Abstract
sfondo
In studi recenti, la salute parodontale è stato collegato al sovrappeso e /o obesi. Tra i batteri orali comuni, Selenomonas noxia
è stato implicato nella conversione di salute parodontale alla malattia, e Selenomonas
specie sono stati trovati anche in ulcere gastriche. L'obiettivo di questo studio è stato quello di sviluppare e convalidare una reazione a catena della polimerasi quantitativa saggio (qPCR) per la rilevazione specifica e rapida di S. noxia
. Metodi
Due coppie di oligonucleotidi primer e una sonda sono stati progettati e collaudato per determinare l'amplificazione del segnale ottimale con tre ceppi di S. noxia
. La PCR è stato testato contro quattordici organismi non bersaglio, tra cui Selenomonads orali strettamente correlate, un batterio filogeneticamente strettamente legato, e due comunemente isolati batteri orali.
Risultati
Uno dei set di primer era più sensibile a rilevare il bersaglio organismo ed è stato selezionato per esperimenti di ottimizzazione e convalida. I primer disegnati e sonda amplificati l'organismo bersaglio con il 100% di specificità. inibizione della PCR è stata osservata con un controllo interno positivo, e l'inibizione è stata risolta diluendo l'estratto di DNA.
Conclusioni
Il saggio qPCR progettato in questo studio può essere utilizzato per rilevare specificamente S. noxia
in ambito clinico e in future ricerche che coinvolgono la rilevazione avanzata di S. noxia
. Il test può essere utilizzato anche in studi epidemiologici per comprendere il ruolo di S. noxia
in processi patologici tra cui, ma non limitato a, la salute orale e l'obesità di origine infettiva.
Parole chiave
Batteri salute parodontale e la malattia Selenomonas noxia
PCR Sfondo
Il genere Selenomonas
è stato descritto nel 1683 da Antony Van Leeuwenhoek come un batterio a forma di mezzaluna da un campione orale [1]. Selenomonas noxia
è un batterio che colonizza la cavità orale umana, ed è stata più volte associata a malattia parodontale [2-4]. Questa specie è composta da anaerobica obbligatoriamente da, mobili, non sporigeni, bastoncini Gram negativi [5]. S. noxia
è stato tra i cinque nuove specie del genere Selenomonas
, Phylum Firmicutes, caratterizzato per la prima volta da Moore et al
. nel 1987 [5]. Le malattie parodontali sono probabilmente una delle più comuni infezioni batteriche nell'uomo. Solo alcune delle diverse centinaia di specie di microrganismi che sono stati identificati all'interno della fessura della gengiva e la tasca parodontale si pensa di svolgere un ruolo significativo nella iniziazione e la progressione della malattia [6], e S. noxia
è stato tra i nuovi organismi aggiunti come patogeno parodontale putativo [7]. Molto poco letteratura è disponibile sulla patogenicità di S. noxia
, ma del genere Selenomonas
è stato trovato in proporzioni superiori rispetto ad altri batteri orali nei casi di parodontite aggressiva generalizzata (GAP). Inoltre, S. noxia
è stato rilevato con la cultura e le tecniche di entrambi i parodontite cronica (CP) e GAP lesioni basato sul DNA [8, 9]. In uno studio condotto da Kumar et al.
[10], i campioni associate alla malattia sono stati raccolti dai quattro siti più profonde in soggetti con parodontite stabilito, e le più numerose specie di 16S analisi clonale appartenevano ai generi Selenomonas
, Streptococcus
, Veillonella
, Campylobacter
, e Peptostreptococcus
. Mentre Selenomonas
cloni orali non sono stati associati con la malattia [8], altri studi hanno suggerito che S. noxia
è tra le specie principali connessi con i siti di conversione salute parodontale alla malattia parodontale [3, 11]. Inoltre, in un recente rapporto di Andersen et al.
[12], un Helicobacter
-Come Organismo (HLO) nella sezione istologica da un'ulcera gastrica umana è risultato essere un Selenomonas
specie. La letteratura e gli studi condotti fino ad oggi non danno dati precisi sulla prevalenza complessiva di S. noxia
in individui sani.
Tecniche molecolari hanno fornito una buona base per identificare il ruolo di Selenomonas
specie salute parodontale indicatori [8, 13]. In uno studio con sonde oligonucleotidiche di targeting la maggior parte di tutti gli isolati per via orale per esplorare la distribuzione spaziale delle Selenomonas
specie in biofilm subgengivale, una relativamente bassa prevalenza di Selenomonas
è stato dimostrato in pazienti in CP e GAP. Tuttavia, una fluorescenza in situ
ibridazione (FISH) analisi degli stessi biofilm mostrato che Selenomonas
fatto un contributo al organizzazione strutturale dei biofilm [9].
Oltre al ruolo di S . noxia
in salute orale, uno studio condotto da Goodson et al.
[14] implica che S. noxia
possono essere associati con l'obesità. Lo studio ha dimostrato che il 98,4% degli individui in sovrappeso è stato identificato correttamente dalla presenza del singolo batterio, S. noxia
. Questa scoperta ha fornito un indizio per comprendere meglio l'associazione e /o la presenza di S. noxia
nella cavità orale e lo sviluppo di obesità. Recentemente, c'è stato un crescente interesse per la comprensione del rapporto tra la diversità microbica umana e l'essere in sovrappeso o obesi. Considerando la probabilità che la malattia periodontale può contribuire allo sviluppo di obesità, il ruolo del microbiome orale nell'obesità sta guadagnando più attenzione [14]. Il meccanismo con cui i batteri orali contribuiscono allo sviluppo di obesità è spiegato in almeno tre modi: aumentare l'efficienza del metabolismo, aumentando l'appetito, e /o riorientare il metabolismo energetico [14]
La crescente importanza clinica ed epidemiologica di S. noxia.
richiede lo sviluppo di un metodo di rilevazione rapida. Fino ad oggi, i metodi di rilevamento per S. noxia
sono stati limitati a prove di ibridazione della cultura e del DNA. analisi Cultura della Selenomonas
spp. Non è comune in laboratorio microbiologico clinico e può richiedere tempo, perché si tratta di una fastidiosa obbligatoriamente da batterio anaerobico. Con la tecnica di coltura anaerobica, la discrepanza tra recupero salivari e presenza sottogengivale è stato significativo, il che rende questo approccio non utilizzabili nella diagnosi microbiologica dei pazienti periodontite [15]. Utilizzando la reazione a catena della polimerasi (PCR) tecnica di rilevamento con specie specifici primer oligonucleotidi e sonde in grado di migliorare la rapida individuazione di S. noxia
. Il metodo PCR quantitativa (qPCR) combina PCR chimica con rilevamento sonda fluorescente del prodotto amplificato nello stesso recipiente di reazione, e si completa in due ore o meno. L'obiettivo di questo studio è stato quello di sviluppare e validare un test qPCR per la rilevazione specifica di S. noxia
. rilevamento avanzato di Selenomonas noxia
nella microflora orale è il primo passo per chiarire il suo coinvolgimento nella obesità e malattie umane.
Metodi
test organismi
tre diversi ceppi di S. noxia
sono stati ottenuti dalla American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) e utilizzato per valutare il protocollo PCR creazione (Tabella 1). Quattordici organismi non bersaglio, inclusi altri Selenomonads orali strettamente correlate, un batterio filogeneticamente strettamente legato, e due batteri orali comunemente,
sono stati ottenuti da ATCC e utilizzati per testare la specificità dei primer disegnati e sonda (Tabella 1). Tabella 1 organismi di prova
specie batteriche
ATCC #
Bacillus cereus
14579
Candida albicans
14053
Centipeda periodontii
35019
Klebsiella pneumoniae
4352
Lactobacillus acidophilus
3456
pectinatus cervisiiphilus
29359
Pseudomonas aeruginosa
27853
Selenomonas artemidis
43528
Selenomonas Dianae
43527
Selenomonas flueggei
43531
Selenomonas infelix
43532
Selenomonas noxia
43541
Selenomonas noxia
51893
Selenomonas noxia
700.225
Selenomonas sputigena
35185
Staphylococcus aureus
25923
Streptococcus mutans
25175
DNA estrazione
microbica DNA è stato estratto utilizzando il kit QIAamp® DNA Mini ( Qiagen, Valencia, CA) secondo le istruzioni del fabbricante, con le seguenti modifiche; 100 ml di volume del campione è stato utilizzato per l'estrazione e il volume di eluizione finale era di 200 microlitri. campioni selezionati sono stati estratti con il Kit di isolamento del DNA del suolo Ultraclean® (Mobio, Carlsbad, CA). Gli estratti di DNA sono stati conservati a -70 ° C fino al momento dell'uso.
La presenza e la quantità di DNA in ogni campione è stato misurato con uno spettrofotometro Spectronic ™ GENESYS 10 Bio UV-Visibile utilizzando il nanocellula accessorio-0,2 millimetri cammino ottico (Thermo Electron Corporation, Madison, WI) per analizzare campioni di sub-microlitro di DNA in soluzione. Il test è stato eseguito con 1,5 ml di campione, dopo essere azzerato con TRIS-EDTA (TE) tampone (pH 7,4). Modalità DNA /proteina concentrazione (assorbanza a 260 e 280 nm con 320 nm di correzione) è stato usato per la misurazione. Le concentrazioni di DNA a S. noxia
(ATCC 43541, ATCC 700.225, e ATCC 51893) erano tra 4,2 e 11,7 ng /ml. Le concentrazioni variavano 4,2-150,8 ng /ml nei campioni non bersaglio (dati non riportati). Le concentrazioni di modello del DNA utilizzate per la PCR varia, ma sono stati sufficienti per ottenere un risultato positivo in un test presenza /assenza, in base alla sensibilità del test (583 fg /reazione).
Primer e il design della sonda
La codifica nucleotide sequenza regione e intera sequenza del genoma dati di S. noxia
sono stati recuperati dal National center for Biotechnology Information, NCBI (http:.... //www NCBI nlm NIH gov /Genomi /) . l'assemblaggio della sequenza e l'allineamento sono stati confrontati in-silico
contro tutte le sequenze disponibili on-line con l'algoritmo di base locale Allineamento strumento di ricerca (BLAST, NCBI).
Il 16S RNA ribosomiale (1491 coppie di basi) di S. noxia
(ATCC 43541) è stato scelto per progettare primer e sonde specifiche confrontando regione V8 di questo gene (Tabella 2). Questa regione è altamente conservata tra i membri delle Selenomonas
genere, ma più variabile tra Selenomonas
specie. primer e sonde TaqMan® sono stati progettati e analizzati utilizzando il software Primer Express versione 3 (Life Technologies [Applied Biosystems], Foster City, CA). primer selezionati sono stati proiettati contro la formazione di strutture secondarie, tra cui la formazione di strutture a gomito, e di auto-e cross-dimeri. La lunghezza di fondo, la temperatura di fusione (T
m), il rapporto G-C e di altri fattori sono stati fissati come default sui Primer Express software.Table 2 allineamenti multipli di V8 regioni del gene 16S rRNA da Selenomonas
specie. Numerazione utilizzata secondo le Escherichia coli
16S rRNA gene [31]
Specie
ATCC #
regione V8 (bp 1268-1296)
S. noxia
43541
CAGAGGGCAGCGAGAGA-GTGATCTTAAGC
S. artemidis
43528
..... Un .........-. CCC.C..GGGC ....
S. flueggei
43531
....... Un .......- .. GC.C..G.CGG ...
S. infelix
43532
..... Un .........-. CCC.C..GGGC ....
S. sputigena
35185
..... Un ................-. C ..........
S. Dianae
43527
..... Un .........-. CCC.C .. GGGC ....
Due coppie di primer e una sonda sono stati selezionati per le prove; i) Primer Set 1: Forward SNF1 primer, TCTGGGCTACACACGTACTACAATG (25 bp) e Reverse primer SNR1, GCCTGCAATCCGAACTGAGA (20 bp), ii) Primer set 2: Forward SNF2 primer, GCATGTAAAGATGGGCACTCAA (22 bp) e Reverse primer SNR2, CCGAACTGAGAAACGGTTTTTG (22 bp); con lunghezze ampliconi rispettivamente di 97 e 175,. La sonda (SNP) selezionati per entrambi i set di primer è stato etichettato al 5'-end con il colorante reporter 6-carbossifluoresceina (FAM) e il 3'-end con il colorante reporter tetrametil-6-carboxyrhodamine (TAMRA), SnP, [ ,,,0],6 ~ FAM] CAGAGGGCAGCGAGAGAGTGATCTTAAGC [TAMRA]. I primer disegnati e sonda sono stati ottenuti da Eurofins MWG Operon (Huntsville, AL). Entrambi i set di primer sono stati testati con il DNA da due S. noxia
ceppi di riferimento (ATCC 43541 e 51893) per determinare il segnale di amplificazione ottimale.
Selezione Primer e l'ottimizzazione di PCR
nove combinazioni diverse, tra 0,2 micron e 0,9 micron, dei primer avanti e retromarcia e cinque diverse concentrazioni di sonda che vanno da 0,05 micron a 0,25 micron sono stati testati con il DNA (600 pg) da S. noxia
ceppo di riferimento ATCC 51893 per determinare il segnale di amplificazione ottimale. I parametri ciclismo PCR erano come segue: passo iniziale di incubazione di 50 ° C per 2 min, denaturazione del DNA stampo a 95 ° C per 10 min, seguiti da 40 cicli a 95 ° C per 15 sec e 60 ° C per 1 min . condizioni di PCR erano: master mix 1X TaqMan Universal PCR contenente AmpErase® UNG (uracile-N-glicosilasi), polimerasi AmpliTaq Gold DNA, trifosfati deossinucleosidici, passiva riferimento interno [ROX ™ colorante], e componenti del tampone ottimizzati (Applied Biosystems), primer ( SNF1 e SNR1or SNF2 e SNR2) ad una concentrazione finale di 0,9 micron, la sonda ad una concentrazione finale di 0,2 micron, e 5 ml di DNA stampo. Sterile acqua priva di nucleasi (Promega, Madison, WI) è stato utilizzato per regolare il volume di ogni reazione a 25 microlitri. Le analisi sono state effettuate in piastre da 96 pozzetti utilizzando un 7900HT veloce tempo reale strumento sistema PCR (Applied Biosystems) in modalità standard. I controlli negativi contenenti 5 ml di acqua priva di nucleasi invece di DNA sono stati inclusi in ogni seduta per rilevare eventuali DNA contaminazione incrociata. DNA estratto da S. noxia
servito come controllo positivo in ogni serie di PCR
controllo di amplificazione interno
Un TaqMan esogena interno controllo positivo disponibili in commercio. (IPC, Applied Biosystems) è stato utilizzato per rilevare l'inibizione della PCR. Il kit di reagenti inclusi 10 volte esogena IPC Primer and Probe (VIC ™ Probe) mix, 10X esogena IPC reagente di blocco, e 50X esogena IPC DNA. Il saggio qPCR stata ottimizzata per condizioni adatte per la rilevazione sia dell'organismo bersaglio ed il controllo positivo interno; quindi, assenza o diminuzione della amplificazione del DNA IPC in ciascuna reazione PCR multiplex indicavano la presenza di inibitori della PCR. Diverse diluizioni (vale a dire, 10 -1 a 10 -6) di ciascun campione di DNA sono stati testati, per determinare ed eliminare potenziali inibitori della PCR. Uno spettrofotometro con l'accessorio nanocellula stato usato come indicato sopra per dimostrare la presenza di DNA in campioni negativi non bersaglio PCR sono state effettuate
. Analisi dati
amplificazioni PCR Replicate (n = 4). Una volta che l'amplificazione è stata completata, i dati sono stati analizzati e tracciati (fluorescenza rispetto al numero ciclo) utilizzando il software fornito con lo strumento 7900HT PCR. Il livello di amplificazione è stato segnalato dal software come il valore di soglia media del ciclo (Ct) di campioni replicati. Ct si riferisce al ciclo di PCR in cui la fluorescenza (cioè, l'amplificazione del prodotto) viene dapprima rilevata, ed è inversamente proporzionale alla concentrazione iniziale DNA stampo. Un valore Ct di 40 non rappresenta un DNA bersaglio presente
. Risultati
primer e sonda di progettazione
risultati dalla proteina famiglia Sorter (PFS) utilizzando PATRIC ha mostrato 14 proteine uniche per S. noxia
, ma la proteine BLAST nessuno è riuscito a uscita affidabile per progettare il primer /sonda impostato in questa regione. Pertanto, i set di primer sono stati progettati utilizzando la sequenza 16S rRNA [GenBank: AF287799]. Entrambi i set di primer, fondo set 1 (SNF1, SNR1) e Primer set 2 (SNF2, SNR2) amplificato l'organismo bersaglio. set Primer 1 è stato trovato per produrre i bassi valori Ct, indicando che era più sensibile a rilevare l'organismo bersaglio (Tabella 3). Pertanto, questo set di primer è stato selezionato per l'ottimizzazione ulteriore e experiments.Table convalida 3 risultati PCR quantitativa per S. noxia
rilevamento
Microrganismo
Primer impostato
fattore di diluizione
100
10-1
10-2
medio ciclo soglia (Ct) il valore ± SE (N = 2)
S. noxia
(ATCC 43541)
1
11,68 (0,56)
14.99 (0.42 )
17.97 (0.02)
2
13.55 (0.95)
15.51 (1.12)
18.21 (0.16 )
S. noxia
(ATCC 51893)
1
9.39 (0.10)
13,56 (0,08)
16.91 (0.11)
2
11.66 (0.44)
13.35 (0,28)
17.23 (0.11)
PCR ottimizzazione
i nove diverse combinazioni di concentrazioni di primer testato prodotto di amplificazione del segnale ottimale in cinque delle nove combinazioni, compresa tra 19-20 valori Ct per il 0,2 micron /0,9 micron, 0,5 /0,5 micron, 0,5 /0,9 mM, 0,9 /0,5 mM, e 0,9 /0,9 pM avanti e retromarcia concentrazioni dei primer, rispettivamente (dati non mostrati). risultati di ottimizzazione Probe mostrato che tre dei cinque diverse concentrazioni (cioè, 0,15 mM, 0,2 mM, e 0,25 mM) ha prodotto i bassi valori Ct (& lt; 20) (dati non mostrati). Come raccomandato dal costruttore dello strumento e del software, 0,9 micron avanti e indietro le concentrazioni di primer, e 0,2 micron concentrazione della sonda sono stati selezionati per il test di specificità. Il limite di rilevazione inferiore del noxia
saggio Selenomonas PCR (utilizzando S. noxia
ATCC 51893 come l'organismo di prova) è stato 583 fg /reazione.
Specificità Test
l'amplificazione PCR quantitativa dell'organismo bersaglio utilizzando i primer e sonde, condizioni di reazione, e parametri bicicletta sopra descritti hanno determinato l'amplificazione del frammento di 97 bp previsto dalle tre S. noxia
ceppi testati (Tabella 4). Il non-bersaglio Selenomonas
spp. testato non amplificare i primer disegnati e sonda. Gli organismi non bersaglio rimanenti non sono stati amplificati con il test 16S qPCR sviluppato (tabella 4) test .table 4 Specificità del S. noxia
qPCR saggio
organismo di prova
ATCC #
PCR risultati
Bacillus cereus
14579
negativo
Candida albicans
14053
negativo
Centipeda periodontii
35019
negativo
Klebsiella pneumoniae
4352
negativo
Lactobacillus acidophilus
3456
negativo
pectinatus cervisiiphilus
29359
negativo
Pseudomonas aeruginosa
27853
negativo
Selenomonas artemidis
43528
negativo
Selenomonas Dianae
43527
negativo
Selenomonas flueggei
43531
negativo
Selenomonas infelix
43532
negativo
Selenomonas noxia
43541
positivo
Selenomonas noxia
51893
positivo
Selenomonas noxia
700.225
positivo
Selenomonas sputigena
35185
negativo
Staphylococcus aureus
25923
negativo
Streptococcus mutans
25175
negativo
PCR inibizione
il gene bersaglio è stato amplificato in tutte le concentrazioni di DNA testate da tre S. noxia
ceppi. Tuttavia, l'IPC PCR ha dimostrato la presenza di inibizione della PCR, e questi estratti del DNA ha reso necessaria la diluizione (10 -4 a 10 -5) per rimuovere gli inibitori (Tabella 5) risultati .table 5 PCR che mostrano l'inibizione a S . noxia
campioni
risultati
PCR (valori Ct)
campione
diluizione
Esempio
IPC
S. noxia
(ATCC 43541)
100
14.60
15.01
40.00
40.00
10-1
17.76
17.94
40.00
40.00
10-2
21.30
21.23
40.00
40.00
10-3
24.79
24.71
40.00
31.21
10-4
28.13
28.01
28.08
28.11
S. noxia
( ATCC 51893)
100
13.36
13.24
40.00
40.00
10-1
15.34
15.45
40.00
40.00
10-2
19.59
19,26
40.00
40.00
10-3
22.54
23.05
40.00
40.00
10-4
28.29
28.23
40.00
40.00
10-5
30.80
30.77
28.08
28.93
S. noxia
(ATCC 700.225)
100 |
20.90
20.00
40.00
40.00
10-1
ND1
ND1
ND1
ND1
10-2
22.92
23.00
40.00
40.00
10-3
26.68
26.48
40.00
40.00
10-4
29.95
30.11
28.53
28.22
10-5
33.53
33.53
27.73
28.06
No controllo modello
40.00
40.00
28.40
28.12
1 Non determinato
diluizioni (10 -1 a 10 -6) fosse necessario rimuovere gli inibitori di estratti di DNA non bersaglio (Tabella 6). In assenza di inibizione, l'IPC DNA (cioè, nessun controllo modello) amplificato con un valore medio Ct di 29,4 ± 0,3 (errore standard; S.E.). Era necessario diluire tutto il DNA campioni bersaglio e non bersaglio, per rimuovere gli inibitori. Tutti gli estratti di DNA non bersaglio ha prodotto risultati negativi (CT = 40) per la S. noxia
PCR anche quando inibitori della PCR erano state rimosse da diluizione del campione. Questi non bersaglio campioni negativi PCR contenevano DNA come dimostrato spettrofotometricamente con l'accessorio nanocellula (dati non riportati) .table 6 Dati mostrando diluizione alla quale l'inibizione è stata risolta (n = 2 per tutti i campioni, ad eccezione di quelli in grassetto che consisteva di quattro repliche)
risultati PCR (valore medio Ct)
Campione
diluizione
IPC
Bacillus cereus
1.00E + 00
40.00
1.00E-02
40.00
1.00E-04
40.00
1.00E-05
31.43
1.00E-06
29.48
Candida albicans
1.00E + 00
40.00
1.00E-01
30.76
Centipeda periodontii
1.00E + 00
40.00
1.00E-02
40.00
1.00E-03
40.00
1.00E-04
29.01
Klebsiella polmonite
1.00E + 00
40.00
1.00E-01
30.42
Lactobacillus acidophilus
1.00E + 00
40.00
1.00E-01
40.00
1.00E-02
40.00
1.00E-03
29.84
Pseudomonas aeruginosa
1.00E + 00
40.00
1.00E-01
30.47
pectinatus cerevisiiphilus
1.00E + 00
40.00
1.00E-01
40.00
1.00E-02
40.00
1.00E-03
28.70
Staphylococcus aureus
1.00E + 00
40.00
1.00E-02
40.00
1.00E- 03
29.73
Selenomonas artemidis
1.00E + 00
40.00
1.00E -01
40.00
1.00E-02
40.00
1.00E-03
28.72
Selenomonas Dianae
1.00E + 00
40.00
1.00E-01
40.00
1.00E-02
40.00
1.00E-03
28.22
Selenomonas flueggeii
1.00E + 00
40.00
1.00E-01
40.00
1.00E-02
40.00
1.00E-03
28.82
Selenomonas infelix
1.00E + 00
40.00
1.00E-01
40.00
1.00E-02
29.32
Streptococcus mutans
1.00E + 00
40.00
1.00E-01
< Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.
