Abstract
sfondo
metalloproteinasi della matrice (MMP) degradare la matrice extracellulare (ECM) e regolano il rimodellamento e la rigenerazione del tessuto osseo. matrice derivato proteico dello smalto (EMD) è stato utilizzato clinicamente per la rigenerazione parodontale, anche se i suoi meccanismi molecolari non sono chiare. Abbiamo valutato il ruolo delle metalloproteinasi della matrice (MMP) nella regolazione della degradazione EMD-dipendente di gelatina sulla linea cellulare oeoblast simile MG63.
Metodi
cellule MG-63 (linea cellulare degli osteoblasti) sono state incubate con 100 ug /ml EMD proteine in presenza o assenza di inibitore tissutale MMP-2 per 20 ore seguita da incubazione su piastre DQ-gelatina rivestita per 4 ore. MG-63 cellule (1 × 10
6) sono state preincubate con SB203580 per 30 minuti a 37 ° C e sono stati quindi posti in 100 ug /ml di proteine EMD per 24 h. mezzi condizionati sono stati raccolti e rilevati da analisi Western Blot
. Risultati
proteine EMD maggiore degradazione mediata da cellule di gelatina, che è stata inibita dalla inibitore MMP TIMP-2. Inoltre, MMP-2 è stato prodotto da MG63 in risposta alle proteine EMD in modo MAPK-dipendente P38. Inoltre, il blocco di attivazione di p38 MAPK da SB203580 generazione ha inibito significativamente la forma attiva di MMP-2.
Conclusione
pathway MAPK p38 promuove l'espressione di MMP-2 nel EMD attivato osteoblasti, che a sua volta stimola la rigenerazione parodontale degradando . proteine della matrice di tessuto connettivo parodontale
materiale supplementare elettronica
La versione online di questo articolo (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-85) contiene materiale supplementare, che è disponibile per gli utenti autorizzati.
sfondo
due principali obiettivi della terapia parodontale stanno rigenerando il legamento parodontale (PDL) e la ricostruzione alveolare osso perso a causa di malattia parodontale. modelli sperimentali precedenti e studi clinici hanno dimostrato che le proteine (EMD) smalto matrice di derivazione promuove la generazione del PDL, cemento radicolare e osso alveolare [1-3]. proteine EMD attiva anche cellule osteoblasti in vitro, che porta ad una risposta di guarigione [4] e la generazione di fosfatasi alcalina [5]. Inoltre, la proteina EMD regola la produzione di metalloproteinasi della matrice (MMP) e inibitori tissutali delle MMP (TIMP) nel liquido crevicolare [6, 7].
Bone è continuamente rinnovato, e la quantità di nuovo osso dipende dall'equilibrio tra formazione dell'osso ed il riassorbimento, che sono mediati da osteoblasti, osteoclasti e osteociti. matrice extracellulare Disturbed (ECM) del fatturato porta alla perdita di tessuto osseo e le sue patologie associate, come la parodontite. Osteoblasti sono cellule ossee-rimodellamento che differenziano dalle cellule staminali mesenchimali e secernono proteine ECM, che è poi mineralizzata dagli osteoblasti. MMPs sono zinco endopeptidasi atomo-dipendente che svolgono un ruolo primario nella degradazione delle proteine ECM [8]. Osteoblasti e osteociti producono anche MMP come MMP-2 e MMP-13 [7, 9]. La funzione di MMP-2 è a degradare le proteine ECM e promuovere la ristrutturazione e la rigenerazione del tessuto osseo [10].
Proteine chinasi attivate da mitogeni (MAPK) sono importanti enzimi segnale trasduzione coinvolti nella regolazione cellulare. Recenti studi usando un p38 mitogeno-activated protein chinasi (MAPK p38) inibitore hanno dimostrato che la stimolazione della sintesi di citochine MMP-2 è coinvolta nella p38 MAPK segnalazione [11, 12].
Lo scopo di questo studio era di chiarire gli effetti della proteine EMD sulla produzione e l'attivazione di MMP-2 utilizzando una linea cellulare degli osteoblasti-simili, cioè, MG-63. Abbiamo scoperto che la proteina EMD promosso la degradazione di gelatina su MG-63 cellule e migliorato l'attivazione di MMP-2 in cellule MG-63. La proteina EMD vie di segnalazione dipende p38 MAPK. Questi risultati suggeriscono che la regolamentazione selettiva di MMP-2 produzione e successiva attivazione di MMP-2 dalla proteina EMD in cellule MG-63 conduce al rimodellamento e la rigenerazione del tessuto connettivo parodontale.
Metodi
cellulare linea
osteoblasti ( linea di cellule MG-63; American Type Culture Collection, Rockville, MA) sono stati mantenuti in modificata mezzo di Eagle Dulbecco (DMEM) supplementato con 10% inattivato al calore FBS (Equitech-Bio Inc., TX, USA), 2 mM glutammina e 100 unità /ml di penicillina /streptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA) a 37 ° C in atmosfera umidificata al 5% CO 2 in aria.
DQ gelatina degrado saggio
vetrini sono stati rivestiti con 100 ug /ml substrato di fluorescenza spento DQ-gelatina (Molecular Probes, Eugene, OR). MG-63 cellule sono state incubate con 100 ug /ml di proteine EMD (Seikagaku-kogyo Corp., Osaka, Giappone) in presenza o assenza di inibitore tissutale di metalloproteinasi-2 (TIMP-2; Dainippon Pharm Co., Toyama, Giappone) per 20 h, seguito da incubazione su DQ-gelatina rivestite piastre per un periodo di 4 ore. Le cellule sono state fissate con paraformaldeide al 2% in PBS. I vetrini sono stati montati con dei copri con glicerolo /PBS, ed esaminato con a 488 nm (eccitazione) e 533 nm (emissione) con una Olympus LSM-GB200 (Olympus, Tokyo, Giappone), dotato di una lente immersione in olio. interferenza differenziale contrasto (DIC) è stato utilizzato per visualizzare le cellule in coltura sulla matrice.
analisi Western Blot
MG-63 (1 × 10 6) cellule sono state preincubate con 100 ng /ml 5 micron SB203580 (sostanze chimiche Inc., Darmstadt, Germania) per 30 minuti a 37 ° C, e MG-63 cellule sono state poi poste in DMEM privo di siero con 100 mg ml proteina /EMD per 48 h. mezzi condizionati sono stati raccolti, centrifugati per rimuovere i detriti, e concentrati in Amicon concentratori Centriprep (Invitrogen) fino a 10 volte. Le cellule sono state incubate in terreno Eagle esente da siero con 100 mcg di proteine /ml EMD per 48 h. MG-63 cellule preparate come descritto sopra sono state lisate con tampone SDS-campione (80 mM Tris-HCl, 3% SDS, 15% glicerolo e 0,01% blu di bromofenolo) e sonicato brevemente per taglio DNA. I campioni sono stati separati su 10% SDS poliacrilammide (SDS-PAGE) in condizioni riducenti. Le proteine sono state trasferite a elettroforesi polivinilidene (PVDF, Immobilon-P) membrane (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO). Le membrane sono state incubate per 1 ora con anti-fosfo-p38 anticorpi (Cell Signaling Technology Danvers, MA) o di anticorpi anti-p38 (Cell Signaling Technology) in PBS contenente 0,05% di Tween-20 e il 10% Blockace (Dainippon Pharm Co., Toyama, Giappone). Coniugato con perossidasi anticorpo secondario (Amersham Biosciences, Piscataway, New Jersey) è stato utilizzato in una diluizione 1: 1.000 e bande immunoreattive sono state visualizzate con Super Signal ovest pico substrato chemiluminescente (Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL). I segnali su ogni membrana sono stati analizzati da VersaDoc 5000.
trascrizione inversa-reazione a catena della polimerasi (RT-PCR)
RNA totale è stato isolato da cellule MG-63 cellule kit RNeasy (QIAGEN, Valencia, CA). MG-63 cellule sono state poi poste in DMEM privo di siero con 100 mcg di proteine /ml EMD per 12 h. Dopo denaturazione di RNA totale a 70 ° C per 10 minuti, il cDNA è stato sintetizzato con oligo-dT Primer incubando con trascrittasi inversa (Qiagen) a 50 ° C per 30 min. I primer per MMP-2 erano 5'-TGGTTTTCCTCCATCCAGTGG-3 '(in avanti) e 5'-CAGGTTGTCTGAAGTCACTGC-3' (indietro). I primer per GAPDH erano 5'-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3 '(in avanti) e 5'-TCC ACC ACC TTG CTG CTG TA-3' (reverse). reazione a catena della polimerasi sono state effettuate con Pfu polimerasi (Qiagen) avviata da 1 ciclo a 95 ° C per 15 minuti seguiti da 30 cicli a 94 ° C per 45 sec, 55 ° C per 45 sec, 72 ° C per 1 min e 1 ciclo a 72 ° C per 10 minuti per estensione finale. I prodotti di PCR sono stati caricati su gel di agarosio, e colorati con bromuro di etidio. Le bande sono stati analizzati utilizzando il software IS-3400 AlphaImager ™. Brevemente, IDV è stata misurata come la somma di tutti i valori dei pixel dopo la correzione background in ciascuna banda. I valori (AVG) di ciascuna banda sono stati calcolati come IND /AREA, dove AREA è la dimensione della regione che è stato misurato. I risultati sono riportati i valori di AVG MMP1 /AVG GAPDH in ogni punto.
Risultati
EMD proteina-stimolati cellule MG-63 hanno promosso la degradazione di gelatina
Al fine di determinare se proteine EMD è in grado di facilitare la degradazione gelatina osteoblasti-mediata, osteoblasti umani sono stati incubati in presenza o assenza di 100 ug /ml di proteine EMD e piastrate su 100 ug /ml DQ-gelatina rivestite piastre come descritto nei Metodi
( Figura 1). Degradazione di DQ-gelatina è stata visualizzata nella sezione ottica come un segnale fluorescente verde. Sebbene non stimolati MG-63 cellule non producono alcun segnale visibile (pannelli A e C in figura 1), proteina EMD ha aumentato significativamente la degradazione della gelatina (pannelli D e F di figura 1). Poiché la gelatina è un substrato per MMPs, è possibile che TIMP-2 potrebbe inibire la degradazione mediata da cellule di gelatina. Per verificare questa ipotesi, ricombinante TIMP-2 è stata incubata con EMD e cellule MG-63 e poi coltivate su DQ-gelatina. TIMP-2 quasi completamente degradazione eliminato da EMD stimolata-MG-63 cellule (pannelli G e I in figura 1), indicando che la degradazione di gelatina è mediata dall'attività catalitica di MMP, che è un passaggio chiave nella promozione della parodontale connettivo rimodellamento tissutale. Figura 1 proteina EMD migliora MG-63 cellule degradazione di gelatina. MG-63 cellule sono state incubate in presenza (D, E, F) o assenza (A, B, C) di 100 ug /ml EMD per 20 h, e sono stati poi incubati su vetro rivestito con substrato fluorescente 100 ug /ml bonificato DQ-gelatina per un ulteriore 4 h. TIMP-2 (20 mM) è stato incubato con EMD proteine e cellule MG-63 come descritto sopra (G, H, I). Degradazione di gelatina (fluorescenza verde) è stato rilevato da un microscopio confocale (Eccitazione: 488 nm; emissione: 530 nm). Le immagini sono state ottenute a × 40 ingrandimenti (da A a I). Differenziale contrasto interferenziale (DIC) sono mostrati immagini. La quantificazione di GFP in Pannelli A-I è stato eseguito utilizzando densitometricamente immagine NIH software J. La densità è raffigurato come dire GFP per cella.
Proteine EMD una maggiore attività di MMP-2 su cellule MG-63
Abbiamo precedentemente dimostrato che cellule MG-63 spontaneamente prodotte MMP-2, ma non MMP-9 [10]. Come mostrato in questo studio, proteine EMD migliorato degradazione di gelatina in cellule MG-63 (Figura 1). Pertanto, abbiamo provato anche se la proteina EMD influenzato la produzione di MMP-2 100 mcg /ml piastre gelatina rivestite di MG-63 cellule. EMD proteine (100 mcg /ml) ha aumentato la produzione di 66-kDa, 68 kDa e 46 kDa MMP-2, che corrispondono alle forme pro, intermedi e attivi di questo enzima, rispettivamente. È importante sottolineare che, quando le cellule proteine attivate EMD sono state coltivate su piastre di gelatina rivestita, generazione della forma attiva di MMP-2 è stato anche osservato (Figura 2A). Questi risultati sono stati confermati da studi di RT-PCR per dimostrare che il livello di trascrizione di MMP-2 mRNA è stata aumentata in presenza di EMD rispetto al non stimolate MG-63 cellule (Figura 2B). Figura 2 L'espressione di MMP-2 da EMD MG-63 proteine cellule stimolate. (A) MG-63 cellule sono state incubate in senza siero Aquila contenente 100 mg ml di proteine /EMD per 24 ore e media condizionati e lisati cellulari totali sono stati preparati come descritto in Metodi
. mezzi concentrati erano separati da 8% SDS-PAGE, cancellato con l'anti-MMP-2 anticorpi e visualizzati con Super Signal ovest pico substrato chemiluminescente. marcatori molecolari (kDa) sono mostrati nella colonna di sinistra. La quantificazione di MMP-2 nel pannello superiore è stata effettuata utilizzando densitometricamente immagine NIH software J. altezze del picco di ogni densità sono raffigurate come percentuale del massimo valuel. (B) L'RNA totale è stato isolato da MG-63 cellule coltivate in presenza di EMD per 24 he sottoposta ad esperimenti di RT-PCR utilizzando primer specifici per MMP-2 (alto) o GAPDH (in basso).
P38 MAPK percorso è coinvolto in attività della proteina EMD-stimolata MMP-2 su cellule MG-63
studi precedenti hanno dimostrato che p38 MAPK regolato MMP-2 produzione indotta da varie citochine [13]. Pertanto, è possibile che le proteine EMD stimola anche MAP chinasi in cellule osteoblasti per indurre la produzione di MMP-2. Per verificare questa ipotesi, in primo luogo abbiamo testato se la proteina EMD è in grado di attivare p38 MAPK utilizzando l'analisi Western blotting. Quando le cellule MG63 sono state coltivate in presenza di 100 mg ml proteina /EMD su piastre di gelatina rivestita, attivazione di p38 MAPK è stata osservata in un modo dipendente dal tempo, con la fosforilazione massimo a 5 min (pannello superiore nella Figura 3A). Importo totale di proteine p38 MAPK non è stata influenzata (pannello in basso nella Figura 3A). Un inibitore specifico sintetico per p38 MAPK, SB203580, eliminato l'attivazione di questa chinasi in EMD MG-63 proteine cellule stimolate (Figura 3B), indicando inoltre l'attivazione di MAPK p38 in cellule MG-63 in presenza di EMD protein.In per caratterizzare ulteriormente il ruolo di EMD indotta da proteine p38 MAPK pathway di attivazione, cellule MG-63 sono stati pretrattati con SB203580, seguito da una stimolazione della proteina EMD. SB203580 inibiva significativamente la produzione e l'attivazione di MMP-2 da proteine EMD sulle cellule MG-63 (Figura 4). attivazione di MAPK p38 Figura 3 EMD-indotta in cellule MG-63. (A) MG-63 cellule sono state stimolate con 100 mg ml proteina /EMD per i tempi indicati a 37 ° C. Le cellule sono state raccolte, e lisati sono stati risolti in 10% SDS-PAGE e sono state trasferite a una membrana PVDF. Le membrane sono state immunoblotted con anticorpi anti-fosfo-p38 MAPK (Top News), e sono stati poi spogliato e immunoblotted con l'anticorpo p38 MAPK anti- (
in basso). marcatori molecolari (kDa) sono mostrati nella colonna di sinistra. (B) MG-63 cellule sono state trattate per 30 minuti con SB203580 (5 mM) prima della stimolazione con 100 mg ml proteina /EMD per 5 min. Le cellule sono state raccolte, e lisati sono stati risolti in 10% SDS-PAGE e trasferite su una membrana PVDF. La membrana è stata immunoblotted con anticorpi anti-fosfo-p38 MAPK (Top News), ed è stato poi spogliato e immunoblotted con anticorpi anti-p38 MAPK (
in basso). marcatori molecolari (kDa) sono mostrati nella colonna di sinistra. La quantificazione di p38 MAPK fosforilazione è stata eseguita densitometricamente e corretto contro la quantità di proteine totali p38 MAPK. altezze di picco di ogni densità sono raffigurate come percentuale del valore massimo.
Figura 4 Effetti del MEK sulla degradazione di gelatina in proteine EMD stimolati MG-63 cellule. mezzi condizionati concentrati preparati dalle cellule MG-63 non stimolate (corsia 1
), EMD proteina-stimolato cellule MG-63 (5 micron) (corsia 2
), EMD proteina-stimolato cellule MG-63 in presenza di DEMSO (corsia 3
), EMD proteina-stimolata MG-63 cellule coltivate in presenza di SB203580 (5 mM) (corsia 4
) sono stati separati l'8% SDS-PAGE. Le membrane sono state cancellati con anti-MMP-2 anticorpi e visualizzati con Super Signal ovest pico substrato chemiluminescente. markers di peso molecolare (kDa) sono mostrati nella colonna di sinistra. Gli stessi mezzi di concentrati condizionati sono state separate e trasferite su membrane. altezze di picco per ogni densità sono raffigurate come percentuale del valore massimo. percorso
P38 MAPK è coinvolto nella degradazione delle proteine gelatina-stimolata EMD da MG-63 cellule
Infine, abbiamo confermato questi risultati in studi di degradazione gelatina cellulo-mediata. MG-63 cellule sono state incubate con EMD proteine in presenza o assenza di SB203580, e sono quindi stati coltivati su matrice DQ-gelatina. Coerentemente con risultati in Figura 1, la proteina EMD favorisce la degradazione di gelatina (pannelli D, E, F, in figura 5), in confronto con stimolate MG-63 cellule (pannelli A, B, C in figura 5). Quando SB203580 è stato co-incubato con la proteina EMD, il degrado di gelatina è stato fermato, come dimostrato da una diminuzione significativa segnali fluorescenti specifiche (pannelli G, H, I nella Figura 5). Questi risultati suggeriscono che MMP-2 è un importante enzima di gelatina-degradanti prodotto da EMD osteoblasti proteina-stimolata. Figura 5 p38 MAPK sono importanti per EMD MG-63 la degradazione mediata da cellule proteina-stimolata di gelatina. Il vetro è stato rivestito con 100 ug /ml di quenched substrato fluorescente DQ-gelatina. MG-63 cellule sono state trattate per 30 min con U0126 (5 mM). Le cellule sono state incubate in presenza o assenza di 100 mg ml proteina /EMD per 20 h. Degradazione di gelatina (fluorescenza verde) è stato rilevato utilizzando un microscopio confocale (Eccitazione: 488 nm; emissione: 530 nm). Le immagini sono state ottenute a × 40 ingrandimenti (da A a I). Differenziale contrasto interferenziale (DIC) sono mostrati immagini. Densità è raffigurato come medio GFP per cella.
Questi risultati suggeriscono che la proteina stimola EMD degradazione della matrice coinvolto nella attività catalitica di MMP-2. Inoltre, il nostro studio mette in evidenza il ruolo fondamentale per le vie p38 MAP chinasi nell'indurre la produzione di MMP-2 da EMD osteoblasti proteina-stimolata.
Discussione
In questo studio, abbiamo dimostrato che la proteina stimola gli osteoblasti EMD a degradare la gelatina in vitro e che la produzione di MMP-2 è up-regolato in risposta alla stimolazione della proteina EMD. I nostri risultati suggeriscono anche che l'adesione alla gelatina aumenta la produzione di e attiva pro-MMP-2, che viene spontaneamente prodotta dagli osteoblasti. proteine EMD stimola vie di segnalazione p38 MAPK, che a sua volta, inducono la produzione di MMP-2 dagli osteoblasti. Anche se gli studi precedenti hanno dimostrato che la proteina EMD applicato a difetti parodontali viene assorbito nella superficie dentinale radice denudato e induce la rigenerazione dei tessuti parodontali [14-16], i meccanismi di questa azione rimangono in gran parte sconosciuti. A questo proposito, i nostri risultati dimostrano il ruolo centrale di MMP-2 prodotta da osteoblasti in risposta alle proteine EMD nel facilitare parodontale rigenerazione connettivo.
MMP-2 svolge un ruolo cruciale nel rimodellamento osseo e la mineralizzazione [17], e diversi studi hanno valutato i ruoli funzionali di MMP specifici [18-20]. I nostri risultati supportano ulteriormente l'importanza di MMP prodotte da EMD osteoblasti proteina-stimolato in rimodellamento osseo. Le osservazioni di degrado residua ECM in presenza di TIMP-2 possono essere spiegati con il coinvolgimento di altri proteasi come la serina proteasi. Infatti, recenti studi hanno dimostrato che gli osteoblasti esprimono superficie serina proteasi [21]. Tuttavia, l'inibizione della degradazione significativa gelatina da TIMP-2 suggerisce che la proteina EMD aumenta la produzione di MMP sulla superficie cellulare, che facilita gelatinolysis osteoblasti-mediata. Nel presente studio, abbiamo dimostrato che MMP-2 è spontaneamente prodotta da osteoblasti non stimolate, e che gelatinase viene attivato in presenza di proteine EMD. Al contrario, studi precedenti hanno dimostrato che gelatinasi MMP-9 non è stato prodotto da EMD osteoblasti proteine attivato [10].
Proteina EMD contiene fattori di crescita sia TGF-beta- e BMP-simili, che contribuiscono alla induzione di biomineralization durante la rigenerazione parodontale [22]. BMP-2 ha dimostrato di promuovere la rigenerazione ossea in vivo [23], migliorare l'attività della fosfatasi alcalina [24, 25], e aumentare le MMP di produzione [26, 27], suggerendo così che le citochine presenti nel EMD sono necessari per promuovere l'osso rigenerazione. proteine EMD attiva anche l'attività della fosfatasi alcalina [28]. È possibile che il TGF-β e BMP in proteine EMD attivano osteoblasti. I nostri dati mostrano che la proteina EMD aumenta la produzione di MMP-2 da cellule osteoblasti e suggeriscono che la rigenerazione ossea dipende MMP-2-attivato EMD. Questi documenti supportano i nostri dati [29, 30]. proteine EMD sono diminuite i livelli di MMP-1 e MMP-8 nel liquido crevicolare dopo l'intervento chirurgico lembo in vivo [6].
EMD-indotta la produzione di VEGF è regolata da p38 MAPK in fibroblasti gengivali umani [31].
Abbiamo inoltre fornito prove di identificazione p38 MAPK come la via predominante per indurre la produzione di MMP-2 in osteoblasti EMD-stimolati. Studi precedenti hanno dimostrato che questo percorso è importante promuovere la crescita delle cellule PDL stimolate con EMD proteine [32]. Così, la famiglia MAPK, tra cui la p38 MAPK, ERK e JNK percorsi attivati dalla proteina EMD, svolge un ruolo chiave nel regolare le funzioni cellulari necessari per la rigenerazione parodontale [33]. produzione di VEGF EMD-indotta è regolata da p38 MAPK in fibroblasti gengivali umani [31]. p38 MAPK potrebbe regolare non solo la produzione MMP, ma anche produzione di citochine in EMD stimolato legamento parodontale. Il nostro studio indica inoltre che l'inibizione di EMD produzione di proteine indotta di MMP-2 porta ad una significativa riduzione nella generazione di attiva MMP-2, sostenendo ulteriormente la nozione che MMP-2 agisce come una degradazione di gelatina per MMP-2 proteine EMD osteoblasti -stimulated.
in sintesi, i nostri risultati suggeriscono un modello in cui MMP-2 svolge un ruolo nella parodontale rimodellamento del tessuto connettivo degradando proteine della matrice e /o attivando un gelatinasi potente MMP-2 in osteoblasti.
Conclusione proteine
EMD induce la produzione di MMP-2 tramite il p-38 MAPK-attivazione di vie di segnalazione in osteoblasti, stimolando così la degradazione del collagene circostante, causando cambiamenti nella struttura ECM e promuovere la rigenerazione parodontale
. dichiarazioni
Riconoscimento
questo lavoro è stato supportato da Grant-in-Aid per la ricerca scientifica (C) 24.592.853, 23.592.755 e 23592786. Gli autori dichiarano assenza potenziali conflitti di interesse per quanto riguarda la paternità e /o la pubblicazione di questo articolo.
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Gli autori dichiarano di non avere interessi in gioco.
contributi degli autori
SG partecipato nella pianificazione e progettazione lo studio, l'analisi dei dati e la stesura del manoscritto. HI eseguito la maggior parte del lavoro di laboratorio e ha partecipato alla analisi dei dati. OS, YU, ED e TI hanno partecipato alla analisi dei dati. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.
