da Eiehcl e Shahrik