odontogena
Abstract
sfondo
Gli obiettivi di questo studio sono stati di indagare la immunolocalizzazione di ezrin e il suo rapporto con l'espressione nei tumori podoplanin odontogeni keratocystic.
Materiale e metodi
Le espressioni immunoistochimica di ezrin e podoplanin da epitelio odontogeno sono stati valutati in tumori odontogeni keratocystic utilizzando anticorpi monoclonali.
risultati
I nostri risultati hanno mostrato una forte ezrin citoplasmatica ed espressioni podoplanin membranose nello strato epiteliale basale di tutti odontogenic keratocystic tumori. Le espressioni Ezrin citoplasmatici e membranose sono state rilevate anche in strati epiteliali soprabasali di tumori. Differenza statisticamente significativa tra immunolocalizzazione cellulare di ezrin e podoplanin epitelio odontogeno sono stati trovati con il test di Wilcoxon (p & lt; 0,05). Nessuna correlazione tra le due proteine in tumori odontogeni keratocystic è stato rilevato dal test di Spearman.
Conclusioni
Questi risultati suggeriscono che ezrin e podoplanin possono contribuire alla crescita espansiva e l'invasività locale dei tumori odontogeni keratocystic. Inoltre, come entrambe le proteine sono stati overexpressed da epitelio odontogenico, i loro ruoli possibili devono essere ulteriormente esplorato in tumori benigni odontogeni.
Parole
Keratocystic tumore odontogeno Ezrin Podoplanin elettronico materiale supplementare
La versione online di questo articolo (doi :. 10 1186 /1472-6831-14-150) contiene materiale supplementare, che è disponibile per gli utenti autorizzati
Sfondo
espressione Podoplanin è stata rilevata nelle cellule epiteliali di sviluppare dente germe [1, 2]. e in epitelio odontogeno di tumori benigni [3-10].
La presenza di podoplanin in tessuti umani dente germinali, denti adulti e lesioni cistiche odontogeni suggerito che questa proteina probabilmente è coinvolto nei meccanismi di adesione delle cellule, la transizione epitelio-mesenchimale e l'invasione e la crescita espansiva delle lesioni cistiche odontogene [5].
precedenti studi condotti nel nostro laboratorio indagato l'associazione tra podoplanin con attività proliferativa cellulare, determinata da Ki-67 anticorpi, in ameloblastomas [7] e tumori odontogeni keratocystic [9 ]. Non abbiamo trovato una correlazione statisticamente significativa in ameloblastomas, tuttavia questa associazione è stata osservata nei tumori odontogeni keratocystic. Inoltre, sia podoplanin e Ki-67 espressioni erano più forti e co-localizzate nei tumori odontogeni keratocystic rispetto alle cisti odontogene orthokeratinized, una lesione indolenti. Questi fingings suggerito che le cellule podoplanin positive sono situati nel centro proliferazione cellulare indicando un ruolo per questa proteina nel processo di invasione tumorale [9].
Inoltre, Friedrich et al. [8] ha mostrato che pattern di espressione podoplanin è simile tra cheratocisti tumore odontogeno diagnosticato in sporadici e in sindrome del nevo basocellulare e, gli autori hanno rafforzato la probabile associazione di questa proteina con l'invasione e locali recidive del tumore.
Recenti scoperte dimostrano che podoplanin è importante guidare migrazione cellulare direzionale in cellule epiteliali e tumorali [11]. Quindi, la capacità di podoplanin per rimodellare citoscheletro e formare estensione membrana filipodia simile [12] è stato suggerito come fattore importante nel movimento delle cellule epiteliali odontogene [6]. Questo motilità cellulare podoplanin indotta attraverso di actina riarrangiamento del citoscheletro sembra essere dipendente dalla interazione con il citoplasmatica ezrin [13], un membro di ERM (ezrina, radixin, moesin) proteina famiglia di proteine [14, 15].
Il studio attualmente è stato progettato per analizzare la immunolocalizzazione di ezrin e il suo rapporto con l'espressione podoplanin nei tumori odontogeni keratocystic. Per quanto a nostra conoscenza, questo è il primo rapporto di ezrin immunostaining in un tumore odontogeno.
Metodi
Pazienti e campioni tumorali in tutte le nazioni campioni chirurgici di keratocystic tumore odontogeno analizzati in questo studio sono stati ottenuti dal Laboratorio di Patologia, Bauru Scuola di Odontoiatria, Università di San Paolo, tra il 2002 e il 2010. I criteri di inclusione sono stati: i) i pazienti con diagnosi di tumore odontogeno keratocystic in base alla classificazione dell'Organizzazione mondiale della sanità [16], determinata dalla somma dei la clinica, radiografica e dei dati microscopici; ii) la disponibilità del blocco di paraffina con sufficiente quantità e rappresentante di tumore odontogeno per l'analisi microscopica. Applicando i criteri di inclusione, 18 tumori odontogeni keratocystic sono stati selezionati per le indagini di podoplanin e immunocolorazione ezrin. Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico di ricerca della Scuola di Odontoiatria Bauru, dell'Università di San Paolo (processo # 85612/2012).
Immunoistochimica
formalina fisso 3 sezioni micron di tumori odontogeni keratocystic sono stati ottenuti dalla patologia archivio per l'analisi immunoistochimica delle Ezrin e podoplanin espressioni da epitelio odontogeno. Dopo il recupero dell'antigene utilizzando 10 mM tampone citrato, pH 6,0, in una pentola a pressione interna (modello Eterna 4½ L; Nigro, Araraquara, Brasile) per 4 min, perossidasi endogena è stata bloccata mediante incubazione nel 3% H
2O 2 per 20 min. Ogni sezione è stata incubata per una notte a 48 ° C con l'anticorpo primario monoclonale anti-podoplanin (D2-40 clone, codice # 3619-1; Dako North America, Inc., Carpinteria, CA, USA), la diluizione 1: 200 o anti- anticorpo Ezrin (Dako North America, Inc., CA, USA), la diluizione 1: 1000, in PBS (PBS) con albumina sierica bovina (cat. # A2153, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) soluzione per bloccare una reazione non specifica. Poi, ogni sezione è stata incubata con Advance HRP Link System (cat. # 4067, Dako Nord America, Carpinteria, CA, USA) per 30 minuti a 37 ° C. Entrambi gli anticorpi sono stati rilevati utilizzando 3,30-diaminobenzedine tetraidrocloride (DAB, cat. # D-5637, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). sezioni del tumore sono state contrastate con ematossilina di Mayer, prima di essere disidratati e copertura scivolato. tonsille palatine e intestino sono stati utilizzati come controllo positivo rispettivamente podoplanin e ezrin,. Per un controllo negativo, l'anticorpo primario è stato omesso durante la colorazione immunoistochimica. I Ezrin e podoplanin espressioni da epitelio odontogeno dei 18 tumori odontogeni keratocystic sono stati valutati in dieci campi microscopici catturate digitalmente utilizzando una fotocamera AxioCam (AxioCam MR3, Zeiss, Jena, Germania) collegato a un microscopio ottico e registrati dal software AxioVision (AxioVision 4.7; Zeiss). Un punteggio per Ezrin e podoplanin immunostainings espresse da epitelio odontogeno è basata su: a) l'intensità della immunocolorazione nelle cellule odontogeni epiteliali (0 = assente, 1 = debole, 2 = moderato, 3 = forte, e 4 = molto forte) e (b) la percentuale di cellule positive odontogeniche (0 = 0% di cellule positive, 1 = & lt; 25% di cellule positive, 2 = 25-50% di cellule positive, 3 = 50-75% di cellule positive e 4 = & gt; 75% cellule positive). Il punteggio immunostaining finale è stato determinato dalla somma di (a) + (b). I punteggi finali variavano da 0 a 8 (0 = assente, 1-4 = debole, e 5-8 = forte). La differenza e la correlazione tra l'espressione membranosa o citoplasmatica di ezrin e podoplanin espressi in tumori odontogeni keratocystic sono stati determinati con il test di Wilcoxon e il coefficiente di correlazione di Spearman, rispettivamente. Il livello di significatività è stato fissato a 5% per tutte le prove.
Risultati
Caratteristiche cliniche
Il nostro campione era composto in sedici pazienti con diagnosi di tumori odontogeni keratocystic (nove di loro erano donne e sette uomini). l'età del paziente variava da 9 a 68 anni (media 28 anni) e sono stati prevalentemente bianco (75%). La maggior parte dei tumori erano situate in regione posteriore della mandibola (62,5%), seguita da mascellare (25%), e in 3 casi localizzazione non è stato specificato dal chirurgo. Dal totale di 16 pazienti con tumori odontogeni keratocystic, 4 di loro aveva la sindrome di Gorlin-Goltz e da questi, 2 avevano lesioni multiple, ma in diversi locali e periodi.
Espressione Podoplanin da tumori odontogeni keratocystic
Il strato basale la mucosa orale normale presentato positività per podoplanin membranosa così come i vasi linfatici nel tessuto connettivo soggiacente, confermando l'integrità della reazione immunoistochimica. L'espressione membranosa e citoplasmatica di podoplanin è stata intensamente concentrata strato basale dell'epitelio in tutti i tumori odontogeni keratocystic (Tabella 1). Gli strati superiori di epitelio sono risultati negativi per questa proteina (Figura 1) e cellule periferiche di cisti figlie fortemente espresso questa espressione podoplanin citoplasmatica protein.Table 1 Membranosa e in 18 keratocystic tumori odontogeni
PODOPLANIN
membranosa
citoplasmatica
p *
N
%
N
%
Assente
0
0
0
0
1.000
debole
0
0
1
5.56
Strong
18
100
17
94.44
TOTALE
18
100
18
100
Bauru Scuola di Odontoiatria - Università di San Paolo, San Paolo 2002 al 2010.
* test di Wilcoxon; ρ = livello di significatività statistica di 0.05.
Figura 1 Espressione di podoplanin in keratocystic tumore odontogeno. La positività limitato allo strato basale (IHQ, 400 ×).
Espressione Ezrin da tumori odontogeni keratocystic
Ezrin è stata fortemente espressa nella membrana citoplasmatica dello strato spinoso della mucosa orale. La maggior parte dei tumori odontogeni Keratocyst cellule epiteliali (83.33% dei casi) ha espresso con forza ezrin citoplasmatica (Tabella 2). Il Ezrin citoplasmatica è stato spesso rilevato in epiteliale strato basale e superiore membranosa ezrin positività potrebbe essere notato in strati sovra-basale di epitelio. L'espressione membranosa ezrina assente o debole da parte delle cellule epiteliali è stata osservata in circa il 61% dei tumori. Le cellule epiteliali odontogeniche di cisti figlie anche mostrato citoplasmatica e membranosa ezrin (Figura 2) .table 2 membranosa ed espressione ezrina citoplasmatica in 18 tumori odontogeni keratocystic
Ezrin
membranosa
citoplasmatica
p *
N
%
N
%
Assente
10
55.56
2
11.11
0.007
debole
1
5,56
1
5,56
forte
7
38.88
15
83.33
TOTALE
18
100
18
100
Bauru Scuola di Odontoiatria - Università di São Paulo, São Paulo, 2002 al 2010.
* test di Wilcoxon; ρ = livello di significatività statistica di 0.05.
Figura 2 Espressione di ezrin in keratocystic tumore odontogeno. Nota positività citoplasmatica in basali e sovra-basale strati ed espressione membranosa nel livello più superficiale dell'epitelio odontogena (IHQ, 400 ×).
Relazione tra Ezrin e podoplanin espressioni in tumori odontogeni keratocystic
test del Wilcoxon è stato utilizzato per confrontare l'espressione subcellulare di ezrina e podoplanin nei tumori benigni odontogeni. Le differenze tra ezrin membranosa e membranosa (p = 0,003) o citoplasmatica (p = 0,003) espressioni podoplanin erano statisticamente significative (Tabella 3). Inoltre, non vi erano differenze statisticamente significative tra ezrin citoplasmatica e membranosa (p = 0,109) o citoplasmatici espressioni (p = 0,201) podoplanin, come llustrated in prova Tabella 3. La Spearman non hanno dimostrato una correlazione statisticamente significativa tra podoplanin membranosa o citoplasmatica e ezrin espressioni in tumori odontogeni keratocystic (Tabella 4) .table 3 Confronto tra membranosa e podoplanin citoplasmatica ed espressione ezrina in 18 tumori keratocystic odontogeni
podoplanin
Ezrin
M (%)
C (%)
M (%)
C (%)
M PO
M PO
C PO
C PO
X
X
X
X
M EZ
C EZ
M EZ
C EZ
Assente
0
0
55.56
11.11
p = 0.003
p = 0,109
p = 0.003
p = 0,201
debole
0
5,56
5,56
5,56
forte
100 |
94.44
38.88
83.33
TOTALE
100
100
100
100
Bauru Scuola di Odontoiatria - Università di São Paulo, São Paulo, 2002 al 2010.
test di Wilcoxon; ρ = livello di significatività statistica di 0.05. PO: podoplanin; EZ: Ezrin; M: membranosa; C:. Citoplasmatica
Tabella 4 membranosa e citoplasmatica correlazione tra podoplanin ed espressione ezrina in 18 tumori odontogeni keratocystic
membranosa
citoplasmatica
Podoplanin
Podoplanin
membranosa ezrin
r = 0.000
r = -0,293
p = 1.000
p = 0.293
citoplasmatica ezrin
r = 0.000
r = -0,108
p = 1.000
p = 0.670
Bauru Scuola di Odontoiatria - Università di São Paulo, São Paulo, 2002 al 2010.
r = coefficiente di correlazione di Spearman; ρ = livello di significatività statistica di 0.05
. Discussione
Negli ultimi anni, l'interesse per l'espressione podoplanin nei tumori benigni odontogeni è notevolmente aumentata [3, 4, 6-10, 17]. È stato suggerito che questa proteina partecipa al movimento delle cellule epiteliali odontogene attraverso actina citoscheletro riarrangiamento [6, 9]. Anche se la motilità cellulare indotta da odontogena podoplanin può dipendere la sua interazione con il ezrin attivato, il collegamento tra entrambe le proteine non è stato precedentemente studiato in tumori odontogeni.
I nostri risultati per quanto riguarda la immunolocalizzazione di podoplanin ha mostrato una forte espressioni membranose e citoplasmatici di la proteina rilevato principalmente nello strato basale dell'epitelio odontogenico, anche in cisti figlie. Nel normale mucosa orale, espressione podoplanin era membranosa e concentrato allo strato epiteliale basale. I nostri risultati confermati quelli degli autori precedenti [4, 8-10, 17].
Da Okamoto et al [4] proposto, per la prima volta, un possibile ruolo della podoplanin in tumorale invasività dei tumori odontogeni keratocystic, ulteriori indagini sono state condotte per comprendere l'esatta funzione di questa proteina nella patogenesi e la crescita di questi tumori benigni [5, 8-10, 17]. Tsuneki et al. [17] verificato che le cellule positive podoplanin si trovano nel centro di proliferazione cellulare dei tumori odontogeni keratocystic suggeriscono che questa proteina agisce come uno dei regolatori chiave nel processo proliferativo di questo tumore. Allo stesso modo, la partecipazione di podoplanin in invasione locale dei tumori odontogeni è stata rafforzata dai nostri risultati precedenti [9]. Abbiamo dimostrato la correlazione tra l'espressione podoplanin e l'indice di proliferazione cellulare nei tumori odontogeni keratocystic [9]. Inoltre, un interessante studio di Zhang et al [10] ha dimostrato che nei tumori odontogeni keratocystic, conservativamente trattati con decompressione, c'è stata una significativa perdita o la riduzione della espressione podoplanin nell'epitelio odontogenico. In radicolari e folicullar cisti, Zustin et al [5] espressione trovato podoplanin più omogenea, diffusa a citoplasma e membrana in basale epiteliale e lo strato parabasali. Come podoplanin è correlata con altre proteine coinvolte nella proliferazione cellulare e l'invasione tumorale [9, 17], la sua downregulation può essere causa di attività limitata dell'epitelio odontogenico dopo l'approccio chirurgico [10].
Nonostante il fatto che la funzione esatta di podoplanin nei tumori odontogeni è poco conosciuta e in gran parte sconosciuto, i risultati del presente studio presi insieme con la nostra precedente inchiesta [9] e quelli di altri autori [5, 17, 8, 10] suggeriscono fortemente che questa proteina è coinvolta nella locale invasione e nella crescita espansiva dei tumori odontogeni keratocystic, probabilmente orchestrare l'attività citoscheletro epiteliale odontogeno.
un possibile meccanismo proposto è che podoplanin lega ezrin e, a valle, segue la fosforilazione di GTPasi RhoA-[7]. Questo percorso di segnalazione promuoverebbe la riorganizzazione del citoscheletro di actina e indurre la formazione di proiezioni filopodi-like, promuovendo il movimento cellulare [13]. Quindi, al fine di verificare se podoplanin e ezrin sono co-localizzate nei tumori odontogeni keratocystic, abbiamo progettato il presente studio.
Ezrin, un membro della famiglia di proteine ERM, esercita funzioni primordiali relative alla regolazione del movimento cellulare e struttura per trasduzione segnali tra la membrana plasmatica ed il citoscheletro actina [14]. Ezrin è essenziale per molti processi cellulari fisiologici tra cui il regolamento del citoscheletro di actina, manutenzione di forma delle cellule, l'adesione, la motilità e la modulazione delle vie di trasduzione del segnale [14].
In testa e carcinomi a cellule squamose del collo, Ezrin è stato identificato come una molecola chiave nella progressione tumorale e comportamento metastatico delle cellule neoplastiche ed è stato correlato con scarso esito [18-21], analogamente a podoplanin [22]. Tuttavia, per quanto di nostra conoscenza, questa è la prima prova che ha confermato la immunoexpression di ezrin in tumori benigni odontogeni keratocystic.
I risultati qui presentati hanno mostrato assenza di ezrin membranosa a 55.56% dei tumori odontogeni keratocystic e, quando presenti, questa proteina è stata principalmente osservata nella membrana degli strati non proliferativa sovra-basale (Figura 2). Da che possiamo ipotizzare che ezrin può essere promuovere l'adesione cellulare, come similmente osservato in non proliferanti cellule squamose della mucosa orale umana [18, 20, 21].
Inoltre, la maggior parte dei tumori odontogeni (83.33% ) hanno mostrato forte espressione citoplasmatica ezrina soprattutto nello strato basale dell'epitelio odontogeno. È interessante notare che il citoplasmatica ezrin riflette la sua forma attivata [18, 20, 21] e, nel cancro orale, questo modello di ezrin citoplasmatica è stata associata con fenotipo invasivo e comportamento più aggressivo di cellule maligne [18-21]. Questi risultati suggeriscono che attivato ezrin è necessaria per la proliferazione e /o l'invasione delle cellule odontogeniche volta sua positività citoplasmatica è stato trovato principalmente negli strati basali di tumori odontogeni keratocystic, la regione responsabile per la crescita tumorale.
La distribuzione dei ezrin in tumori keratocystic odontogeni era più eterogeneo di quello del podoplanin (tabelle 1 e 2) e statisticamente sono state osservate differenze significative tra la localizzazione di ezrin membranosa e podoplanin citoplasmatica o di membrana (tabella 3). È stato precedentemente riportato che ezrin è nettamente fosforilata in presenza di podoplanin sovraespressione [13]. Questa interazione di podoplanin e ezrin è responsabile di molti degli effetti sul citoscheletro, contribuendo ad aumentare la motilità cellulare [13]. Inoltre, vi è la prova che la funzione ERM nell'organizzazione del citoscheletro è mediato attraverso la sua capacità di legare actina e di regolare GTPasi RhoA-fosforilazione [13]. È interessante notare che i tumori odontogeni keratocystic presentati forte podoplanin membranosa ed espressione ezrina citoplasmatica, che corrispondono alle forme attivate di entrambe le proteine. Il podoplanin forma attivata (membranosa) è stato in gran parte trovato nello strato basale, indicando una co-localizzazione di active-ezrin e attivo-podoplanin nelle aree altamente attivi su tumori odontogeni keratocystic. Tuttavia, questa correlazione non era statisticamente significativa, probabilmente a causa del basso numero di tumori negativi (0 per podoplanin membranosa e 2 per ezrin citoplasmatica), che non permette di stabilire un rapporto associativo (Tabella 4).
Conclusioni
in sintesi, abbiamo prima relazione che ezrin presenta forte espressione membranosa nello strato sopra-basale e forte espressione citoplasmatica nello strato basale di tumori odontogeni keratocystic. Così, la nostra indagine suggerisce un ruolo per ezrin e podoplanin nei tumori odontogeni keratocystic e le loro interazioni molecolari devono essere ulteriormente esplorato in questi tipi di tumori.
Consenso
Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico e di ricerca da Bauru Scuola di Odontoiatria - Università di San Paolo. CAAE:. # 03924312.0.0000.5417
Abbreviazioni
ERM:
Ezrin, radixin e moesin
GTP-ase:
Guanosine- trifosfatasi.
dichiarazioni
Ringraziamenti
Vorremmo riconoscere la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (sovvenzioni # 2012 /13.411-6 e # 2013 /16.999-7) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnologico per sostenere questo studio.
autori fascicoli presentati originali per
di seguito sono riportati i link ai file degli autori originali inviati per le immagini. 'file originale per la figura 1 12903_2014_474_MOESM2_ESM.tif Autori 12903_2014_474_MOESM1_ESM.tif autori file originale per la figura 2 interessi in competizione
Gli autori dichiarano di non avere interessi in gioco.
contributi degli autori
ODT contribuito alla concezione e il design di questo progetto, l'interpretazione critica di dati e la revisione critica del manoscritto. DSLP effettuata acquisizione dati, analisi e interpretazione. AA ha contribuito con l'analisi dei dati, la redazione e la presentazione del manoscritto. TKC anche disegnato il progetto, ha contribuito con l'acquisizione, l'analisi dei dati e la revisione del manoscritto. NS contribuito alla progettazione del progetto e anche con profili immunoistochimici per questo studio. LJRP ha contribuito con il disegno dello studio, l'analisi critica dei dati statistici e di interpretazione. SFA ha fornito le infrastrutture ausiliarie necessarie per effettuare lo studio e ha contribuito alla ideazione e progettazione del progetto. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.
