dentale
Abstract
sfondo
La carie dentale è la malattia batterica più comune che colpisce l'umanità. metodi di valutazione del rischio carie, l'identificazione di biomarcatori e strategie di sviluppo di vaccini devono essere sottolineati per controllare l'incidenza della malattia in gran parte prevenibili. recettori di pattern recognition, come il toll-like receptor (TLR) sono stati implicati come modulatori di interazioni ospite-microbica. Solubile TLR-2 e il suo co-recettore, CD14 identificato nella saliva possono legare le componenti della parete cellulare dei batteri cariogeni e modulare il processo di malattia. L'obiettivo di questo studio è quello di determinare il potenziale di salivare sTLR-2 e sCD14 come biomarcatori di attività carie e misure indirette della carica batterica cariogeni.
Metodi
non stimolate tutta la saliva sono stati raccolti da una ventina di carie liberi e venti carie bambini attivi di età compresa tra 5 e 13 anni tra. La concentrazione di sCD14 e sTLR-2 insieme a quella della citochina IL-8 segnalati per essere aumentato in carie dentale è stata valutata mediante l'enzima saggio di immunoassorbimento.
Risultati
Mentre il livello di sCD14 e quella di IL- 8 era equivoco tra i due gruppi, la concentrazione sTLR-2 in carie saliva attivo era significativamente più alta rispetto a quella della carie saliva gratuito.
Conclusioni
il sTLR-2 nella saliva potrebbe servire come un potenziale biomarcatore per l'attività della carie.
Parole
saliva Solubile toll like receptor 2 La carie dentale Biomarker elettronico materiale supplementare
La versione online di questo articolo (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-108) contiene materiale supplementare, è disponibile per gli utenti autorizzati.
Sfondo
la carie dentale è una malattia infettiva causata da multifattoriale complesse interazioni tra i batteri che producono acido, carboidrati fermentabili e fattori dell'ospite. Pur essendo in gran parte prevenibili, rimane come la malattia cronica più diffusa a livello mondiale [1]. analisi sistematiche recenti suggeriscono che l'incidenza della carie presenta una tendenza all'aumento bambini di 2-4 anni negli Stati Uniti [2]. Ci sono prove per la maggiore prevalenza negli adulti a basso status socio-economico nei paesi europei. In via di sviluppo la prevalenza è in aumento sia nei bambini e negli adulti [3].
Diagnosi precoce di lesioni white-spot, arrestando demineralizzazione e promuovere la rimineralizzazione sono alcuni dei metodi clinici di prevenzione attualmente utilizzati nella gestione della carie dentale [4]. Inoltre notevole enfasi viene posta sullo sviluppo di strategie efficienti di valutazione del rischio carie per determinare la probabilità di un individuo sviluppare nuova lesione cariosa e /o per determinare lo stato del processo della carie sulle superfici dentali individuali [4, 5]. Come malattia dei tessuti mineralizzati dei denti, la patogenesi della carie comporta demineralizzazione dello smalto da batteri che producono acido e la distruzione della sostanza organica conseguente cavitazione [1, 4].
Saliva è riconosciuto come una ricca fonte di fattori dell'ospite capaci di modulare il processo di carie [6, 7]. I progressi tecnologici hanno aiutato nella caratterizzazione della proteomica salivari e peptidomics con l'identificazione di 1444 proteine e peptidi 11893 rispettivamente [8]. Queste proteine /peptidi appartengono a diverse classi funzionali come quelli coinvolti nella risposta allo stimolo /stress, funzioni antiossidanti, le funzioni catalitiche e le autorità di regolamentazione degli enzimi [8, 9]. Diversi componenti salivari sono stati valutati per l'associazione con la carie dentale. Mentre alcuni mostra debole associazione, altri erano equivoci tra normale e la carie saliva attivo [9-12]. Valutazione delle glicoproteine salivari con oligosaccaridi specifici mostrato che livelli elevati di selezionare oligosaccaride che facilitano la colonizzazione batterica alla superficie dei denti correlano con la carie incidenza in giovani adulti [13]. livelli salivari di agenti antimicrobici quali defensine alfa, staterina e cistatina S sono state proposte come potenziali fattori di rischio per lo sviluppo di carie [10, 14].
toll-like receptor (TLR) sono germinale recettori che riconoscono pattern microbiche conservate in genere codificato condivisa da grandi gruppi di microrganismi. Attualmente 13 TLR mammiferi e molti dei loro ligandi sono noti [15]. Funzionamento da soli o in concerto con specifiche co-recettori nel riconoscere modelli microbici l'atto TLR come guardiani campionamento costantemente l'ambiente e suscitare risposte per prevenire /controllo delle infezioni [15, 16]. TLR-2 e TLR-4 hanno dimostrato di riconoscere il peptidoglicano di Gram positivi e il lipopolisaccaride dei batteri Gram negativi rispettivamente da soli o in associazione con il comune co-recettore CD14 [17, 18]. Odontoblasti localizzati sulla superficie dentino-pulpare in denti sani hanno dimostrato di esprimere TLR-2 e TLR-4. A seconda della natura della progressione della carie risposta odontoblastic è o soppressa con la formazione di dentina reazionaria o accelerato portando a pulpare infiammazione [19, 20]. invasione microbica della dentina ha dimostrato di potenziamento TLR-4 in odontoblasts e mediare secrezione di TGF-β facilitare sintesi del collagene. Inoltre TLR-4 segnalazione in odontoblasts anche upregulate metalloproteinasi della matrice-2 promuovere la scissione della dentina sialophosphoprotein (DSPP) per sialoproteina dentale (DSP), che costituisce un sito di nucleazione per la formazione di cristalli hydroxyapeptite nel collagene di nuova formazione [19]. La stimolazione di odontoblast come cellule con componenti della parete cellulare dei batteri Gram-positivi ha suscitato citochine e chemochine secrezioni in modo dipendente TLR-2 [20]. Elevati livelli di citochine IL-6, TNF-α e IL-8 sono state osservate in carie saliva attivo [21].
Mentre in primo luogo a membrana associata, di recente forme solubili di alcuni TLR sono stati identificati nei fluidi corporei. È stato suggerito che i TLR solubili funzione di sequestrare patogeni [22-25]. Recentemente, noi e altri hanno segnalato la presenza di solubili sCD14 e sTLR-2 nella saliva [24, 26]. TLR-2 ha dimostrato di riconoscere il peptidoglicano e l'acido lipotechoic di Streptococcus mutans
, i batteri cariogeni più comuni [27]. Notevole la prova suggerisce una forte correlazione tra la maggiore presenza di batteri cariogeni nel biofilm placca e numeri elevati degli stessi batteri nella saliva [6, 10]. Perciò abbiamo ipotizzato che il livello di sTLR-2 e sCD14 nella saliva di carie individui attivi produrrà una misura indiretta della carica batterica e fungere da biomarker di attività della carie. I nostri dati suggeriscono che il sTLR-2 è più alta in tutta la saliva non stimolata (UWS) dei bambini con la carie attivi lesioni.
Metodi
popolazione di studio
In questa prospettiva non-studio clinico randomizzato quaranta bambini tra i 6 e 12 anni di età segnalazione alle cliniche pediatriche della Indiana University School of Dentistry sono stati reclutati dopo aver ottenuto il consenso informato dei pazienti e tutore. Lo studio è stato approvato dal Institutional Review Board della Indiana University Purdue University di Indianapolis. I campioni sono stati raccolti solo da bambini senza malattia nota per via orale o sistemica diverso da carie e denti estratti. Esami orali di bambini sono stati eseguiti e l'attività della carie registrati. Venti bambini (13 maschi e 7 femmine) sono stati carie gratuite e venti bambini (12 maschi e 8 femmine) erano carie attive che presentano quattro a otto lesioni cariose che necessitano di restauro.
Raccolta e il trattamento
Tutti i bambini sono stati istruiti per evitare di esempio mangiare e bere per almeno 2 ore prima della raccolta della saliva come descritto [24, 28]. Dopo aver sciacquato la bocca brevemente con acqua, non stimolate tutta la saliva (UWS) è stato raccolto da ogni bambino con il metodo sbavando passivo per cinque minuti in tubi pre-refrigerati. I campioni sono stati trasportati in ghiaccio al laboratorio immediatamente per l'elaborazione. Ogni campione è stato chiarito per centrifugazione a 4000xg a 4 ° C per 10 minuti e conservato in tre aliquote a -80 ° C in CompleteTM Protease Inhibitor Cocktail (Roche, Mannheim, Germany) fino ad ulteriore analisi.
Totale concentrazione proteica
il contenuto totale di proteine di campioni pre stata misurata con il metodo Bradford che coinvolge legame di Commassie colorante blu alle proteine [24, 25]. La forma della proteina-colorante blu è stata rilevata a 595 nm con spettrofotometro (Gensys5 spettrofotometro, corp termoelettronico, CA). La concentrazione della proteina in ciascun campione è stata determinata contro una curva standard sviluppato utilizzando concentrazione nota di albumina di siero bovino
Saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA)
Per determinare sCD14 nella saliva un panino kit ELISA (R & amp;. D Systems , Minneapolis, MN) è stato utilizzato in base alle raccomandazioni del fabbricante. TLR-2 anticorpo policlonale anti-umana (clone: Imgenex Corporation, San Diego, CA) è stato utilizzato per il rilevamento di TLR-2. Tutti i campioni UWS sono stati esauriti di amilasi e immunoglobuline incubando in serie con l'anticorpo anti-umano amilasi monoclonale (mAb) (1: 2500, catalogo # ab8944; Abcam, Cambridge, MA, USA) e di proteine G perline (Miltenyi Biotec Inc Auburn, CA ) a 4 ° C [24]. Il contenuto proteico dei campioni predepurata è stato determinato come sopra e predepurata UWS a 1 mg di concentrazione /ml è stata utilizzata per la misurazione sCD14 e sTLR-2 livelli [25]. La preincubazione della UWS sia con anti-TLR2 monoclonale (clone: 1030A5.138, Imgenex Corp, San Diego, CA, USA) (0,5 mg /ml) o con TLR-2 peptidi (1 mg /ml) è stata effettuata per valutare la specificità del legame. Bound CD14 e TLR-2 è stata rilevata con perossidasi di rafano (HRP) coniugato anti-topo IgG seguita da TMB substrato (Pharmingen, San Diego, CA). Assorbanza a 450 nm è stata letta in un lettore di micropiastre (modello 680: Biorad Laboratories, CA). La concentrazione di sTLR-2 o sCD14 in pg /ml di proteine salivari è stata determinata utilizzando una curva standard di purificata ricombinante CD14Fc umana e TLR-2FC (R & amp; D Systems) di concentrazione nota. la concentrazione di IL-8 nei campioni di saliva chiarite sono stati misurati utilizzando il kit BD OptEIA3 ™ ELISA.
Analisi statistica
differenze nella concentrazione di IL-8, CD14 e TLR-2 tra le carie liberi e carie gruppi attivi sono stati determinati da t-test di studenti. valore di p inferiore a 0,05 è stato considerato significativo.
Risultati e discussione
Nonostante i progressi nei metodi di diagnosi precoce e misure di prevenzione efficaci La carie dentale rimane una malattia cronica molto diffusa in tutto il mondo. La crescente incidenza tra i bambini nei paesi sviluppati costituisce un inquietante preoccupazione per la salute [2, 3]. I dati demografici della popolazione in studio sono riportati in Tabella 1. La concentrazione di proteine totali di saliva umana è stato dimostrato che mostra grandi variazioni che vanno da 0,4 mg /ml a 7,1 mg /ml [29, 30]. Nel nostro studio di coorte la concentrazione di proteine totali misurata 6.24 +/- 1.98 mg /ml a carie saliva gratuita e 5.92 +/- 2.37 mg /ml in carie attiva saliva (Figura 1A) .table 1 I dati demografici della popolazione in studio
dati clinici
Numero reclutato
Età (anni)
Maschio
femminile
carie dentali
12
8
8.76 +/- 3.42
sani di controllo
13
7
7.77 +/- 2.7
figura 1 concentrazione totale di proteine nella saliva: Chiarito tutta la saliva è stata valutata per (a) contenuto totale di proteine mediante spettrofotometria e (B ) la concentrazione di IL-8 da ELISA. è stata osservata alcuna differenza significativa tra la carie libere e le carie gruppi saliva attivi.
per il crescente numero di proteine salivari si aggiungono le forme solubili di recettori di pattern recognition, la sTLR-2, sCD14 e sTLR-4 [25, 26 , 31]. La concentrazione di sTLR-2 nella saliva parotidea 'stato segnalato ad essere diversi pieghe superiore in tutta la saliva [31]. La fonte di sTLR-2 potrebbe essere o secrezione attiva dalla ghiandola e /o il risultato di scissione extracellulare del recettore di membrana legata. Abbiamo osservato che la concentrazione di sTLR-2 carie saliva attiva (29,5 +/- 3 pg /ml) era significativamente più elevata di quella della carie saliva libera (24,8 +/- 0,6 pg /ml) (Figura 2B). Segnalazione via TLR in cellule ospiti induce la secrezione di citochine [15]. In precedenza Gornowicz et al., Hanno riportato elevati livelli di IL-8 salivare in carie dentale [21]. Abbiamo osservato che la concentrazione salivare di IL-8 non differiva in modo significativo tra la carie liberi e carie saliva attiva (Figura 1B). L'osservazione variabile tra i due studi potrebbe essere attribuita alle differenze di età e la natura del campione (amilasi e Ig impoverito vs. impoverito). La concentrazione di sCD14 nella saliva è ambigua in entrambi i gruppi; compresa tra 509 pg /ml e 1443 pg /ml a carie gruppo libero e tra 609 pg /ml e 1829 pg /ml a carie attivo gruppo (Figura 2A). In precedenza Bergandi et al., Ha riferito completa assenza di sCD14 nella saliva nei bambini affetti da due a otto lesioni cariose [28]. L'uso di saliva pre-pulito e il metodo utilizzato per misurare sCD14 (Western Blot contro panino ELISA) potrebbe attribuire alle differenze osservate tra il rapporto Bergandi e il nostro studio. Figura 2 sCD14 e concentrazione sTLR-2 nella saliva: saliva purificati è stato impoverito di alto peso molecolare abbondanti proteine, amilasi e immunoglobuline, come descritto nella sezione Metodi per aumentare la sensibilità di rilevazione di meno abbondanti sCD14 e sTLR-2. Il livello di (A) sCD14 e (B) sTLR-2 è stato determinato mediante ELISA. * Rappresenta p & lt; 0.05.
Sulla base della sua forte associazione con la carie incidenza più studi hanno valutato i livelli salivari di S. mutans Compra di predizione del rischio di carie con risultati variabili [1, 32]. L'eziologia polimicrobica della carie dentale, nonché l'interazione tra le proteine salivari e S. mutans
potrebbero contribuire alla variabilità [30, 33]. Quattro principali tipi di interazione proteina-salivare microbi sono stati osservati in vitro. Questi includono l'aggregazione, l'adesione, l'inibizione /cell-uccisione, e la nutrizione [33]. Si ipotizza che l'aumento osservato in sTLR-2 in carie saliva attivo può rappresentare una misura di accoglienza per la lotta contro l'aumento del Gram + ve batteri cariogeni. Ciò suggerisce che la saliva di livello sTLR-2 può rappresentare un biomarker efficiente per l'attività della carie. L'ampia variazione nella concentrazione sTLR-2 in carie saliva attivo potrebbe essere dovuto nella misura di carie.
Conclusioni
La carie dentale è una malattia complessa, la gravità clinica della quale dipende dall'interazione tra i microbi orali, la disponibilità di carboidrati fermentabili e fattori di accoglienza nella saliva. Questo rende l'identificazione dei fattori di rischio predittivi per il processo carious molto difficile [5, 6]. In questa relazione abbiamo osservato che due proteine solubili, sCD14 e sTLR-2, che agiscono a livello di interfaccia ospite microbico sono modificati in carie saliva attivo con un seguito che rappresenta un potenziale biomarcatore per l'attività della carie. Studi futuri correlare i sTLR-2 livelli con la conta batterica cariogeni nella saliva
Abbreviazioni
UWS:.
non stimolate tutta la saliva
TLR:
Toll like receptor.
dichiarazioni
Riconoscimento
Gli autori riconoscono il sostegno fornito per Alyssa Zhao dalla Indiana CTSI per completare il programma di ricerca estivo.
degli autori presentati originale file per
di seguito sono riportati i link ai file inviati originali degli autori per le immagini. 'file originale per la figura 1 12903_2014_443_MOESM2_ESM.tif Autori 12903_2014_443_MOESM1_ESM.tif autori file originale per la figura 2 interessi in competizione
Gli autori dichiarano di non avere alcun interesse in competizione contributi
autori
AZ:. Alyssa è un alto sophomore scuola che ha effettuato gli esperimenti ELISA come parte del programma di borse di studio di ricerca estivo, il Seme di progetto, co-sponsorizzato dalla American Chemical Society e l'Istituto clinico Traduzioni Scienze Indiana. Ha anche scritto la prima bozza della sezione "Sfondo". CB: Corinne è un assistente di ricerca di laurea che ha aiutato Alyssa nella conduzione degli esperimenti ELISA, più in analisi dei dati. Ha partecipato attivamente alla elaborazione del campione. Ha anche partecipato per iscritto manoscritto. JC: Dr. Chin è il dentista pediatrico e assistito nel reclutamento della popolazione di studio e di raccolta dei campioni. MS: è il ricercatore senior supervisione del progetto, tra cui l'ottenimento di approvazioni etiche, disegno sperimentale, e l'analisi dei dati e la preparazione del manoscritto. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.
