Abstract
sfondo
Porphyromonas gingivalis
è stato implicato come un importante agente patogeno nello sviluppo e nella progressione della parodontite cronica. P. gingivalis
formazione di biofilm nella fessura subgengivale svolge un ruolo importante nella capacità dei batteri di tollerare segnali di stress all'esterno della membrana citoplasmatica. Alcuni batteri usano una sottofamiglia distinta di fattori sigma a regolare le loro funzioni extracitoplasmatico (sottofamiglia ECF). L'obiettivo di questo studio era di determinare se P. gingivalis
fattori sigma ECF influenzano P. gingivalis
formazione di biofilm.
Metodi
Per chiarire il ruolo dei fattori sigma ECF in P. gingivalis
, sono stati costruiti mutanti cromosomiche che trasportano una perturbazione di ogni ECF sigma gene del fattore-codifica. curve di crescita batterica sono stati misurati determinando la torbidità di colture batteriche. La quantità di biofilm che crescono su piastre è stata valutata mediante colorazione cristallo violetto.
Risultati
confronto delle curve di crescita di wild-type P. gingivalis
ceppo 33277 ed i mutanti ECF ha indicato che il tasso di crescita dei mutanti era leggermente inferiore a quella del ceppo wild-type. I mutanti PGN_0274- e PGN_1740-difettosi avevano aumentato la formazione di biofilm rispetto al wild-type (p
& lt; 0,001); Tuttavia, gli altri mutanti fattore sigma ECF o ceppi integrati non migliorano la formazione di biofilm.
Conclusione
Questi risultati suggeriscono che PGN_0274 e PGN_1740 svolgono un ruolo chiave nella formazione di biofilm da P. gingivalis
.
parole
extracitoplasmatico fattore funzione sigma biofilm Porphyromonas gingivalis
materiale supplementare parodontale malattia elettronico
La versione online di questo articolo (doi:. 10 1186 /1472-6831-15-4) contiene materiale supplementare, che è disponibile per gli utenti autorizzati.
Sfondo
anaerobica batterio Porphyromonas gingivalis Gram-negativi
è considerato uno dei più importanti agenti eziologici della malattia parodontale [1]. Colonizzare e sopravvivere nel gengivale, P. gingivalis
devono essere in grado di rilevare e rispondere alle condizioni ambientali prevalenti, comprese le variazioni di temperatura, tensione di ossigeno, pH, disponibilità di nutrienti e la presenza di altre cellule batteriche. P. gingivalis
possiede regolatori trascrizionali che sono stati implicati nella protezione contro lo stress shock termico o di stress ossidativo, come ad esempio RprY [2, 3] e OxyR [4]. Inoltre, questo batterio e altri batteri formano biofilm per proteggere contro lo stress ambientale [5]. placca dentale, un biofilm multispecie, è organizzata sulla superficie del dente e tessuti parodontali della cavità orale umana [6]. batteri orali nei biofilm sopravvivere nel gengivale per un lungo periodo di tempo, portando a gengiviti che può eventualmente progredire in periodontite. Capire come i batteri sfuggire lo stress ambientale è molto importante per la prevenzione della malattia parodontale.
Funzione extracitoplasmatico (ECF) fattori sigma servono come regolatori trascrizionali batterica nella risposta alle varie sollecitazioni. Le wild-type P. gingivalis
33277 genoma codifica per sei fattori ECF sigma (PGN_0274, PGN_0319, PGN_0450, PGN_0970, PGN_1108 e PGN_1740; GenBank: AP009380) [7]. (Numero W83 ORF: PG1318) PGN_1108 gioca un ruolo nella regolazione della frequenza di mutazione nel batterio [8]. (Numero W83 ORF: PG0162) PGN_0274 e (numero W83 ORF: PG1660) PGN_0450 potrebbe essere coinvolta nella regolazione post-trascrizionale di gingipain [9], e (numero W83 ORF: PG1827) PGN_1740 è necessaria per la sopravvivenza del batterio nel presenza di ossigeno e stress ossidativo, emina assorbimento e virulenza [9, 10].
in questo studio, di analizzare il ruolo dei fattori sigma ECF in P. gingivalis
formazione di biofilm, interruzione dei fattori sigma ECF, ad eccezione PGN_1108, è stata eseguita. Il mutante PGN_1108-difettoso può avere un fenotipo mutatore, e quindi esclusi dalla nostri esperimenti in questo studio [8]. Il PGN_0274 e mutanti PGN_1740-difettosi esibivano migliorata la formazione di biofilm, ma i ceppi integrati no. Questi risultati suggeriscono che i fattori sigma PGN_0274 e PGN_1740 ECF sono coinvolti nella regolazione della formazione di biofilm nel batterio.
Metodi
ceppi batterici e le condizioni di coltura cellulare in tutte le nazioni ceppi batterici e plasmidi utilizzati nel presente studio sono elencate nella tabella 1. P. gingivalis
cellule sono state coltivate in condizioni anaerobiche (10% di CO
2, il 10% H 2 e il 80% N 2) in infusione cuore cervello arricchito (BHI) brodo e sulla soia trittico arricchito (TS) agar [11]. Per piastre di agar sangue, sangue di pecora defibrinato laked è stato aggiunto al arricchita TS agar al 5%. Per la selezione e la manutenzione di antibiotico-resistenti P. gingivalis
ceppi, i seguenti antibiotici sono stati aggiunti al mezzo: 15 ug /ml eritromicina (Em), e 0,7 ug /ml di tetraciclina (Tc) .table 1 ceppi batterici e plasmidi utilizzato in questo studio
Strain o plasmide
Descrizione
di riferimento o sorgente
E. coli ceppo
DH5α
impiego generale ceppo ospite per la clonazione
Invitrogen
P. gingivalis
ceppo
33277
wild type
ATCC
KDP314
PGN_0274 :: ermF ermAM,
EMR
Questo studio
KDP315
PGN_0319 :: ermF ermAM,
EMR
Questo studio
KDP316
PGN_0450 :: ermF ermAM,
EMR
Questo studio
KDP317
PGN_0970 :: ermF ermAM,
EMR
Questo studio
KDP319
PGN_1740 :: ermF ermAM,
EMR
Questo studio
KDP314C
KDP314 /pKD828,
EMR Tcr
Questo studio
KDP319C
KDP319 /pKD829,
EMR Tcr
Questo studio
E. coli
plasmide
pGEM-T facile
apr plasmide vettore per la clonazione TA
Promega
pKD355 mondo apr,
contiene il ermF ermAM
cassetta DNA tra Eco
RI e Bam HI
di pUC18
12
pKD814 mondo apr, contiene il 1,0-kb frammento di PCR-amplificato (regione PGN_0450) in pGEM -T facile
Questo studio
pKD817 mondo apr, contiene il 1,5-kb frammento di PCR-amplificato (regione PGN_0274) in pGEM-T facile
Questo studio
pKD818 mondo apr, contiene il 2.0-kb frammento di PCR-amplificato (regione PGN_0319) in pGEM-T facile
il presente studio
pKD819 mondo apr, contiene il 2.0-kb frammento di PCR-amplificato (regione PGN_0970) in pGEM-T facile
Questo studio
pKD821 mondo apr, contiene il 2.0-kb frammento di PCR-amplificato (regione PGN_1740) in pGEM-T facile
il presente studio
pKD822
mondo Apr EMR, contiene il ermF ermAM
cassetta DNA a Bam portale HI entro PGN_0274 di pKD817
il presente studio
pKD823
aprile EMR, contiene il ermF ermAM
cassetta DNA a Bam portale HI entro PGN_0319 di pKD818
il presente studio
pKD824 mondo Apr EMR, contiene il ermF ermAM
cassetta DNA a Bam portale HI entro PGN_0450 di pKD814
Questo studio
pKD825 mondo Apr EMR, contiene il ermF ermAM
cassette DNA in Bgl sito
II entro PGN_0970 di pKD819
Questo studio
pKD827 mondo apr EMR, contiene il ermF ermAM
cassette DNA a Bam portale HI entro PGN_1740 di pKD821
Questo studio
P. gingivalis
plasmide
pT-COW mondo Apr Tcr, E. coli-P. gingivalis
navetta plasmide
14
pKD828 mondo Apr Tcr, PGN_0274 PT-Mucca- +
Questo studio
pKD829 mondo Apr Tcr, PGN_1740 pT-Mucca- +
Questo studio
Costruzione di ECF mutanti fattore sigma e ceppi mutanti integrati
per disturbare i geni fattore sigma ECF, PGN_0274-, PGN_0319-, PGN_0450-, PGN_0970- ei geni che codificano PGN_1740-erano PCR-amplificato dal DNA cromosomico di P. gingivalis
33277 utilizzando Takara Ex Taq (Takara Bio, Otsu, Giappone) e il primer gene-specifici elencati nella Tabella 2. le aree amplificati erano parte del frammento di DNA contenente l'estremità 5 'di ogni ECF fattore sigma gene e la regione a monte del codone di inizio ATG, e un frammento di DNA contenente il 'estremità 3 di ciascun fattore gene sigma e la regione a valle della codone di stop. Entrambi i frammenti sono stati quindi ligati nel sito di clonaggio multiplo di T-vector (pGEM-T Vector facile, Promega, Tokyo, Giappone). A Bam
HI-Sac
I frammento (Bgl
II-Sac
i frammentare per PGN_0970) contenente all'estremità 3 'di ciascun fattore sigma gene è stato estratto dal plasmide risultante e legatura in Bam
HI-Sac portale I (Bgl
II-Sac
i frammentare per PGN_0970) del plasmide contenente 5 'del gene corrispondente ECF. Il ermF
-ermAM
cassette di pKD355 [12] è stato inserito nel Bam portale HI entro PGN_0274 di pKD817, PGN_0319 di pKD818, PGN_0450 di pKD814 e PGN_1740 di pKD821, o Bgl II
sito all'interno PGN_0970 di pKD819 cedere pKD822, pKD823, pKD824, pKD827 e pKD825, rispettivamente. Questi plasmidi sono stati linearizzati Not
i digestione e introdotti in P. gingivalis
33277 cellule mediante elettroporazione, come descritto in precedenza [13], con conseguente KDP314 (PGN_0274 :: ermF ermAM
), KDP315 (PGN_0319 :: ermF ermAM
), KDP316 (PGN_0450 :: ermF ermAM
), KDP317 (PGN_0970 :: ermF ermAM
) e KDP319 (PGN_1740 :: ermF ermAM
). Corretta la sostituzione genica di questi ceppi, che erano stati generati da doppie eventi di crossover di ricombinazione, è stata verificata mediante PCR e Southern blot (dati non riportati) .table 2 Primer utilizzati in questo studio
sequenza Nome
Nucleotide (5′-3′)
PGN0274-U-F
TCGACAGTTGATTGCCGAT
PGN0274-U-R-Bam
HI
GGGATCCCCATCGAAAGACTGCAATCTGG
PGN0274-D-F-Bam
HI
GGGATCCCATGACGACGCCGCTCCTGTCGAAA
PGN0274-D-R
TGTGCAAAAAAGGAAACAGC
PGN0319-U-F
GCTGCCGCTCCTTCTTCAT
PGN0319-U-R-Bam
HI
GGGATCCCAAAGGCAGATCGTCCGGTA
PGN0319-D-F-Bam
HI
GGGATCCCCTCCGATCATGCCCCTA
PGN0319-D-R
TCAGGCTCTTGTACAGATGGA
PGN0450-U-F
GGGATGTGGAGAAAAAGGAA
PGN0450-D-R
ATGACCACGGACAGGAAGAT
PGN0970-U-F
ACCGGGAAATAATTCTCAAGC
PGN0970-U-R-Bgl
II
AAGATCTTCCAAAGAGGTCGGATAAGGA
PGN0970-D-F- Bgl
II
AAGATCTTAGGCTGCCGAGGTACAGGA
PGN0970-D-R
ACACAAGCTACAGCCCCGTA
PGN1740-U-F
GAGGATCTCCCTGCCAATAAT
PGN1740-U-R-Bam
HI
GGGATCCCACCCAGCCTTTGAAGTTGACA
PGN1740-D-F-Bam
HI
GGGATCCCGCTCACTGTCATGCGAAAT
PGN1740-D-R
CCAACGGCTATTTAGCATCC
PGN0274-COMP-U-F-Pst
I
CCTGCAGGCTGCTACTGTCTCGGACGTG
PGN0274-COMP-D-R-Bam
HI
GGGATCCCGTTTGTGTTTGAGGCTGCAT
PGN1740-COMP-U-F-Bam
HI
CGGGATCCCGAGTGCGATATCGGGAATCAG
PGN1740-COMP-D-R-Bam
HI
CGGGATCCCGAGTTGATACGGCTGCTATGC
siti di restrizione incorporati in oligonucleotidi per subcloning sono evidenziate in grassetto. Compra di complementazione di PGN_0274 e PGN_1740, l'intero fattore sigma regione del gene ECF con le sue regioni a monte ea valle accompagnamento (0,5 kb) è stato PCR-amplificato dal DNA cromosomico con Takara Ex Taq con i primers superiore e inferiore (Tabella 2). I frammenti di DNA amplificati sono stati ligati nel sito di clonaggio multiplo di pGEM T-Easy vettoriale. SPH
I-Bam HI
frammento PGN_0274 o Bam HI
frammento di PGN_1740 sono stati estratti dal plasmide risultante e ligato nel Sph
I-Bam
HI o Bam
HI sito di pT-COW [14], che è stato gentilmente fornito dal Prof. NB Shoemaker (University of Illinois a Urbana-Champaign, USA). I plasmidi risultanti, pKD828 e pKD829, sono stati introdotti in KDP314 o KDP319 dalla elettroporazione, con conseguente rispettivamente KDP314C e KDP319C, dopo 7 d incubazione su agar TS arricchito contenente 0,7 mg /ml di tetraciclina. La presenza di plasmide PT-COW-derivato è stata verificata mediante PCR e il restauro del mRNA del gene mutato è stato istituito mediante RT-PCR (dati non riportati)
. Valutazione del biofilm formazione capacità
formazione di biofilm è stata esaminata dal il protocollo modificato di Saito [15]. In breve, P. gingivalis
cellule sono state inoculate in BHI brodo e precultured anaerobicamente a 37 ° C per 2 d. culture completamente sviluppato dei ceppi di P. gingivalis
avevano torbidità rettificato per OD 660 = 0,1 con terreno fresco, e quindi aliquote da 1,5 ml sono stati inoculati in collagene di tipo I-rivestite 12-pozzetti a fondo piatto micropiastre ( IWAKI Glass Co., Funabashi, Giappone) e coltivate anaerobicamente a 37 ° C per 2 d. Il terreno di coltura è stato poi rimosso da ciascun pozzetto ed è stato aggiunto 0,5 ml di soluzione di cristal violetto 0,1%. Dopo 15 min, i pozzetti sono stati lavati tre volte con PBS e essiccato all'aria. Il cristallo viola che rimane nel biofilm è stato solubilizzato con 0,5 ml di 1% SDS e assorbanza è stata misurata in A 600 utilizzando un lettore per micropiastre (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). massa biofilm è stato determinato mediante colorazione cristallo viola e regolata per la crescita (A 600 unità per OD 660 unità).
Analisi statistica
Il senso unico test multiplo di confronto ANOVA test /di Dunnett è stato utilizzato per confrontare le differenze tra 33277 e mutanti ECF utilizzando GraphPad Prism versione 6.0 per Windows (GraphPad Software, Inc., la Jolla, CA, USA). I dati sono stati considerati significativi se p
& lt; 0.05.
Risultati
capacità di crescita e la formazione di biofilm dei P. gingivalis
ECF mutanti fattore sigma in tutte le nazioni cinque mutanti ECF è cresciuto più lentamente rispetto al ceppo selvatico in fase esponenziale, e le rese finali di i mutanti ECF erano meno di quella del wild-type a seguito di un 48-ore di incubazione in condizioni anaerobiche (Figura 1). Il mutante PGN_1740 ha mostrato notevole crescita lenta rispetto al wild-type e altri mutanti ECF. Per valutare la relazione tra l'attività di formazione di biofilm e fattori sigma ECF, la formazione di biofilm è stata esaminata per la wild-type e mutanti cinque ECF. Dopo la colorazione cristalvioletto del biofilm, è stato solubilizzato con etanolo. Il cristallo viola rimanente nel wild-type, PGN_0319, PGN_0450, PGN_0970 e PGN_1740 biofilm mutante è stato solubilizzato ed estratto, ma nel mutante PGN_0274, solubilizzazione e l'estrazione non fosse completa (vedi file supplementare 1). Così, la massa biofilm tutti i ceppi testati è stato sciolto con SDS e misurato. Tra i mutanti ECF, la massa biofilm dei mutanti PGN_0274 e PGN_1740 era superiore al wild-type (Figura 2). Per confermare il collagene di tipo I influenzare la formazione di biofilm, abbiamo studiato la formazione di biofilm utilizzando una piastra non rivestito. I risultati sono stati quasi la stessa (vedi file aggiuntivo 2), come il mutante PGN_0274 prodotto più biofilm rispetto al wild-type. Tuttavia, il ceppo selvatico e mutante PGN_1740 non erano statisticamente differenti. Questo risultato suggerisce la formazione di biofilm dal mutante PGN_1740 è stata influenzata dalla situazione ambientale, come la presenza di collagene di tipo I. Figura 1 Crescita di P. gingivalis 33277 e ECF mutanti fattore sigma. curve di crescita di P. gingivalis
33277 (wild-type, cerchio), PGN_0274 mutante (KDP314; aperto rettangolo), PGN_0319 mutante (KDP315; rettangolo chiuso), PGN_0450 mutante (KDP316; diamante), PGN_0970 mutanti (KDP317; triangolo ), PGN_1740 mutante (KDP319; croce) in brodo BHI arricchito. I dati riportati sono media ± SD di esperimenti in triplo.
Figura 2 la formazione di biofilm da omotipica P. gingivalis 33277 o ECF mutanti fattore sigma. I ceppi sono stati coltivati in brodo BHI arricchito in anaerobiosi a 37 ° C in collagene di tipo I-rivestite 12-pozzetti a fondo piatto micropiastre. Dopo 48 ore di coltivazione, la massa biofilm organizzata è stata valutata mediante colorazione con cristal violetto. (A) Le fotografie sono un campione rappresentativo di ogni ceppo sperimentale. (B) la formazione di biofilm determinata colorando di cristallo viola e adeguato per la crescita (unità A600 per unità OD660). I dati riportati sono media ± SD di esperimenti in triplo. ***, P
& lt; 0.001, da molteplici test di confronto un one-way ANOVA test /di Dunnett
. Complementazione dei mutanti PGN_0274- e PGN_1740-difettosi
Per determinare se la massa biofilm maggiore è stato causato dalla cancellazione di PGN_0274 e PGN_1740, abbiamo costruito ceppi dove sono stati restaurati il PGN_0274 e PGN_1740. Il PGN_0274 e PGN_1740 completate ceppi sono stati costruiti con l'introduzione del PT-COW contenente wild-type PGN_0274 e PGN_1740 in ciascuno dei mutanti. Questo complementazione ripristinato la capacità formazione del biofilm ai livelli wild-type (Figura 3). Questi risultati supportano il concetto che PGN_0274 e PGN_1740 svolgono un ruolo importante nel controllo P. gingivalis
formazione di biofilm. Figura 3 la formazione di biofilm da omotipica P. gingivalis 33277, ECF fattore sigma mutante e completata ceppo mutante. I ceppi sono stati coltivati in brodo BHI arricchito in anaerobiosi a 37 ° C in collagene di tipo I-rivestite 12-pozzetti a fondo piatto micropiastre. Dopo 48 ore di coltivazione, la massa biofilm organizzata è stata valutata mediante colorazione con cristal violetto. (A) La formazione di biofilm di 33277, PGN_0274 mutante e il ceppo mutante complementato sono stati confrontati. (B) la formazione di biofilm di 33277, PGN_1740 mutante e il ceppo mutante complementato sono stati confrontati. la formazione di biofilm determinata colorando di cristallo viola e adeguato per la crescita (unità A600 per unità OD660). I dati riportati sono media ± SD di esperimenti in triplo. *, P
& lt; 0,05, e ***, p
& lt; 0.001, da un senso unico multiplo test di confronto ANOVA test /di Dunnett.
Discussione
batteri a volte incontrano un ambiente sfavorevole per la loro sopravvivenza. Il microbiota orale umana è spesso influenzato da varie sollecitazioni; quindi, deve possedere la capacità di difendersi. Due principali meccanismi di regolazione interagiscono con le regioni citoplasmatici e extracitoplasmatico tramite fattori sigma ECF alternativi e regolatori di risposta fosforilazione-dipendente (sistemi a due componenti, STC) [16, 17]. fattori sigma ECF hanno dimostrato che regolano processi cellulari busta correlati (coinvolgono manutenzione della membrana /architettura periplasmic), come la secrezione, sintesi di esopolisaccaridi, esportazione ferro e sintesi efflusso di proteasi extracellulari [18]. Batterica polimerasi RNA nucleo (composto da due subunità alfa, β subunità e β subunità ') si lega fattori sigma. Molteplici fattori sigma sono i fattori di trascrizione iniziazione batteriche che permettono legame specifico di RNA polimerasi di promotori dei geni. Al contrario, STC consistono tipicamente di una chinasi istidina membrane-legame che rileva uno specifico stimolo ambientale ed un regolatore di risposta corrispondente che media la risposta cellulare, principalmente attraverso l'espressione differenziale di geni bersaglio [19]. È interessante notare che un regolatore trascrizionale in Methylobacterium extorquens
, PhyR, è stato identificato e determinato a coniugare i domini di entrambi i sistemi [20]. Nel loro insieme, i fattori sigma ECF e TCS sono fattori essenziali che proteggono i batteri da stress ambientale.
Diversi gingivalis P.
fattori sigma ECF sono stati precedentemente descritti. Tuttavia, non ci sono informazioni sui fattori sigma ECF interessate ad operare su questo batterio in risposta alla formazione di biofilm. In Bacillus subtilis
e Pseudomonas aeruginosa
, fattori sigma ECF sono coinvolti nella regolazione dello sviluppo del biofilm [21, 22]. In questo studio, abbiamo studiato se la formazione di biofilm di P. gingivalis
è regolata da fattori sigma ECF. Questo studio ha dimostrato che PGN_0274 e PGN_1740 mutanti hanno prodotto la formazione di biofilm superiore a quella ottenuta con la wild-type o gli altri mutanti fattore sigma ECF. L'inattivazione di PGN_1740 anche aumentato l'espressione di FIMS
a livello trascrizionale [9]. Fimbriae e minori fimbrie monospecies influenza biofilm [23]. Il livello trascrizionale di FIMS
è stata esaminata mediante RT-PCR, che hanno mostrato le fims
espressione è stata downregulated (vedi file supplementare 3). I risultati hanno mostrato fims non possono essere coinvolti nel controllo formazione di biofilm. Sono necessari ulteriori lavori per chiarire questo punto.
Il saggio biofilm rivelato che l'etanolo non sciogliere completamente la massa biofilm ed estrarre la macchia di cristallo viola per la PGN_0274 biofilm mutante (vedi file supplementare 1). Pertanto, abbiamo sciolto la massa biofilm con SDS e misurato il cristalvioletto risultante presenti nel campione. La necessità di un solvente più rigorosa suggerito che la matrice biofilm intorno il mutante è composta in parte da una componente proteica. I biofilm extracellulari sostanze polimeriche (EPS), composto esopolisaccaridi, proteine, acidi nucleici e lipidi, svolgono un ruolo di struttura di difesa, proteggendo i batteri dal sistema immunitario ospite e terapia antimicrobica [24]. Le proteine sono una componente importante di EPS [25]. Poiché le vie metaboliche del mutante PGN_0274 vengono modificati dalla perdita del fattore sigma PGN_0274 ECF, le rese di proteine nel mutante PGN_0274 sono più abbondanti di quelle wild-type e gli altri mutanti. Pertanto, abbiamo esaminato il profilo proteico dei mutanti Sigma ECF rispetto al wild-type (vedi file supplementare 4). La degradazione del 75-K-250-K Da proteine sono state dimostrate nel wild-type, PGN_0319, PGN_0450, PGN_0970 e PGN_1740 mutanti, ma non nel mutante PGN_0274. Questa alterazione non è stata osservata in presenza di inibitori della proteinasi TLCK e leupeptina. I profili proteici del wild-type e mutanti sigma ECF erano quasi identici. Presi insieme, questi risultati suggeriscono che questo apparente differenza di solubilità potrebbe essere spiegato dalla diminuzione di attività Kgp e Rgp nel mutante PGN_0274 [9]. KGP sopprime la formazione di biofilm e Rgp controlla la morfologia microcolonia [26]. Il SINR
ortologo PGN_0088, un regolatore trascrizionale, agisce come un regolatore negativo di accumulo esopolisaccaride nel wild-type P. gingivalis
[27]. PGN_0274 può controllare diverse vie metaboliche che PGN_0088 e agire come un regolatore negativo di accumulo di proteine.
In conclusione, abbiamo identificato che PGN_0274 e PGN_1740 giocano un ruolo chiave in P. gingivalis
formazione di biofilm. Questi risultati mostrano per la prima volta che P. gingivalis
fattori sigma ECF sono coinvolti nella formazione di biofilm. PGN_0274 è coinvolto nella regolazione post-trascrizionale di gingipains [8]. Gingipain è un importante fattore di virulenza in P. gingivalis
, perché gingipains distruggono parodontali tessuti, immunoglobuline e fattori complementari [28, 29]. Come PGN_1740 gioca un ruolo significativo nella risposta agli stress ossidativi nel batterio [8, 9], la sopravvivenza del mutante PGN_1740 stato ridotto in presenza di cellule ospiti [9]. Abbiamo anche osservato questo nelle cellule Ca9-22 (dati non mostrati). Presi insieme, questi risultati mostrano che ECF sigma fattori PGN_0274 e PGN_1740 sono coinvolti nella virulenza di P. gingivalis
. Ulteriori studi sui ruoli dei P. gingivalis
fattori sigma ECF, PGN_0274 e PGN_1740, ci aiuteranno a capire la capacità di P. gingivalis
di colonizzare e sopravvivere nel gengivale, e quindi agire come un agente patogeno umano
. Conclusioni
la massa del biofilm dei mutanti PGN_0274 e PGN_1740 era superiore a quello del wild-type, suggerendo i fattori di P. gingivalis
funzione extracitoplasmatico sigma PGN_0274 e PGN_1740 sono coinvolti nella formazione di biofilm.
Abbreviazioni
ECF:
funzione extracitoplasmatico
BHI:
infuso cuore cervello
TS:
Trittico di soia
em:
Eritromicina
Tc:
tetraciclina
PCR:
reazione a catena della polimerasi
ANOVA:
analisi della varianza
TCS:
Two- sistemi componenti
SDS:
sodio dodecil solfato
EPS:.
sostanze polimeriche extracellulari
Dichiarazione
Ringraziamenti
ringraziamo i membri del Dipartimento di Microbiologia orale, Matsumoto Dental University e Microbiologia, Tokyo Dental college, per utile discussione. Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione-in-Aid (24.792.372) per la ricerca scientifica da parte del Ministero dell'Istruzione, della Scienza, Sport, Cultura e Tecnologia, Giappone, E questa ricerca è stata supportata anche da Oral Health Science Center di Grant HRC8 da Tokyo Dental College , e da un progetto per le università private:. corrispondenti fondo di sussidio da MEXT (Ministero della Pubblica Istruzione, Cultura, Sport, Scienza e Tecnologia) del Giappone, 2010-2012
materiale supplementare elettronica
12903_2014_492_MOESM1_ESM.pptx sui file 1: I confronti di biofilm trattati con etanolo o SDS (PPTX 456 KB) 12903_2014_492_MOESM2_ESM.pptx sui file 2:.. La formazione di biofilm da omotipica P. gingivalis 33277 o ECF mutanti fattore sigma usando non rivestiti micropiastre (PPTX 80 KB) 12903_2014_492_MOESM3_ESM.pptx sui file 3:. L'espressione di RNA di FIMS in P. gingivalis 33277, PGN_1740 mutante e completata ceppo mutante (PPTX 101 KB) 12903_2014_492_MOESM4_ESM.pptx sui file. 4: profilo di proteine su un gel SDS-PAGE (PPTX 343 KB) interessi concorrenti
Gli autori dichiarano di non avere interessi in gioco.
contributi degli autori
SO e YK contribuito in maniera uguale a questo lavoro. SO e YK previsto lo studio, effettuato gli esperimenti e analisi dei dati, e scrisse il manoscritto. Koji Nakayama, NO e KI partecipato nella pianificazione e progettazione dello studio e nell'analisi dei dati. MN e TI ha eseguito lo studio sopravvivenza in cellule ospiti e ha contribuito a redigere il manoscritto. KS, EK e YS aiutato con gli studi di microbiologia. Keisuke Nakano, TK e HH aiutato con gli studi di microbiologia e supervisionato la scrittura del manoscritto. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.
