Abstract
sfondo
osso ricombinante morfogenetica proteine due (rhBMP2) è stato utilizzato per una varietà di applicazioni cliniche in chirurgia ortopedica e procedure dentali. Nonostante la sua diffusione, sono state sollevate preoccupazioni circa la sua breve emivita e bioattività transitoria in vivo. indagini recenti finalizzato allo sviluppo rhBMP2 sintetizzato da una catena polipeptidica più breve (108 amminoacidi) è stato intrapreso.
Metodi
Le proprietà osteopromotive di BMP2 sono state indagate sul comportamento delle cellule. Cinque concentrazioni di rhBMP2_108 compreso 10, 50, 100, 200 e 500 ng /ml sono stati confrontati con un rhBMP2 disponibile in commercio (100 ng /ml). Ognuna delle concentrazioni di lavoro di rhBMP2_108 sono stati esaminati sugli osteoblasti MC3T3-E1 per la loro capacità di indurre il reclutamento degli osteoblasti, la proliferazione e la differenziazione, come valutato dal fosfatasi (ALP) colorazione alcalina, alizarin colorazione rossa, e real-time PCR per i geni che codificano per ALP, osteocalcina (OCN), collagene-1 (Col-1) e Runx2.
risultati
I risultati dimostrano che tutte le concentrazioni di rhBMP2_108 migliorato significativamente il reclutamento delle cellule e la proliferazione degli osteoblasti a 5 giorni dopo la semina. Inoltre, rhBMP2_108 ha avuto gli effetti più pronunciati sulla differenziazione degli osteoblasti. E 'stato trovato che rhBMP2_108 aveva oltre quattro volte significativo aumento di attività ALP a sette e 14 giorni post-semina e le concentrazioni che vanno da 50 a 200 ng /ml hanno dimostrato gli effetti più pronunciati. Analisi di real-time PCR per i geni che codificano per ALP, OCN, COL-1 e Runx2 ulteriormente confermato aumenti della dose-dipendente a 14 giorni post-semina. Inoltre, alizarin colorazione rosso ha dimostrato una concentrazione aumento dipendente in colorazione a 14 giorni.
Conclusione
I risultati di questo studio dimostrano che questa catena polipeptide più corta di rhBMP2_108 è altrettanto bioattivi come disponibile in commercio rhBMP2 per l'assunzione di progenitore cellule, facilitando la loro differenziazione verso la stirpe degli osteoblasti. Il futuro dello studio in vivo sono necessari per indagare la sua bioattività.
Parole
BMP2 osteoinduttività Osteoinduzione Osteoblasti differenziazione guidata rigenerazione ossea Sfondo
L'uso di fattori di crescita e biomateriali con proprietà che inducono osso ha svolto un ruolo fondamentale nel opzioni di trattamento per pazienti affetti da una varietà di difetti ossei causati da una frattura o malattia [1-3]. L'osteoporosi, una malattia caratterizzata da una bassa densità minerale e la conseguente fragilità [4] ha ormai raggiunto una stima di 200 milioni di persone in tutto il mondo con il 80% di essere donne in post-menopausa [5-7]. Il significativo aumento delle malattie metaboliche dell'osso in combinazione con lesioni traumatiche causate da infortuni sportivi, incidenti automobilistici e altre fratture correlate richiede agenti ossa indurre in grado di accelerare la rigenerazione ossea, spesso in scenari compromessi come fratture osteoporotiche correlate [8-11].
Un fattore di crescita che è stato ampiamente utilizzato con l'approvazione della FDA è quella di proteine morfogenetiche dell'osso (BMP) [12-14]. BMPs stati inizialmente estratto dalla matrice ossea demineralizzata ed è stato rivelato che queste proteine a basso peso molecolare hanno dimostrato la capacità di formare ectopica in siti extra scheletrico negli animali [15, 16]. Da allora, BMP sono stati in grado di rigenerare una moltitudine di difetti ossei e hanno dimostrato di migliorare il reclutamento delle cellule, la proliferazione e la differenziazione delle cellule mesenchimali, e accelerare la loro differenziazione verso la formazione di osso osteoblasti [17]. Nonostante i vantaggi clinici di proteine ricombinanti, sono state sollevate preoccupazioni per quanto riguarda le loro attività biologica transitoria, l'instabilità delle proteine, i tassi di dissoluzione e veloce brevi dimezzamento [18]. Per tali motivi, l'uso di rhBMPs sono tipicamente somministrato in dosi elevate sovra-fisiologico che sopportano il rischio di effetti collaterali potenziali associati al loro uso [19]. Inoltre, altri fattori che potrebbero portare ad una ridotta bioattività vivo includono il ruolo di antagonisti e loro specificità per differenti BMPs (zucca, chordin, dan), il ruolo dell'organismo ospite per l'espressione (E.coli vs CHO) e la differenze associati a modelli di glicosilazione che potrebbero portare a differenze di biodisponibilità e la stabilità [20-22].
Recentemente lo sviluppo di una nuova proteina ricombinante fabbricato da una catena polipeptidica più breve BMP2 è stata intrapresa con l'obiettivo di migliorare la stabilità della proteina in vivo. Questa catena proteica più breve è ipotizzato per facilitare ripiegamento delle proteine, potenzialmente migliorando così la bioattività di rhBMP2 aumentando l'emivita della proteina [23]. Tuttavia, prima della sperimentazione animale, una caratterizzazione completa di questo breve sequenza aminoacidica è stato indagato sul comportamento cellulare in vitro. MC3T3-E1 pre-osteoblasti sono stati studiati per la loro risposta a cinque diverse concentrazioni di rhBMP2_108 compreso 10, 50, 100, 200 e 500 ng /ml e rispetto ai controlli disponibili in commercio rhBMP2 ad una concentrazione di 100 ng /ml (R & amp; sistemi D ). rhBMP2_108 è stato testato per la sua capacità di indurre il reclutamento delle cellule, la proliferazione cellulare, l'attività della fosfatasi alcalina, alizarin colorazione rosso così come i livelli di mRNA per i geni che codificano per la fosfatasi alcalina, osteocalcina, collagene e una Runx2 come valutato mediante real-time PCR.
Metodi
rhBMP2_108 sequenza aminoacidica
rhBMP2_108 è stato gentilmente fornito da Jiuyuan società biotech (Hangzhou, Cina). La sequenza aminoacidica abbreviato è stato fabbricato come segue: MKKLKSSCKRHPLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGECPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNSVNSKIPKACCVPTELSAISMLYLDENEKVVLKNYQDMVVEGCGCR per una catena proteica di 108 amminoacidi. Il BMP2 disponibile in commercio è stata acquistata dalla R & amp;. Sistemi D (Minneapolis, USA): Preparazione di BMP2
Secondo la sequenza di aminoacidi, espressione intracellulare di rhBMP2_108 in E. coli è stato costruito per la produzione di massa di rhBMP2_108 come precedentemente descritto [24]. In breve, la sequenza di BMP2 è stato progettato in base alla sua sequenza di amminoacidi, e quindi è stato trascrizione inversa con trascrittasi inversa (Gibco BRL, NY, USA) come descritto in precedenza [24]. reazione a catena della polimerasi (PCR) è stato utilizzato per amplificare il cDNA codificante la proteina rhBMP2_108 accorciato sequenza aminoacidica. Questo rhBMP2_108 cDNA è stato poi subclonato usando un vettore pRSET (A) (Invitrogen, UK) per ottenere il pRSET (A) /rhBMP2_108 vettore di espressione. Poi, pRSET (A) /rhBMP2_108 stato ulteriormente utilizzato per trasformare il ceppo di E. coli BL21 (DE3). Un bioreattore è stato poi utilizzato per produrre coltura ad alta densità cellulare di E. coli. Brevemente, trasformato E. coli è stato coltivato in 5 L fermentatore, con 3 L del mezzo definito (batch di coltura; estratto di lievito 1 g /L, peptone 2 g /L) inoculato con il pre-coltura (10% del lotto volume di cultura). La coltivazione è stata effettuata con agitazione a 250 rpm per 48 ore a 30 ° C, compresa l'aggiunta di un mezzo nutriente (glucosio 33,3 g /L, peptone 10 g /L, estratto di lievito 5 g /L, MgSO
41 g /L, FeSO 48,0 g /L, CaCl 20,048 g /L, ZnSO 40,0176 g /L, CuSO 40,008 g /L).
Il biomassa colta è stato poi raccolto da schiacciando due volte le cellule in una pressa francese e successivamente centrifugato. Il pellet è stato risospeso in 25 mg di peso umido /ml in tampone di sospensione (20 mMTris-HCl [pH 8,5], 0.5 mMEDTA, 2% [v /v] Triton X-100). I corpi di inclusione (granuli) sono state risospese in tampone di solubilizzazione (6Mguanidine-HCl, 0,1 M Tris-HCl [pH 8,5], 0.1 M DTT, 1 mM EDTA) e successivamente incubate con agitazione costante a temperatura ambiente per una notte. particelle insolubili sono stati poi rimossi dalla sospensione mediante centrifugazione.
Una colonna 6 a flusso veloce eparina Sepharose è stato poi utilizzato per purificare il rhBMP2_108 attiva (dimero). Un gradiente continuo di NaCl (0,1-1,5 M) è stato utilizzato per eluire le proteine. Successivamente, un gradiente di NaCl a gradini (0,15 M, 0,3 M e 0,5 M) è stato usato per eluire e separare la proteina rhBMP2_108 attiva. Successivamente rhBMP2_108 polvere è stato congelato a-20 ° C. Quando utilizzato, acido acetico 0,1% è stato utilizzato per sciogliere la polvere BMP2. Controllo rhBMP2 è stato acquistato da R & amp; sistemi di D (Minneapolis, USA) derivate da cellule CHO.
saggio bidimensionale migrazione
MC3T3-E1 linea di cellule pre-osteoblasti è stato utilizzato per questo studio. Non ci sono campioni umani o animali sono stati utilizzati e, quindi, è stato necessario un consenso etico. Il saggio migrazione delle cellule è stata eseguita con una camera Transwell utilizzando un 24-pozzetti e policarbonato filtri (Transwell Costar, Corning, Acton, MA), con una dimensione dei pori di 8 micron come descritto in precedenza [25]. 10 4 celle MC3T3-E1 in 50 microlitri DMEM sono state seminate nel vano superiore. rhBMP2_108 a concentrazioni di 0, 10, 50, 100, 200 e 500 ng /ml rhBMP2 e controllo a 100 ng /ml sono state seminate nel vano inferiore. Le cellule sono state autorizzate a migrare per 24 ore a 37 ° C in un umidificata al 5% CO 2 atmosfere. Il filtro è stato poi rimosso, le cellule sono state fissate in formaldeide al 4% per 20 minuti e lavato in PBS, dopo lavaggi, filtri sono stati incubati per 15 minuti a temperatura ambiente con Methylrosanilnium Chloride Solution (Wuhan Google biotecnologia Co G1014), allora i filtri erano lavate con PBS per 10 min. I campioni sono stati esaminati al microscopio. Le cellule non migrate sul lato superiore sono stati eliminati risciacquando il filtro con PBS freddo e raschiando con un tergicristallo in gomma. I restanti cellule migrate sul lato inferiore del filtro sono state contate in nove campi aleatori per filtro (× 100 ingrandimenti). Tutti i campioni sono stati eseguiti in triplicato con 3 esperimenti indipendenti eseguiti. Saggio
proliferazione
per studiare l'effetto del rhBMP2_108 sulla proliferazione di MC3T3-E1, CCK-8 test per ogni gruppo è stata eseguita come descritto in precedenza [26]. Brevemente, le cellule sono state seminate in piastre da 96 pozzetti ad una densità di 5 × 10 3 cellule /pozzetto. A intervalli di tempo 1, 3 e 5 giorni, il saggio CCK-8 è stata eseguita aggiungendo 10 ml di soluzione di CCK-8 (Dojindo Molecular Technologies, Inc. Giappone) a ciascun pozzetto e incubando per 1,5 h secondo il protocollo del produttore. L'assorbanza è stata misurata a λ = 450 nm su un lettore di piastre. I risultati sono stati dimostrati come l'assorbanza di ciascun pozzetto sperimentale meno il valore di densità ottica dei pozzi vuoti. Tutti i campioni sono stati ripetuti in triplicato con tre esperimenti indipendenti.
Dell'attività della fosfatasi alcalina
alcalina fosfatasi è stato analizzato colorimetricamente utilizzando il kit test della fosfatasi alcalina (Nanjing Jiancheng Bioingegneria Istituto) utilizzando una densità di semina iniziale di 50'000 cellule per 24 bene piatto come precedentemente descritto [27, 28]. Al punto di tempo di sette e 14 giorni, le cellule sono state lavate tre volte con PBS e solubilizzati in 0,1% Triton X-100 (bufferizzati in 0,1 mol /L PBS, pH 7,3) a 4 ° C per 1 h. Dopo sonicazione e centrifugazione, l'attività ALP nel surnatante è stato determinato colorimetricamente impiegando letture OD405 /OD562. proteine totali è stato quantificato da BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific Inc.). L'attività ALP è stata normalizzata al proteine totali. I campioni sono stati eseguiti in triplicato con tre esperimenti indipendenti effettuati. Real-time PCR
cellule MC3T3-E1 sono state seminate ad una densità di 2 × 10 5 e coltivate per 14 giorni come precedentemente descritto [26, 28 , 29]. Gli effetti della rhBMP2_108 a varie concentrazioni sono state indagate su quattro espressione del gene osteogenico legate tra cui fosfatasi alcalina (ALP), collagene I (COL I), runt legati fattore di trascrizione di due (Runx 2) e osteocalcina (OCN). L'RNA totale è stato estratto dalle cellule MC3T3-E1 di Trizol reagente (Tripure isolamento reagenti, Roche Applied Science, Germania) secondo le istruzioni del produttore. La concentrazione e la qualità dei campioni di RNA totale è stato analizzato da NanoDrop (Thermo Fisher Scientific Inc.). DNA complementare è stato sintetizzato da 2 mg di RNA totale utilizzando kit RevertAidTm First Strand cDNA Synthesis (Fermentas) seguendo il protocollo del produttore. RT-qPCR è stata eseguita in 20 reazioni microlitri contenente 10 ml SYBR Green Master Mix (Roche Applied Science, Germania), 0,6 ml (10 micron) di ogni avanti e primer reverse per ogni gene di interesse, 2 l di cDNA e 6,8 ml acqua. Le sequenze dei primer (mostrati in Tabella 1) sono progettati specificamente in base al riferimento. Gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH), un gene di riferimento, è stato usato come controllo. La reazione è stata analizzata utilizzando un ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems), e l'amplificazione PCR corsa per 40 cicli. Per convalidare specifica amplificazione amplicon senza contaminazione di DNA genomico, analisi della curva di fusione è stata eseguita e il singolo apice è apparso intorno alla temperatura di ricottura. livelli di espressione relativi di ciascun gene desiderato sono stati normalizzati rispetto al valore Ct di GAPDH e determinato utilizzando il metodo Ct delta. Tutti i campioni sono stati determinati in triplicato per tre studies.Table 1 sequenze primer indipendenti per marcatori di differenziazione degli osteoblasti
GAPDH F
GTGAAGGTCGGTGTGAACGG
GAPDH R
TCCTGGAAGATGGTGATGGG
OPN F
GAGGAAACCAGCCAAGGTAAG
OPN R
AAAGCAAATCACTGCCAATCTC
OCN F
GAGGACCATCTTTCTGCTCACT
OCN R
CGGAGTCTGTTCACTACCTTATTG
ALP F
TGTGGAATACGAACTGGATGAG
ALP R
ATAGTGGGAATGCTTGTGTCTG
RUNX2 F
GTGTTCCCTACTCAGCCGTC
RUNX2 R
GAGGCCTCGGTCCACATTAG
alizarina rosso quantificazione
alizarina colorazione rossa è stata eseguita per determinare la presenza di mineralizzazione della matrice extracellulare dopo 14 giorni. cellule MC3T3-E1 sono state seminate ad una densità di 50.000 cellule per 24 e piastra di coltura contenenti varie concentrazioni di rhBMP2_108. Dopo 14 giorni, le cellule sono state fissate in 96% di etanolo per 15 min e colorati con 2% di alizarina rosso soluzione in acqua (pH 4.2) a temperatura ambiente per 1 ora e visualizzati al microscopio ottico. Successivamente, alizarin quantificazione rosso è stato sciolto con 200 ml di cloruro di cetilpiridinio 1% (disciolto con acqua bidistillata) a temperatura ambiente per 4 ore. Poi 100 ml soluzione è stato trasferito a piastra a 96 pozzetti al testo OD 560.
Analisi statistica
Tutte le analisi dei dati è stata effettuata utilizzando il software GraphPad Prism6.0. Distribuzione normale dei dati campione è stato assunto per lo studio in corso e quindi il test parametrico è stato analizzato utilizzando una via ANOVA e statisticamente valori significativi sono stati adottati come p
& lt; 0.05. Medio e l'errore standard (SE) sono stati analizzati con ANOVA con un test post hoc con l'analisi di Tukey.
Risultati
Effetto della rhBMP2_108 sul reclutamento di cellule
Al fine di studiare gli effetti del rhBMP2_108 sul reclutamento delle cellule , una camera transwell è stato utilizzato in cinque diverse concentrazioni di rhBMP2_108 (Fig. 1). Si è constatato che dopo un periodo di 24 ore, tutte le concentrazioni di rhBMP2_108 e rhBMP2 controllo erano in grado di aumentare significativamente il reclutamento cellulare delle cellule MC3T3-E1 rispetto ai campioni di controllo. è stata osservata una scarsa variabilità tra i campioni dimostrando un forte potenziale di tutte le concentrazioni di rhBMP2_108 per indurre il reclutamento delle cellule (Fig. 1). Figura. 1 test di reclutamento cellulare ha dimostrato che tutte le concentrazioni di rhBMP2_108 erano significativamente in grado di migliorare il reclutamento delle cellule MC3T3-E1 rispetto ai campioni di controllo senza rhBMP2 (Scala bar = 100 micron). Tutti gli esperimenti sono stati condotti in triplicato con tre esperimenti indipendenti (n
= 9). I dati rappresentano mezzi +/- SEM. ** Denota tutti i campioni significativamente più elevati rispetto ai campioni di controllo, p
& lt; 0.01)
Effetto della rhBMP2 sulla proliferazione delle cellule
L'effetto di rhBMP2_108 è stato studiato in cinque concentrazioni e controllo rhBMP2 per la loro capacità di stimolare la proliferazione cellulare in vitro (Fig. 2). Si è constatato che le cellule MC3T3-E1 dimostrato molto simile numero di cellulare 1 giorno post-semina a prescindere dalla coltura cellulare multimediale concentrazione di rhBMP2_108 (Fig. 2). Un leggero aumento del numero di cellule è stata osservata a 3 giorni, tuttavia, nessuna differenza significativa è stata osservata tra le varie modalità di trattamento (Fig. 2). Entro il 5 giorni dopo la semina, un aumento significativo del numero di cellule è stata osservata per le cellule MC3T3-E1 con tutte le concentrazioni di rhBMP2_108 utilizzati in questo studio (Fig. 2). È interessante notare, non vantaggi potrebbero essere trovate per maggiori concentrazioni di rhBMP2_108 rispetto alle loro controparti inferiori (Fig. 2). Figura. 2 Numero cellulare calcolato mediante saggio CCK-8 per cellule MC3T3-E1 seminate a varie concentrazioni di rhBMP2_108 rispetto ai controlli plastica coltura tissutale (Tutti gli esperimenti sono stati condotti in triplicato con tre esperimenti indipendenti (n
= 9). Dati rappresenta mezzi +/- SEM # denota campioni di controllo significativamente inferiori rispetto a tutte le altre modalità di trattamento, p
. & lt; 0,05)
effetto della rhBMP2 sulla differenziazione delle cellule
RhBMP2_108 è stato poi valutato per la sua capacità di accelerare osteoblasti differenziazione a varie concentrazioni (Fig. 3, Fig. 4, Fig. 5, Fig. 6). In primo luogo si è riscontrato che rhBMP2_108 stata in grado di aumentare in modo significativo l'attività ALP a sette e 14 giorni dopo la semina per tutte le concentrazioni di rhBMP2_108 (Fig. 3). È interessante notare, è stato osservato a 7 giorni che l'attività ALP era significativamente superiore a concentrazioni rhBMP2_108 di 50, 100 e 200 ng /ml rispetto ai campioni di controllo (Fig. 3). A 14 giorni, tutte le modalità di trattamento che ricevono rhBMP2_108 a varie concentrazioni dimostrato un aumento di 16 volte marcata attività ALP rispetto ai campioni di controllo privo di rhBMP2_108 (Fig. 3). Figura. Attività 3 ALP è stata significativamente aumentata in sette e 14 giorni dopo la semina per i campioni seminati con rhBMP2_108 rispetto ai controlli plastica coltura dei tessuti da solo (Tutti gli esperimenti sono stati condotti in triplicato con tre esperimenti indipendenti (n
= 9). I dati rappresentano mezzi + . /- SEM * indica una differenza significativa tra 500 ng /ml e 10 ng /ml rhBMP2, p
& lt; 0,05; ** indica significativamente più alto rispetto a tutte le altre modalità, p
& lt; 0,05, # denota campioni di controllo significativamente più basso di tutte le altre modalità di trattamento, p
& lt; 0,05)
Fig. 4 livelli di mRNA di (a) ALP, (b) OCN, (c) COL-1 e (d) Runx2 per celle MC3T3-E1 seminate a varie concentrazioni di rhBMP2_108 (Tutti gli esperimenti sono stati condotti in triplicato con tre esperimenti indipendenti (n < . br> = 9) dei dati rappresenta mezzi +/- SEM * denota p
. & lt; 0,05; ** indica significativamente più alto rispetto a tutte le altre modalità, p
& lt; 0,05, # denota campioni di controllo significativamente più bassi di tutti altre modalità di trattamento, p
& lt; 0,05)
Fig. 5 Analisi qualitativa delle alizarin colorazione rosso dimostrato un incremento di mineralizzazione per le cellule MC3T3-E1 a concentrazioni crescenti di rhBMP2_108 a 14 giorni dopo la semina
Fig. 6 Analisi quantitativa di alizarin colorazione rossa. rhBMP2_108 dimostrano una concentrazione aumento dipendente alizarin colorazione rosso (Tutti gli esperimenti sono stati condotti in triplicato con tre esperimenti indipendenti (n
= 9). I dati rappresentano mezzi +/- SEM. * indica una differenza significativa tra i due gruppi, p
& lt; 0,05; ** indica significativamente più alto rispetto a tutte le altre modalità, p
& lt; 0,05, # denota campioni di controllo significativamente più basso di tutte le altre modalità di trattamento, p
& lt; 0,05)
Poi cellule MC3T3-E1 sono stati valutati per i livelli di mRNA di real-time PCR per i geni che codificano per ALP, OCN, COL-1 e Runx2 a varie concentrazioni di rhBMP2_108 (Fig. 4). Per gene codifica Runx2, fino a un aumento di cinque volte è stato osservato ad una concentrazione di 500 ng /ml rispetto ai campioni di controllo con un significativo aumento a 100 e 200 ng /ml rispetto alle concentrazioni inferiori (Fig. 4a). Allo stesso modo, COL-1 ha dimostrato anche la concentrazione aumento dipendente dell'espressione genica (Fig. 4b). Qui però, solo fino a un aumento di due volte è stato osservato rispetto ai controlli campioni (Fig. 4b). È stato osservato che i livelli di mRNA di ALP erano oltre cinque volte maggiore a 14 giorni a concentrazioni di dieci e 50 ng /ml rhBMP2_108 che ad una concentrazione di 100 e 200 ng /ml 20 volte maggiore attività ALP (Fig. 4c). La più alta concentrazione di 500 ng /ml ha dimostrato un aumento del 40 volte l'attività ALP rispetto ai terreni di coltura senza rhBMP2 (Fig. 4c). Il più grande cambiamento volte è stato osservato nei livelli OCN dove fino a un aumento di piegatura 300 è stato osservato rispetto al rispettivo controllo senza rhBMP2 (Fig. 4d).
Infine, alizarin colorazione rossa è stato usato per visualizzare in vitro mineralizzazione (Fig. 5). È stato osservato che, senza rhBMP2, MC3T3-E1 pre-osteoblasti erano in grado di generare alcun mineralizzazione visiva come osservato da Alizarina colorazione rossa (Fig. 5). Gli effetti di rhBMP2_108 dimostrato una significativa concentrazione aumento dipendente in alizarin colorazione rosso a 14 giorni dopo la semina (Fig. 6).
Discussione
Lo scopo di questo studio è stato quello di indagare la bioattività di un BMP2 ricombinante più breve (rhBMP2_108 ) sequenza sul comportamento degli osteoblasti. L'uso di rhBMP2 per trattamenti ortopedici e dentali è stato utilizzato per un certo numero di procedure tra fratture aperte, chirurgia ricostruttiva dell'anca nonché procedure rigenerazione ossea guidata in odontoiatria [30-33]. Nonostante dimostrando promettente nei risultati in vivo, l'uso del fattore di crescita ha avuto un mix di successo quando utilizzato per uso clinico. Alcune delle principali preoccupazioni sollevate in relazione all'utilizzo del fattore di crescita è la loro bioattività transitorio che è stato suggerito il possibile per essere nell'ordine di minuti per ore [18].
Ci sono tre aree principali di ricerca volti a migliorare la bioattività di fattori di crescita; 1) utilizzando la terapia genica, 2) migliorare la stabilità della proteina o 3) migliorare il sistema del fattore di crescita di consegna. Un metodo che ha dimostrato promessa iniziale per la consegna fattore di crescita è quello della terapia genica in cui l'uso di vettori virali come adenovirus può aggirare molte delle limitazioni della consegna proteine esibendo un'elevata efficienza vivo trasduzione con un periodo relativamente breve espressione [34 -38]. Il loro vantaggio principale è la proteina sovraespressa è costruito all'interno della cella principale organismi e quindi ha accesso ad una moltitudine di piegatura proteine in grado di confezionare in modo accurato e fornire fattori di crescita per i loro tessuti circostanti [25, 39, 40]. Nonostante i progressi fatti in questo settore di ricerca, l'uso della terapia genica è ancora vietato dalla FDA facendo il suo futuro impiego clinico al momento un futuro approccio ottimistico con un calendario nota per il suo utilizzo eventuale. Inoltre, è stato dimostrato strategie recenti che utilizzano brevi peptidi BMP2-mimando sintetici per facilitare la rigenerazione ossea [41-44], tuttavia la mancanza di rapporti clinici che utilizzano tali strategie è ancora carente.
Così diventa di vitale importanza per trovare metodi alternativi che possono essere considerato adatto per miglioramenti nel fattore di crescita bioattività. Nel presente studio, una versione ricombinante romanzo BMP2 (rhBMP2_108) con una sequenza aminoacidica più breve. Prima della sperimentazione animale però, i test in vitro è stata eseguita su attività delle cellule. E 'stato trovato nel presente studio che r rhBMP2_108 primo luogo è stato in grado di indirizzare il reclutamento di cellule progenitrici, favorendo precoce e rapida reclutamento di cellule entro 24 ore (Fig. 1). Il homing delle cellule progenitrici e cellule staminali è una delle fasi iniziali chiave del precoce insorgenza di riparazione della frattura ed è una componente necessaria di guarigione delle ferite della ossee-difetti. Come tale, la possibilità per rhBMP2_108 per accelerare la velocità e il numero di cellule progenitrici di siti difetti è cruciale per la riparazione ossea.
Sebbene gli effetti come visto nel presente studio hanno dimostrato che rhBMP2_108 era significativamente grado di indurre la proliferazione cellulare, non è stata osservata in un modo dipendente dalla concentrazione. Questo può essere dovuto al fatto che le cellule subiscono differenziazione cellulare non sono inclini a proliferare simultaneamente. Anche se non molto di concentramento osservazioni dipendenti sono stati trovati per il reclutamento di cellule o la proliferazione, differenze significative sono state trovate per la differenziazione degli osteoblasti in risposta a rhBMP2_108. È stato osservato che nel corso di quattro volte maggiore attività ALP sono stati rilevati con rhBMP2_108 e in seguito in concentrazione aumenta dipendenti in alizarina colorazione rossa ulteriormente convalidato nostra ipotesi che rhBMP2_108 agisce principalmente stimolando la differenziazione degli osteoblasti. È stato inoltre osservato che un significativo aumento dei livelli di mRNA di ALP è stata osservata in un modo dipendente dalla concentrazione. È interessante notare che OCN, un indicatore in ritardo di differenziazione per osteoblasti è upregulated circa 300 volte rispetto ai campioni di controllo (Fig. 4b). Questa scoperta probabilmente significa che le MC3T3-E1 pre-osteoblasti seminate in pozzetti di controllo senza rhBMP2 probabile rimasto cellule progenitrici e non differenziare verso lineage osteoblastica nel corso di questi esperimenti. Questo è anche evidente dal fatto che i campioni senza rhBMP2 mostrato alcun potenziale mineralizzazione negli esperimenti rosso alizarina (Fig. 5).
Sebbene i risultati di questo studio confermano gli effetti di questa breve sequenza aminoacidica rhBMP2_108 sulla cella attività, rimane necessaria molta ricerca al fine di convalidare questi risultati in un modello animale prima della prova clinica. Rimane praticamente sconosciuto se l'attività della proteina sarà influenzato in vivo dalla sequenza aminoacidica accorciato e molte ricerche future indagare questo rapporto sia rispetto alla proteina durata emivita così come i suoi conseguenti effetti sulla formazione ossea devono essere attentamente valutata. Inoltre, il confronto a condurre rhBMP2 attualmente disponibili sul mercato con approvazione della FDA è anche necessario fornire una migliore comprensione degli effetti di largo acido proteine amino sulla bioattività delle proteine ricombinanti.
Conclusione
I risultati dello studio dimostrano che una breve sequenza aminoacidica di BMP2 ricombinante (rhBMP2_108) mantiene le proprietà bioattive di BMP2 rispetto ad disponibili commercialmente rhBMP2 in vitro. E 'stato dimostrato che rhBMP2_108 è stato in grado di stimolare il reclutamento delle cellule rapido MC3T3-E1 pre-osteoblasti e sostenere la loro differenziazione verso il lignaggio degli osteoblasti in un modo dipendente dalla concentrazione. Future nella ricerca vivo analizzare l'uso di questa sequenza aminoacidica di rhBMP2_108 è ora necessario in difetti ossei criticamente dimensioni. Inoltre, l'indagine sul sistema di erogazione ottimale di questo fattore di crescita sono necessarie per potenzialmente migliorare ulteriormente la sua bioattività per uso clinico
Abbreviazioni
rhBMP2:.
Ricombinante proteina ossea morfogenetica 2
rhBMP2_108: catena polypetitde
corta di 108 amminoacidi delle proteine morfogenetiche ossee ricombinante due
ALP:
fosfatasi alcalina
OCN:
osteocalcina
COL-1:
collagene 1
Runx2:
runt- correlate fattore di trascrizione due
GAPDH:
gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi
FDA:
Food and Drug Administration
cHO:
ovariche di criceto cinese
PCR:
reazione a catena della polimerasi
PBS :
fosfato soluzione tamponata
HCl: acido cloridrico
EDTA:
acido etilendiamminotetraacetico
NaCl: cloruro di sodio
DMEM:
medio aquila Dulbecco modificato
BCA:
L'acido bicinconinico
OD:
pptical densità
SE:
errore standard
Dichiarazione
Ringraziamenti
Questo progetto è stato sostenuto dal Programma per New Century talenti eccellenti in University (NCET-11-0414), eccellente Youth Foundation di Hubei ed i fondi della National Science Foundation naturale della Cina (81271108). Articolo
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