Abstract
sfondo
Un certo numero di agenti patogeni può causare gravi distruzione dell'apparato parodontale durante il corso della parodontite. Lo scopo di questo lavoro è stato lo sviluppo di un dispositivo diagnostico per l'uso al punto di necessità per la rilevazione di patogeni parodontali per permettere una terapia personalizzata per il trattamento di periodontite.
Metodi
Questo test è basato sulla reazione a catena della polimerasi del DNA isolato da patogeni parodontali ed è stato esaminato per rilevare con precisione sequenze specie-specifici su un chip rotante con reagenti liofilizzati per la reazione a catena della polimerasi. La conservazione dei reagenti è stato ottimizzato per garantire la loro stabilità durante lo stoccaggio.
Risultati
Nel lavoro attuale, abbiamo sviluppato un dispositivo point-of-care modello e ha mostrato un proof of concept. Richiede basso volume del campione, è risparmio di tempo e può quindi facilitare la diagnosi precoce e il trattamento delle malattie parodontali.
Conclusioni
Il dispositivo messo a punto in grado di fornire una diagnosi rapida della composizione e la quantità di flora orale dei pazienti e potrebbe aiutare a valutare la fase di infezione parodontite. Questo può facilitare una ottimizzazione degli approcci terapeutici al fine di prevenire alcune delle conseguenze più gravi della malattia.
Parole
batterica quantificazione parodontite real-time PCR microbiche diagnostica liofilizzazione elettronico materiale supplementare
La versione online di questo articolo (doi:. 10 1186 /s12903-015-0155-y) contiene materiale supplementare, che è disponibile per gli utenti autorizzati
Sfondo
Circa il 90% dei problemi di esperienza popolazione dentali o orale di tutto il mondo durante la loro. vite [1]. 11,2% degli adulti sono affetti da periodontite gravi, rendendo così un argomento pertinente nel settore sanitario dentale [2].
Periodontitis è un complesso risposta infiammatoria del corpo umano contro i microrganismi, che può portare alla distruzione tissutale grave la cavità orale [3].
I fattori di rischio che portano a infezioni sono stati identificati come il fumo, il diabete, la presenza di microrganismi speciali, obesità, psicologici e gli aspetti igienico. Inoltre, fattori genetici, età, sesso ed etnia potrebbe anche svolgere un ruolo nello sviluppo della malattia parodontale [4].
Per la diagnosi di parodontite, sono state stabilite diverse pratiche. esami parodontali diretti includono anamnesi del paziente, le misurazioni di profondità di sondaggio tasca e il livello di attacco clinico e delle radiografie dentali. Inoltre, i test di suscettibilità genetica o l'esame della microflora subgengivale e fluido crevicolare sono metodi opzionali per valutare la malattia parodontale [5]. A seconda dei risultati della diagnosi medica e stadio della malattia, una terapia appropriata segue. Approcci come ad esempio l'ottimizzazione di igiene orale, regolare pulizia professionale, scalatura /debridement e levigatura delle radici, l'uso di antibiotici per controllare la formazione della placca batterica e infiammazione, e anche in casi estremi, la chirurgia può essere necessaria per prevenire la perdita dei denti [6].
dei circa 600-700 specie batteriche che vivono nelle zone subgengivali, solo pochi di loro sono associati con parodontite e può portare a cambiamenti significativi nella orale microbica della comunità, quantità e la composizione [7, 8]. Al fine di valutare la fase di infezioni parodontite ed avviare trattamenti efficaci, è utile per determinare sia l'identità delle specie interagenti nonché il numero complessivo di agenti patogeni che vivono in tasche parodontali. Il lavoro qui presentato si concentra su specie di batteri dimostrato di essere associato con parodontite, che possono essere delineati in tre classi sulla base di patogenicità: E. corrodens, F. nucleatum, pag micra
sono leggermente patogeni, P. intermedia, C. retto, E. nodatum Quali sono moderatamente patogeni e A. actinomycetemcommitans, P. gingivalis, T. denticola
organismi patogeni fortemente [9]. Nonostante il fatto che ulteriori specie, l'espressione di marcatori tipici e la vita individuale delle persone possono influenzare lo sviluppo della malattia così, la rivelazione di queste specie marcatore può essere un primo passo nel processo di identificazione di una malattia o condizione medica in più in dettaglio.
Se i tipi di specie batteriche che vivono in tasche parodontali possono essere identificati, queste informazioni possono essere utilizzate per classificare meglio la natura e la gravità dell'infezione e su una terapia personalizzata più adatta alle invertire il suo corso [10].
Solo pochi punti di dispositivi di assistenza per l'acido nucleico sono stati sviluppati e consolidati di rilevamento basata sul mercato fino ad ora. GeneXpert di Cefeide, per esempio, è un dispositivo automatizzato per la reazione a catena della polimerasi (PCR) con cartucce per la preparazione del campione speciale per gli agenti patogeni della tubercolosi, MRSA o streptococchi del gruppo B. Tuttavia, questo sistema ad alto costo non consente la possibilità di attuare diverse reazioni multiplex in una corsa di prova. IQuum recentemente presentato l'analisi PCR-driven del virus HIV in 1,5 ore utilizzando l'analizzatore LIAT e Lutz et al.
Dimostrato un sistema di lab-on-a-foil realizzando una reazione di amplificazione per MRSA in meno di 20 minuti [11]. Inoltre, Van Oordt et al. [12] hanno riportato nel 2012 circa un sistema integrato per il rilevamento di acidi nucleici o immunodosaggi con l'aiuto di una piattaforma Labdisk getta.
Nel presente studio, lo sviluppo di un semplice da usare, a basso costo del sistema lab-on-chip per il rilevamento, l'identificazione e la quantificazione dei batteri parodontali è il fattore primario nella progettazione del saggio biologico molecolare e dispositivo diagnostico. Il sistema diagnostico è costituito da due elementi principali: una cartuccia microfluidica, che contiene tutti i reagenti PCR necessarie in un formato disidratato, e un dispositivo hardware responsabile per la guida e il controllo del flusso di lavoro. Quest'ultimo è un complesso di blocco riscaldante radialmente suddiviso contenente più zone di temperatura stabile per le diverse fasi del PCR, in combinazione con un motore rotativo centrale contenente un montaggio per un policarbonato (PC) circuito PCR. Questo chip ospita il campione del paziente in camere di reazione e ruota attraverso le zone di temperatura sul blocco di riscaldamento per effettuare la PCR. L'importo amplicone aumento può essere rilevato tramite misure di fluorescenza.
Esistono dispositivi di rotazione concettualmente simile, come ad esempio la messa a fuoco 3M ™ Cycler, che utilizza la combinazione di forza centrifuga e l'energia infrarossa come fonte di calore per la PCR. L'analisi dei campioni è realizzato sia in un disco universale monouso per analisi utente o per particolari malattie in un chip con kit specifici che richiedono molte fasi di pipettamento o il raffreddamento dei reagenti [13]. Anche Sun et al.
[14] ha mostrato 2007 Un microchip circolare per l'applicazione di amplificazione ferrofluidi e forze magnetiche, rivelando il problema della produttività bassa campione.
Il sistema di amplificazione e la misurazione lab-on-a-chip basato presentato in questo lavoro ha il potenziale per ottimizzare la diagnostica parodontite convenzionali in futuro minimizzando fasi di manipolazione di laboratorio e di consentire la realizzazione rapida di PCR, evitando un tempo di trasporto dei campioni dei pazienti. Inoltre, la configurazione basato su chip può essere integrato con moduli per l'isolamento del DNA nelle versioni successive. In questo modo, il nostro obiettivo è quello di eliminare in termini di tempo e di alta intensità di lavoro passaggi durante la preparazione del campione.
Metodi
batterica ceppi /condizioni di coltivazione /DNA isolamento
parodontite batteri che causano sono stati ottenuti dalla raccolta tedesca di microrganismi e colture cellulari (DSMZ, Braunschweig, Germania) e coltivate in terreno appropriato (vedere file aggiuntive 1: Tabella S1). Le colonie o batteri pellet da un supporto liquido per centrifugazione potrebbero essere raccolti per l'isolamento del DNA. purificazione del DNA è stato realizzato con l'aiuto del QIAamp DNA Mini Kit ® (Qiagen, Hilden, Germania) secondo le istruzioni del produttore. la resa del DNA e la purezza sono stati misurati con lo strumento NanoDrop 1000 (Thermo Scientific, Wilmington, Stati Uniti d'America).
PCR
L'individuazione e la quantificazione dei batteri parodontali amplificazione sono state effettuate utilizzando un LightCycler 480 II. sequenze primer sono dati in file aggiuntive 2: Tabella S2. I primer per l'amplificazione del frammento di DNA specie-specifico sono stati progettati durante questo progetto con l'ausilio del software Primer3. Universali 16S primer sono stati adottati da Kommedal et al. . [15]
condizioni bicicletta per l'amplificazione sono stati i seguenti: 5 minuti di incubazione a 95 ° C, seguita da 40 cicli di amplificazione (95 ° C per 10 s, 51 ° C per 10 s e 72 ° C per 15 s). Dopo ogni ciclo di PCR, un ulteriore analisi della curva di fusione è stata effettuata per caratterizzare le molecole di DNA prodotti.
Curve standard
Per stabilire curve standard, una serie di diluizioni di DNA batterico da 2 a 2 milioni equivalenti genomici sono stati utilizzati in un tentativo di quattro volte per quantitativa real-time PCR. Le curve standard sono stati creati per impostazione predefinita con il metodo punti di adattamento del programma LightCycler. Per il numero di batteri in generale, Porphyromonas gingivalis
servito come rappresentante per 16S PCR con un numero medio copia di quattro copie del gene 16S. Lo standard è stato istituito per ottenere un numero di agenti patogeni stimato per la quantificazione. E 'noto che diverse copie del gene 16S possono verificarsi entro un genoma procariotico, con un massimo di 15 copie per Bacillus thuringiensis
. Questo fatto rende difficile stimare la carica batterica complessiva realistico in una popolazione eterogenea di batteri con fortemente variabile numero di copie tra le singole specie. Gli organismi che causano parodontite utilizzati nella nostra indagine sono da ritenersi nella gamma numero di copie inferiore in base alle informazioni contenute nel database RNA ribosomiale Operone Copy Number [16]. Per dimostrare questo, il numero di copie noto per E. corrodens
è stato determinato nel corso di questo lavoro. Per gli organismi non in sequenza, copia determinazione numero può essere raggiunto con l'aiuto di analisi Southern Blot. Una sonda 16S può rilevare il numero di regioni equivalenti nel genoma ristretto, come precedentemente illustrato da Lee et al. [17].
Southern
macchia Per determinare le 16S copia numero di E. corrodens zona Via Southern Blot, a circa 10 mg di DNA sono stati digeriti con enzimi di restrizione Eco RI
HF, Hind III
(New England Biolabs, Ipswich, Stati Uniti d'America), Nco
io, Pst
io, Xba
I (Jena Bioscience GmbH, Jena, Germania) e Xho
I FD (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) a 37 ° C durante la notte. I campioni, insieme con l'amplicone 16S PCR come controllo positivo, sono stati separati su un gel di agarosio 1% a 4 ° C. Il gel è stato preparato per capillare blot con depurinazione (0,25 M HCl), denaturazione (1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH) e la neutralizzazione (3 M NaCl, 0,5 M Tris-HCl), seguito da blotting notte su una membrana di nylon.
per l'ibridazione, la biotina PCR Labeling master (Jena Bioscience, Jena, Germania) è stato utilizzato per generare una sonda. 16S primer e DNA stampo da corrodens E.
sono state applicate per la produzione di un amplicone biotinilato per incorporazione di dUTPs biotinilati durante la PCR. La sonda è stato purificato con il NucleoSpin® Gel e PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Düren, Germania). Per garantire una sequenza bersaglio completa per ibridazione, è stato condotto un esame delle possibili siti di taglio all'interno della sequenza: un'incubazione enzimatica dell'amplicone 16S con gli enzimi di cui sopra e la successiva verifica confrontando la dimensione del gruppo di amplicone digerito al DNA di controllo in un agarosio gel è stato eseguito.
Dopo pre-ibridazione notte a temperatura ambiente seguita da una incubazione di 2 ore a 42 ° C, ibridazione con sonda 200 ng /ml di tampone stata effettuata. procedure di ibridazione e rilevazione sono state eseguite come descritto nella biotina cromogenico Detection Kit (Thermo Scientific, Schwerte, Germania), con conseguente formazione di un precipitato di colore.
PCR-on-a-chip
La PCR è stato implementato su 1 mm di spessore chip PC con cavità che contengono un volume di 10 ml di miscela di reazione. I chip sono stati sigillati con lamine di tenuta (nerbe plus GmbH, Winsen /Luhe, Germania) da entrambi i lati con il mix PCR incorporato.
Per l'amplificazione, il chip PCR ruota sul dispositivo thermocycling, che è mostrato in Fig. 1. In breve, è composta da sei circolarmente disposti blocchi a forma di pie slice riscaldamento, tre di loro per realizzare denaturazione, annealing e allungamento e tre blocchi supplementari per conseguire rapidi cambiamenti di temperatura all'interno delle cavità. Figura. 1 dispositivo cicli termici con diverse zone di temperatura e un chip PCR rotante. Sinistra: Un disegno schematico illustra la disposizione degli elementi riscaldanti (Ta = temperatura di ricottura) e il rivelatore a fluorescenza. Un chip rotazione passa ciascuna zona e a 72 ° C si misura il segnale di fluorescenza. L'immagine di destra mostra il set-up di laboratorio, compresa la motore di azionamento e controllo della temperatura
Per prova di concetto dell'apparecchiatura, una PCR consolidata di S. aureus
(ATCC 2592), con una dimensione amplicone di 279 bp è stato utilizzato. condizioni bicicletta erano un'iniziale 5 min denaturazione, seguiti da 30 s in ciascuna delle sequenziali 95, 61 e 72 ° C passaggi per amplificazione per un totale di 40 cicli, con 5 s trascorso sui piatti situati tra ciascuno dei tre.
mix la reazione stessa è stato ottimizzato con diversi additivi come descritto nella seguente sezione 'liofilizzazione' per aumentare la PCR-compatibilità del PC e consentire liofilizzazione del mix.
liofilizzazione
Un test per determinare la effetto di liofilizzazione di reagenti PCR sulla reazione di amplificazione è stata condotta utilizzando il E. corrodens
specifico PCR sistema di test ben caratterizzato. La miscela PCR conteneva una concentrazione finale di 0,25 mM per ciascun primer, 50% 2x SBYR verde Mastermix (Roche, Mannheim, Germany), 5% trealosio, 0,25 mg /mL di BSA, 0,75% PEG 8000, 10 DNA ng e il resto DDH
2O. Il mix liofilizzazione è stato congelato a -80 ° C per 15 minuti ed infine liofilizzata per tre ore in un liofilizzatore preraffreddato. stoccaggio a lungo tempo fino a quattro mesi a 4 ° C e temperatura ambiente sono stati confrontati, con miscele protette dalla luce, con e senza l'aggiunta di polimerasi stabilizzazione trealosio, utilizzando il sistema LightCycler per PCR in tempo reale. Un controllo negativo è stato eseguito durante la liofilizzazione per escludere ogni contaminazione durante il processo.
Risultati
curve standard
per l'individuazione e la quantificazione dei dieci batteri che causano parodontite-utilizzati in questo studio, e per determinare i limiti di rilevazione , sono stati stabiliti PCR quantitativa. Utilizzando serie di diluizioni del numero di copie genoma batterico, curve standard sono stati creati secondo le curve di amplificazione risultanti. Come esempio, le curve standard di C. gingivalis
e E. corrodens
figurano nella Fig. 2. Per ottenere risultati affidabili e riproducibili, l'efficienza della PCR deve essere maggiore di 1,8. Le curve standard sono stati istituiti per i restanti batteri parodontali nello stesso modo. Figura. 2 curve standard: punto (CP) in funzione della concentrazione del campione che attraversa. un gingivalis C. con un'efficienza di 1,80 da 20 a 2 milioni di batteri, e (b) E. corrodens con un'efficienza di 1,99 che vanno da 200 a 2 milioni di batteri. Tutti i dati sono presentati come media ± SD
limiti di rilevamento determinati dalla LightCycler 480 II sono stati i seguenti: P. intermedia
2000 copie /reazione, C. gingivalis
20 copie /reazione, C. retto
2 copie /reazione, A. actinomycetemcommitans
10 copie /reazione, P. gingivalis
10 copie /reazione, E. corrodens
200 copie /reazione, P. micra
2000 batteri, T. denticola
20000 copie /reazione, conta nel complesso 200 copie /reazione.
Southern Blot
La restrizione endonucleasi Eco
RI, Hind
III, Nco
io, Pst
I , Xba
I e Xho
mi sono stati usati per stimare il numero di 16S operoni presenti nel genoma di E. corrodens.
Questi enzimi sono stati inoltre testati per assicurare che non vi era alcun sito di taglio all'interno della regione 16S , in cui la sonda di rilevazione ibrida durante la Southern Blot, al fine di prevenire il verificarsi di troppi gruppi derivanti dal legame della sonda per tagliare sequenze bersaglio. Come mostrato in Fig. 3, un numero massimo di quattro bande poteva essere individuato dopo il taglio con Eco RI
, Hind
III e Pst
I. La presenza di un minor numero di bande visibili per la restrizione con Nco
I, Xba
I e Xho
potrei essere il risultato della comparsa di filamenti di DNA lunghi contenente due o più regioni 16S dopo incubazione enzimatica. Secondo le nostre ricerche, una serie 16S operone di quattro è molto probabile per E. corrodens
, quindi utilizzando P. gingivalis
, che contiene lo stesso numero di 16S operone, come standard per stimare il numero di batteri in generale, sembra essere molto appropriato. Figura. 3 16S copia numero di E. corrodens determinata dalla ibridazione Southern. Il DNA genomico è stato tagliato con 1) Eco
RI, 2) Hind
III, 3) Nco
I, 4) Pst
I, 5) Xba
I, 6) Xho
I. 7) controllo positivo. Eco
RI, Hind
III e Pst
mi indicano il numero massimo di 4 bande
PCR-on-a-chip
misure di primo fluorescenza sono state effettuate con il sistema di misurazione della fluorescenza Qiagen ESElog posto direttamente sopra la 72 ° C zona di temperatura del dispositivo thermocycling, che è responsabile per la fase di allungamento della PCR. Il ESElog USB E470 /D520 è adatto per il rilevamento della SYBR colorante verde DNA intercalanti contenuta nel mastermix PCR.
Per ogni ciclo durante il quale il chip campione contenente passato attraverso ciascuna delle diverse zone di temperatura sul dispositivo thermocycling, il continuo aumento della fluorescenza corrispondente all'importo di S. aureus
amplicone presente SPECIFICI in quel momento è stata misurata. Il conseguente aumento della fluorescenza misurato su 40 cicli dal rivelatore può essere visto in Fig. 4. Fig. 4 rivelatore a fluorescenza in tempo reale. Singleplex PCR mostrato sul sistema lab-on-chip. una misura fluorescenza esemplare mostrato per due campioni. b risultante ampliconi su un 2% gel di agarosio
Durante le fasi di riscaldamento, la formazione di bolle nella camera di PCR ha portato ad aberrazioni nel corso dell'amplificazione come esemplarmente indicato nel ciclo 20 e 39 del campione 2 (vedi Fig. 4a). Tuttavia, il previsto aumento di fluorescenza e un risultato positivo PCR del bersaglio 279 bp regione di S. aureus
stati dimostrato nelle prove iniziali (vedi Fig. 4b).
Liofilizzazione
mantenere l'attività biologica della polimerasi dopo liofilizzazione è stato dimostrato per il periodo in esame di quattro mesi. E. corrodens
valutazione SPECIFICI PCR mostra che questa conservazione a lungo termine a 4 ° C dopo liofilizzazione non ha portato a tutti i cambiamenti della curva di amplificazione, mentre conservazione a temperatura ambiente appiattito il corso tipico della curva e la sua caratteristica esponenziale aumentare. In questo caso, il tempo reale punti PCR attraversamento verificato in modo ritardato (vedi Fig 5 e file aggiuntive. 3: Tabella S3). Figura. 5 Test liofilizzazione. Confronto della polimerasi dopo 1 (a) e 4 (b) mesi di stoccaggio di) stoccaggio liofilizzato PCR mixes.1-3 a 4 ° C, 4) conservazione a 4 ° C senza aggiunta di trealosio, 5-7 ) conservazione a temperatura ambiente, 8) conservazione a temperatura ambiente, senza aggiunta di trealosio, 9) PCR controllo negativo, 10) di controllo negativo conservato a 4 ° C, 11) controllo positivo dopo liofilizzazione
l'aggiunta di trealosio al mix PCR risultata essenziale per la conservazione a lungo termine, in particolare a temperatura ambiente. Amplificazione con la miscela di reazione, senza trealosio ha portato ad un segnale debole, bassi livelli di fluorescenza complessivi e CP ritardati dopo conservazione a temperatura ambiente per quattro mesi.
Discussione e conclusioni
parodontite è una malattia onnipresente in tutto il mondo con la necessità per la diagnostica efficaci , trattamento veloce e inibizione della sua progressione per prevenire la perdita dei denti. Inoltre, le infezioni orali possono potenzialmente portare a malattie secondarie gravi quali sepsi, sistemica o disturbi cardiovascolari e polmonite [18].
Al fine di agevolare l'individuazione e la quantificazione dei batteri di specie indicative della malattia, abbiamo sviluppato una PCR-driven point-of-care dispositivo per l'identificazione degli agenti patogeni parodontite associata e ha mostrato le funzionalità di base.
il test PCR quantitativa per ceppi batterici è stato sviluppato con successo e curve standard sono stati istituiti con il sistema LightCycler. Per la quantificazione assoluta, concentrazioni sconosciute dei campioni possono essere confrontati con le curve standard già previste, se almeno un campione singolo standard a concentrazione nota rientrano nell'intervallo della curva importato deve essere incluso in ogni ciclo di PCR per servire come riferimento. Ximénez-Gualdo Tadino et al.
Già dimostrato nel 2000 che i campioni di placca subgengivale di pazienti sani spesso contengono numeri batteriche significativamente più bassi, così i limiti di rilevazione raggiunti qui di soli due batteri, in alcuni casi sono adatti per analizzare la spesso molto elevato cariche batteriche nei casi di parodontite esistenti [19]. Sviluppare ulteriormente il dispositivo, la procedura descritta quantificazione sarà trasferita sul dispositivo point-of-care per consentire test di campioni derivati da pazienti in futuro.
Analisi Southern Blot possa identificare quattro copie della regione 16S nel genoma di E. corrodens
. Questo metodo aggira sequenziamento del completo E. corrodens
genoma, la cui sequenza completa non è ancora disponibile. Tuttavia, questo numero potrebbe essere superiore nel caso di taglio incompleto dagli enzimi di restrizione o in caso di due o più aree 16S essendo disposti su un frammento di DNA derivante da restrizione digest. Tuttavia, questi risultati mostrano che l'uso di gingivalis P.
come rappresentante per i batteri periodontopathogenic è appropriato per generare la curva standard per la conta batterica totale con un tipico 16S numero di quattro copiare. L'uso di questo batterio per la generazione di una curva standard universale per la valutazione del totale conta microbica è stata già descritta da Kirakodu et al.
[20].
Come prova di concetto, il saggio PCR potrebbe essere mostrato a lavorare in chips PCR in rotazione su diverse zone di riscaldamento su un dispositivo ciclo termico appositamente progettato. A causa del piccolo volume di reazione richiesto e la mancanza di necessità di riscaldamento e raffreddamento passi dai blocchi riscaldanti stessi, il tempo di reazione era di un terzo più veloce rispetto a termociclatori convenzionali, anche senza alcuna cura supplementare presa per ottimizzare ulteriormente le singole fasi PCR.
In futuro, questa reazione sarà ottimizzato con denaturazione /passaggi di ricottura accorciati e PCR-additivi o polimerasi veloci, per esempio, un KAPA2G veloce DNA polimerasi (Kapabiosystems, Wilmington, Stati Uniti d'America), con un tempo di allungamento di circa 1 s /kb , portando così ad un tempo di reazione generale significativamente ridotto. Inoltre, una ulteriore riduzione del volume di reazione può accelerare il trasferimento di calore, riducendo di conseguenza la quantità di reagenti e costi [21].
Nel nostro sistema point-of-care, fasi di pipettamento per i singoli reagenti vengono minimizzati portando a meno fonti di errore e aumentando la convenienza per l'utente finale. Pertanto, l'uso di miscele di reazione liofilizzato è stato testato per permettere la conservazione a lungo termine. È stato dimostrato che Taq polimerasi
potrebbe essere protetta contro la degradazione e perdita di inattività se conservato a 4 ° C, mentre una modesta attività era evidente quando conservato a temperatura ambiente per quattro mesi. Sulla base di questi risultati la miscela di reazione è adatto per la conservazione in frigorifero convenzionali.
Tuttavia, studi a lungo termine per esaminare la durata delle miscele di reazione sono attualmente in corso per vedere se Taq
è danneggiato dopo un lungo periodo di tempo dopo il processo di disidratazione.
il sistema ottico per il rilevamento della fluorescenza è stato integrato sul dispositivo, rivelando il problema della formazione di bolle all'interno del campione durante la PCR. Miscela PCR degasaggio, contenuti glicerolo superiore e idrofobicità cambiando come suggerito da Trung et al. Comprare e Jankowski et al.
[22, 23] sono state osservate non eliminare completamente questo problema e aberrazioni occasionali in corso di misure di fluorescenza . Retrofitting del sistema con un blocco di riscaldamento o ventilatore di aria calda nella parte superiore del chip di cavità più alte potrebbe aiutare a prevenire l'evaporazione e la successiva formazione di bolle.
In ulteriore sviluppo di questo dispositivo, un modulo di purificazione DNA on-chip sarà integrato nel chip e le reazioni multiplex con sonde fluorescenti sequenza-specifiche dovrebbero essere stabiliti in modo da evitare l'uso di coloranti intercalanti aspecifici. Inoltre, biomarker potrebbero essere attuate nella costruzione di chip, che contribuisce a caratterizzare e ottimizzare lo stato di salute dei pazienti.
In generale, un problema significativo per il trattamento e la prevenzione della parodontite è che, fino ad ora, domestico standard prodotti per la cura dentale, come spazzolini da denti e il filo interdentale non può eliminare completamente la formazione della placca batterica e prevenire il verificarsi della malattia [9]. Le misure terapeutiche per esempio chirurgia, l'estrazione dei denti e alla fine protesi sono un onere finanziario enorme per i pazienti o assicurazione dentale, se acquistato. Presi insieme, questo dimostra l'importanza di sviluppare un breve applicare, affidabile sistema point-of-care per la diagnosi e quantitativa delle infezioni parodontali per facilitare l'immediata attuazione del piano sanitario ottimale che è disponibile e per la fase diagnosticato della malattia. Socransky et al.
[10] ha mostrato 1998 a loro teoria complessa che ci sono colonizzatori tipici all'inizio e alla fine della progressione della malattia parodontale, che indica diverse manifestazioni della parodontite che richiedono rispettivo trattamento individualizzato.
Per conoscere la composizione microbica dei campioni sottogengivali dei pazienti, i dentisti di solito devono inviare campioni di placca ad un laboratorio clinico. La coltivazione, immunologica, o di analisi sonda di DNA e sistemi di test di recente più sensibili agli acidi nucleici basate, come il microIDent® (Hain Lifescience, Nehren, Germania) in grado di fornire informazioni per la terapia ottimale, ma ancora con la necessità e il costo della spedizione per laboratori [24 ].
il semplice modello di sistema, point-of-care qui presentate, che può essere facilmente applicato in ogni studio dentistico, riduce sia i tempi ei costi per la diagnostica ed elimina la necessità per il trasporto di laboratori esterni e facilita pertanto trattamenti veloci cruciali nel futuro. Inoltre, il chip può essere regolata e utilizzato per ulteriori applicazioni in aree mediche con un bisogno per il rilevamento e l'analisi di agenti patogeni, come quelli che causano la sepsi o pandemie regionali /globali veloce.
Disponibilità dei dati di supporto
I dati supplementari di file aggiuntive 1: Tabella S1, sui file 2: Tabella S2 e sui file 3: Tabella S3 sostenere i metodi ei risultati di questo articolo sono inclusi all'interno dei file aggiuntivi di Excel
Abbreviazioni
BSA:.
albumina di siero bovino
CP:
valico
PCR: reazione a catena della polimerasi
PC:
policarbonato
PEG:
Polietilenglicole
Dichiarazioni
Ringraziamenti
Questo progetto è stato sostenuto dal Ministero federale dell'economia e dell'energia (AIF-progetto KF2302705AK1). Inoltre ringraziamo il dottor David M. Smith per la critica costruttiva e la revisione del manoscritto
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aggiuntive. file
sui file 1: Tabella S1. Organismi e condizioni di coltivazione. (XLSX 11 kb) sui file 2: Tabella S2. sequenze primer e dimensioni del prodotto. (XLSX 12 kb) sui file 3: Tabella S3. punti di attraversamento (CP) corrispondente alla Fig. 5 (XLSX 10 kb) interessi concorrenti
Gli autori dichiarano di non avere interessi in gioco.
Contributi degli autori
CG redatto il manoscritto, effettuati esperimenti di liofilizzazione e PCR-on-a-chip con KN . LG ha contribuito ad analisi Southern Blot e JB, NL, LR sono stati coinvolti in esperimenti di PCR in tempo reale. CB ha aiutato con il montaggio del dispositivo e ha sviluppato il software per l'analisi PCR. KV e DK concepito il progetto, hanno partecipato alla progettazione e coordinamento. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.
