Abstract
sfondo
Aggregatibacter actinomycetemcomitans
(A.actinomycetemcomitans
) è un importante patogeno parodontale che possono partecipare in parodontite e altre infezioni non-orali. Il cytolethal distending tossina (CDT) è tra i fattori di virulenza prodotti da questo batterio. Questo studio è stato quello di chiarire la distribuzione di A.actinomycetemcomitans
e la prevalenza del suo cdtB
gene in soggetti cinesi.
Metodi
Un totale di 255 campioni sottogengivali sono stati ottenuti da 30 soggetti. I campioni sono stati raccolti da siti parodontali sani e tasche superficiali, moderate e profonde. La quantità assoluta di A.actinomycetemcomitans
e cdtB
gene sono stati determinati mediante real-time PCR.
Risultati
A.actinomycetemcomitans
è stato rilevato in 92 di 105 campioni (87,6%) della parodontite aggressiva pazienti (AGP), in 73 dei 79 (92,4%) campioni di parodontite cronica (CP) pazienti e in 5 su 71 (7,0%) campioni di soggetti sani parodontali. Il CDT
gene B è stata rilevata in 72 siti (78,3%) con AGP infettate con A.actinomycetemcomitans
, 54 siti (74,0%) con CP infettate con A.actinomycetemcomitans
e nessuno in luoghi sani infettati con A.actinomycetemcomitans
. Inoltre, la quantità di A.actinomycetemcomitans
e CDT
gene in campioni provenienti da tasche profonde fosse significativa maggiore di siti moderato, poco profondi e sani (P & lt; 0,05). In confronto a CP, i pazienti AGP sono stati infettati con aumento del numero di CDT
genotipo nelle tasche profonde (P & lt; 0,05).
Conclusione
Questo studio suggerisce che il gene cdtB
sono prevalenti in A. actinomycetemcomitans
, e la distribuzione di CDT
ceppo di genotipo può essere correlata con AGP e grave infiammazione parodontale.
Parole
Aggregatibacter actinomycetemcomitans
cytolethal distending tossina sottogengivale placca Real-time PCR Xiaoqian Wang, Lu Li, Yan Xu Ying e Sun hanno contribuito ugualmente a questo lavoro
materiale supplementare elettronica
La versione online di questo articolo. (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-37) contiene materiale supplementare, che è disponibile per gli utenti autorizzati.
Sfondo
la parodontite è una malattia infiammatoria cronica che porta alla perdita dei tessuti parodontali, che è molto diffusa ed è la principale causa di perdita dei denti negli adulti. Un parodontite ggressive (AGP) è caratterizzata da un rapido sviluppo e grave riassorbimento osseo, colpisce generalmente i pazienti più giovani di quanto non faccia la forma cronica.
A.actinomycetemcomitans
è un Gram-negativi, asta non motile, anaerobi facoltativi e commensale batterio , che è stato a lungo fortemente associata con AGP e può anche contribuire alla parodontite cronica (CP). A parte l'infezione orale, questo batterio è stato anche responsabile di alcune malattie infettive sistemiche, come la endocarditic, la meningite, osteomielite, glomerulonefrite e artrite [1].
Questo microrganismo esprime diversi potenziali fattori di virulenza che sono coinvolti nella colonizzazione in orale cavità, l'inibizione della rigenerazione dei tessuti parodontali e l'interferenza con i meccanismi di difesa dell'ospite. Nel 1998, Ohguchi [1] ha rivelato che A.actinomycetemcomitans
potrebbe produrre cytolethal distending tossina (CDT), che è stato secreto nel surnatante coltura batterica. E 'chiaro che CDT è codificato da tre geni designato cdtA
, cdtB
, e CDTC
, che sono disposti come un operone apparente. Questi tre geni specificano tre polipeptidi designati cdtA, CdtB e CDTC con masse molecolari apparenti di 28, 32 e 20 kDa, rispettivamente, che formano una holotoxin heterotrimeric [2-5]. CDTA e CDTC sono necessarie per la secrezione della tossina, mentre CdtB è responsabile per l'attività biologica [6]. CdtB ha una omologia di sequenza con DNasi I mammiferi, indicando un ruolo critico per l'attività nucleasi nelle interazioni parassita ospite [7]. Con gli batteri patogeni parodontali, A.actinomycetemcomitans
è il batterio unico che può produrre CDT. evidenze accumulazione mostrano che CDT è associato con la persistenza di infezione in modelli animali [7], aumentata espressione di RANKL (attivazione del recettore del fattore nucleare ligando-kB) e il conseguente osteoclastogenesi [3]. C'era rapporto mostra che cdtABC
era assente [8] in A.actinomycetemcomitans
isolato in Giappone [9], ma Kawamoto ha confermato che cdtABC
era spesso trovato nel genoma di A.actinomycetemcomitans
[ ,,,0],10].
pochi rapporti Fino ad ora, ci sono stati sulla prevalenza del CDT
genotipo ceppo di A.actinomycetemcomitans
in pazienti affetti da parodontite cinesi. evidenze accumulazione mostrano che CDT è associato con la persistenza di infezione in modelli animali [7], aumentata espressione di RANKL (attivazione del recettore del fattore nucleare ligando-kB) e il conseguente osteoclastogenesi [3]. L'associazione di CDT diversità genetica all'interno A.actinomycetemcomitans
dovrebbero essere valutati meglio. In questo studio, abbiamo rilevato la distribuzione di A.actinomycetemcomitans
e la prevalenza del suo putativo fattore di virulenza CDT gene codifica CDT
B nella placca subgengivale ottenuti da pazienti cinesi affetti da CP e AGP mediante real-time PCR, per valutare l'associazione di A.actinomycetemcomitans
CDT diversità genetica e caratteristiche cliniche.
Metodi
Soggetti
Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico di Stomatological Hospital affiliato alla Nanjing Medical University, Nanjing, Cina. Gli scopi e le procedure dello studio sono stati spiegati e consensi informati sono stati ottenuti da tutte le reclute.
Partecipanti inclusi in questo studio sono stati reclutati presso l'ospedale Stomatological affiliato alla Nanjing Medical University, dal dicembre 2008 al marzo 2009. 10 pazienti in CP, 10 pazienti AGP e 10 soggetti sani sono stati reclutati in questo studio
I criteri di inclusione dei pazienti sono stati i seguenti:. (i) etnia Han e & lt; 40 anni; (Ii) senza storia di terapia parodontale; (Iii) antibiotici sistemici o farmaci anti-infiammatori presi entro 3 mesi; (Iv) condizioni sistemiche sani; (V) senza la gravidanza, e (vi) non erano gli attuali utilizzatori di prodotti del tabacco o medicinali di sostituzione della nicotina [10]. I soggetti sani parodontali non avevano siti con profondità di sondaggio (PD) & gt; 3 mm o perdita di attacco clinico (CAL) & gt; 1 mm e non più del 10% dei siti con sanguinamento al sondaggio (BOP) .La diagnosi di CP e AGP sono state fatte sulla base di criteri definiti al workshop promosso dalla American Academy of Periodontology (AAP) nel 1999 [11-13].
siti campione sono stati classificati come poco profondo, moderata o profonda in base ai livelli di PD e CAL. Il livello del PD era di circa 3 mm o il livello di CAL era 1-2 mm di gruppo superficiale; e 4-6 mm di PD o di 3-4 mm di CAL in gruppo moderato. Nel gruppo in profondità, il livello del PD era finita 6 mm o CAL ≥ 5 mm [12].
Misurazioni cliniche
Prima di campionamento, un esame parodontale completo è stato condotto per registrare i parametri clinici parodontali mediante sonda FP32 (sonda Florida , Stati Uniti d'America), tra cui PD, CAL e BOP. Tutte le misurazioni sono state eseguite da un esaminatore calibrato. Per evitare eventuali contaminazioni che potrebbero derivare da sanguinamento al sondaggio, sondando clinica e la misurazione sono state effettuate almeno 7 giorni di anticipo di batteri di campionamento [14]
. Il campionamento dei batteri subginginval placca
8-10 campioni sono stati prelevati da siti superficiali, moderate e profonde di ogni pazienti arruolati affetti da CP e AGP, nonché da solchi gengivale controlli sani. Dopo un'attenta rimozione dei depositi di placca sopragengivale, il sito di campionamento è stato isolato con rotoli di cotone e delicatamente essiccato all'aria. Poi, a 30 # carta punto [15, 16] è stato inserito nelle tasche /solchi gengivali e lasciato in sede per 30 anni. Il punto di carta da ogni sito di campionamento è stato immediatamente collocato in un 1,5 ml provetta da microcentrifuga vuoto. I campioni per l'analisi PCR sono stati conservati a -80 ° C. Controllo ceppi batterici
positivi
A.actinomycetemcomitans
ATCC 29522, ATCC 29523, ATCC 24523 sono stati coltivati in condizioni anaerobiche (75% N
2, 10% CO 2, 15% H 2) a 37 ° C in 5% piastre di agar sangue di pecora (Oxoid, UK) arricchito con emina (5 mg /l) e menadione (1 mg /l) per 3- 5 giorni, e poi inoculati in brodo infuso cuore cervello fino cresciuto alla fase tardiva logaritmica di crescita. I batteri sono state raccolte per centrifugazione, lavate in PBS e risospese ad una concentrazione di densità ottica a 690 nm di 1, corrispondente a circa 1 × 10 8 unità formanti colonia (CFU) /ml [17]. primer
oligonucleotidi e sonde TaqMan
Identificazione delle regioni conservate è stato fatto da allineamento di sequenze multiple con il software ClustalW basato sul pubblicata 16S rDNA e cdtB
sequenze. I coloranti fluorescenti al 5 'e 3' estremità della sonda erano FAM (6-carbossifluoresceina; giornalista) e TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine; quencher), rispettivamente. Tutti i primer e le sonde sono stati controllati per una possibile cross-ibridazione con geni batterici utilizzando il database somiglianza programma di ricerca BLAST. Primer e sonde utilizzate per la quantificazione di A actinomycetemcomitans
16S rDNA e CDT
gene sono stati riportati nella tabella 1 1.Table primer e TaqMan sonde sequenze
Primer
Sequenza
prodotti dimensioni
Aa
-F
GCTGGTCTGAGAGGATGGC
Aa
-R
CGAAAGAACTTTACAACCCGA
153 bp
Aa
-P
CCTACGGGAGGCAGCAGTGG
cdtB
-F
ATTCTTCTGTGCTTCAATCTCG
cdtB
-R
GGTGATGATGGTGATGAGGTAA
151 bp
cdtB
-P
CACAGGTGGTTCTGATGCGGTAA
Aa
-F, Aa
-R e Aa
-P sono sinonimo di primer e sonde TaqMan per A. actinomycetemcomitans
16 s rDNA; cdtB
-F, cdtB
-R e cdtB
-P stare in piedi per primer e sonde TaqMan per A.actinomycetemcomitans cdtB
.
curve standard costruzione
Al fine di stabilire il quantitativo saggio, plasmidi contenenti le sequenze bersaglio di A.actinomycetemcomitans
16S rDNA e CDT
gene sono stati clonati utilizzando il PMD 19 T-vettore (Takara, Giappone). I prodotti di PCR per A.actinomycetemcomitans
16S rDNA e CDT
gene sono stati inseriti in vettori plasmidici, rispettivamente, ei vettori ricombinanti sono stati trasformati in E. coli
. Poi, i plasmidi sono stati purificati con Mini BEST plasmidi Purification Kit (Takara, Giappone). I plasmidi purificati sono stati quantificati mediante spettrofotometria. Le curve standard sono state costruite utilizzando seriali plasmidi purificati diluiti con concentrazioni predeterminate sulla base della relazione lineare tra il Ct e il logaritmo della quantità gene partenza. La sensibilità del sviluppato in tempo reale PCR è stata valutata utilizzando 10 7-10 ° copie plasmide di A. actinomycetemcomitans
e geniche cdtB
(dati non riportati), limite di circa 10 cellule è stata fondata nel la miscela di reazione PCR.
estrazione del DNA e Real-time PCR
Ogni campione è stato diluito in 500 ml di acqua distillata, dispersi nel vortex per 1 minuto, tirò fuori le punte di carta prima di estrazione del DNA. Poi, il DNA è stato purificato dal Mini BEST Kit batteri di purificazione (Takara, Giappone), ed eluito in tampone di eluizione di 60 microlitri
. TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, USA) è stato utilizzato per l'analisi PCR. La concentrazione finale è stato utilizzato in un volume totale di 10 microlitri conteneva 5 ml di 2 × Master Mix, 3 ml di DNA templato, 0,9 mM di ciascun primer e 0,25 mM di sonda. Real-time PCR è stata effettuata in duplicato in ABI 7900 sistema HT (Applied Biosystems, USA) con la seguente sequenza: 2 min a 50 ° C, 10 min a 95 ° C e 40 cicli di 15 s a 95 ° C e 1 min a 60 ° C.
analisi statistica
analisi descrittiva è stata effettuata per tutte le variabili. variabili quantitative sono stati descritti da valori medi, deviazioni standard, così come valori minimi e massimi. Le variabili qualitative sono state descritte da frequenze assolute e relative. I confronti sono stati fatti tra i gruppi (AGP, CP e soggetti sani) per le variabili indipendenti (PD), applicando l'analisi della varianza (ANOVA). Tutti i test sono stati effettuati utilizzando SPSS per Windows versione 12.0 (USA) e P valori inferiori a 0,05 sono stati considerati significativi.
Risultati
analisi cliniche
Abbiamo analizzato campioni di placca raccolti da 30 soggetti di seguito i protocolli descritti in precedenza. Questo studio consisteva di 255 campioni di placca subgengivale, che sono stati raccolti da 10 pazienti AGP, 10 pazienti in CP e 10 soggetti sani parodontali. La popolazione dello studio non aveva alcun precedente storia di fumare o di trattamento parodontale.
I valori medi della PD, CAL e BOP (%) di tutti i siti di campionamento sono stati mostrati nella Tabella 2. Questi risultati hanno rivelato che non vi erano differenze statistiche in questi parametri tra CP e AGP gruppi, mentre c'erano differenze significative tra entrambi i gruppi CP o gruppo AGP e parodontale subjects.Table sana 2 le caratteristiche cliniche dei pazienti affetti da parodontite e controlli sani
H
CP
AGP
Soggetti
10
10
10
siti di campionamento
71
79
105
Età (anni di età, media ± SD)
27.5 ± 2.1
32.5 ± 1.8
29.7 ± 2.1
di genere (maschio /femmina)
5/5 5/5
5/5
PD (mm, media ± SD)
2.4 ± 0.8
4.1 ± 2.0 *
4.9 ± 1.9 *
CAL (mm, media ± SD)
0
4,8 ± 2,0 *
4,5 ± 1,9 *
BOP (%, media ± DS)
15,8 ± 0,9
30,8 ± 5,5 *
30,6 ± 7,2 *
AGP, CP e H rappresentano parodontite aggressiva, parodontite cronica e parodontale sana, rispettivamente.
La media profondità di sondaggio, perdita di attacco clinico e sanguinamento al sondaggio (%) sono stati registrati in 255 siti di campionamento da 30 pazienti. * Ci sono state differenze significative per media profondità di sondaggio, perdita di attacco clinico e sanguinamento al sondaggio (%) tra AGP o CP e H (P & lt; 0,05), ma non vi era alcuna differenza significativa tra AGP e CP
Presenza e distribuzione. di A.actinomycetemcomitans
formato real-time PCR, abbiamo esaminato 255 campioni di placca sottogengivale per valutare i livelli di A.actinomycetemcomitans
in stato di diverso di siti parodontali. Tra tutti i campioni sottogengivali 255, A.actinomycetemcomitans
è stato rilevato da 170 campioni (66,7%). Solo 5 campioni (7,0%) su 71 campioni sottogengivali dai soggetti sani sono stati parodontalmente A.actinomycetemcomitans
16 s rDNA positivo (Tabella 3). 73 dei campioni di placca subgengivale 79 (92.4%) di pazienti in CP erano A.actinomycetemcomitans
16 s rDNA positivo. E tra i 105 campioni di placca subgengivale da pazienti AGP, 92 (87,6%) erano A.actinomycetemcomitans
16 s rDNA positivo. Non vi era alcuna differenza statistica dei A.actinomycetemcomitans
tassi positivi tra CP (92,4%) e AGP (87,6%) (P & gt; 0,05) (Tabella 3) .table 3 Prevalenza di A.actinomycetemcomitans e CDT in tutti i siti di campionamento
AgP
CP
H
Total
105
79
71
Aa
(+)
92
73
5
Aa
(+)/Total(%)
87.6
92.4
7.0
cdt
(+)
72
54
0
cdt
(+)/Aa
(+)(%)
78.3
74.0
0
Quantity-Aa
2.3 ± 1.1 *
2.1 ± 0.9 *
0,8 ± 0,5
Quantità-cdt
1,6 ± 0,8 **
1,3 ± 0,8 ***
0,4 ± 0,3
Aa
, AGP, CP e H riposare per A.actinomycetemcomitans
, campioni parodontite aggressiva , campioni parodontite cronica e campioni sani parodontali, rispettivamente
* ci sono state differenze significative per quantità di A.actinomycetemcomitans
tra AGP o CP e H (P & lt; 0,05). e senza differenze significative tra AGP e CP (P & gt; 0,05). ** Quantità di CDT
genotipo di A.actinomycetemcomitans
da campioni AGP erano significativamente più alta di quella di CP e H (P & lt; 0,05). *** Quantità di CDT
genotipo di A.actinomycetemcomitans
da campioni CP erano significativamente superiori a H (P & lt; 0,05).
Significa log-trasformati numero di A.actinomycetemcomitans
16 s rDNA in soggetti sani, pazienti in CP e pazienti AGP erano 0,8 ± 0,5, 2,1 ± rispettivamente, 0,9 e 2,3 ± 1,1 (tabella 3),. I numeri più alti di A.actinomycetemcomitans
sono stati rilevati in campioni provenienti da siti di parodontite in contrasto con quelli di soggetti sani (p & lt; 0,05). Tuttavia, non vi erano differenze significative tra i due gruppi parodontite (P & gt; 0,05).
Prevalenza e distribuzione di A.actinomycetemcomitans cdtB
gene
Su 255 campioni sottogengivali,
A.actinomycetemcomitans cdtB è stato rilevato in 126 campioni (49,4%). Nei 71 campioni sottogengivali da individui sani parodontali, nessuno dei campioni sono stati cdtB
positivo (Tabella 3). Mentre 54 dei 73 (74,0%) A.actinomycetemcomitans
campioni di placca subgengivale positivi da pazienti in CP erano cdtB
positivi. Tra i 92 A.actinomycetemcomitans
campioni di placca subgengivale positivi da pazienti AGP, 72 (78,3%) i campioni sono risultati A.actinomycetemcomitans cdtB
positivo. Non c'era alcuna differenza statistica per il A.actinomycetemcomitans cdtB
tassi positivi tra CP (74,0%) e AGP (78,4%) (P & gt; 0,05). Nessuno dei A.actinomycetemcomitans
16 s campioni negativi rDNA era positivo per cdtB.
Livelli di cdtB
gene sono state rilevate anche in 255 campioni. numero di cdtB
significano log-trasformati in CP e AGP erano 1,3 ± 0,8 e 1,6 ± 0,8 (Tabella 3). I campioni di gruppo AGP hanno mostrato i più alti numeri di cdtB
genotipo A.actinomycetemcomitans
contrasto gruppo CP e soggetti sani parodontali (P & lt; 0,05).
Associazione A.actinomycetemcomitans
e CDT
distribuzione con diverso stato parodontale
Significa numeri log-trasformati di A.actinomycetemcomitans
e cdtB
gene in tasche poco profonde, moderate e profonde erano 1.8 ± 0.9, 2.2 ± 0.8, 3.1 ± 1.2 e 1.3 ± 0.8 , 1,5 ± 0,8, 2,1 ± 1,1 (Tabella 4), rispettivamente. Maggiore quantità di A.actinomycetemcomitans
e cdtB
gene nelle tasche parodontali profonde sono stati rilevati oltre tasche moderati e poco profonde (P & lt; 0,05) .table 4 Prevalenza e distribuzione di A. actinomycetemcomitans e CDT in siti di campionamento parodontite sondando profondità
Shallow
Moderate
Deep
Total
100
49
35
Quantity-Aa
1.8 ± 0.9
2,2 ± 0,8 *
3.1 ± 1.2 **
Quantità-cdt
1,3 ± 0,8
1.5 ± 0.8
2.1 ± 1.1 **
* media di log-trasformati numero di A.actinomycetemcomitans
16 s rDNA dalle tasche moderati campioni sono stati significativamente superiori che dalle tasche poco profonde (P & lt; 0,05).
** media numeri log-trasformati di A.actinomycetemcomitans
16 s rDNA e CDT
genotipo di A.actinomycetemcomitans
dalle tasche profonde campioni sono stati significativamente superiore a quello dalle tasche moderata e poco profonde (P & lt; 0,05).
per quanto riguarda i diversi stati parodontali, significare numeri log-trasformati di A.actinomycetemcomitans
e cdtB
gene da CP e AGP nel poco profondo , tasche moderate e profonde sono stati mostrati in figura 1 rispettivamente. La quantità di A.actinomycetemcomitans
e cdtB
gene nelle tasche parodontali profonde da AGP era superiore a CP (P & lt; 0,05). Figura 1 Media numero di A.actinomycetemcomitans rDNA 16S e cdtB di log-trasformati nelle tasche parodontali profonde, moderate e profonde. un. Media numeri log-trasformati di A.actinomycetemcomitans
16 s rDNA in acque poco profonde (n = 48), moderata (n = 20), profonda (n = 11) tasche parodontali da soggetti CP erano 1,9 ± 0,8, 2,1 ± 0,8 e 2.5 ± 1.0, rispettivamente. Media numeri log-trasformati di A.actinomycetemcomitans
16 s rDNA in acque poco profonde (n = 52), moderata (n = 29), profonda (n = 24) tasche parodontali da soggetti AGP erano 1,7 ± 0,8, 2,3 ± 0,8 e 3.4 ± 1.1, rispettivamente. * La quantità di A.actinomycetemcomitans
nelle tasche parodontali profonde da AGP era superiore CP (P & lt; 0,05). b. Media numeri log-trasformati di A.actinomycetemcomitans cdtB
in acque poco profonde (n = 48), moderata (n = 20), profonda (n = 11) tasche parodontali da soggetti CP erano 0,8 ± 0,1, 1,5 ± 0,8 e 1,3 ± 0.7, rispettivamente. Media numeri log-trasformati di A.actinomycetemcomitans
16 s rDNA in acque poco profonde (n = 52), moderata (n = 29), profonda (n = 24) tasche parodontali da soggetti AGP erano 0,8 ± 0,1, 1,6 ± 0,8 e 2.6 ± 1.0, rispettivamente. * La quantità di A.actinomycetemcomitans cdtB
nelle tasche parodontali profonde da AGP era superiore CP (P & lt; 0,05).
Discussione
Questa ricerca abbiamo impiegato TaqMan real-time PCR per obiettivo la quantificazione diretta A. actinomycetemcomitans
e CDT
gene B in diversa gravità dei siti parodontite di AGP o CP patients.and è efficace per rilevare le specie patogeni che sono estremamente difficili da cultura. Pertanto, abbiamo scelto diversi siti parodontali come bersagli per esplorare la presenza e la quantità di A.actinomycetemcomitans e il suo gene codifica CDT in soggetti cinesi e diverso stato parodontale. A.actinomycetemcomitans
potrebbero non essere presenti in tutti i siti orali in un paziente parodontite non trattata [18]. Prendendo campioni sottogengivali da tutti i denti sarebbe il modo più affidabile per rilevare A.actinomycetemcomitans
. Tuttavia, questo metodo è consumo di tempo e denaro consumo che non è adatto ad essere utilizzato nella pratica quotidiana. Campionamento dalla profonda tasca ogni quadrante ha dimostrato di essere molto affidabile per rilevare la presenza subgengivale di patogeni parodontali in pazienti non trattati [18]. Questa tecnica è basata su livello individuale. Mentre uno soffrivano di periodontite, modalità aggressiva o cronica, la gravità della malattia parodontale potrebbe essere diverso da un sito all'altro. Così abbiamo valutato la pertinenza di A.actinomycetemcomitans
e il suo gene codifica CDT con parodontite stuates base su "sito".
I primer scelti per la rilevazione di A.actinomycetemcomitans
e CDT
gene erano basati su un .actinomycetemcomitans
16 s gene rDNA e cdtB
gene rispettivamente. Il 16 s gene DNA ricombinante è stato segnalato per essere altamente conservata e questo modello per il rilevamento di A.actinomycetemcomitans
è stato ben conservato [19, 20]. Inoltre, dati recenti hanno dimostrato che CdtB è il componente principale ed indispensabile per l'espressione di attività CDT holotoxin [6, 8], e la sequenza di cdtB
stato anche altamente conservata fra A.actinomycetemcomitans
specie [21] . Così, la prevalenza di CDT geni che codificano è stata valutata utilizzando cdtB
primer e sonde specifiche.
Curve standard sono stati utilizzati in questo studio per valutare la quantificazione assoluta di A.actinomycetemcomitans
e CDT
gene in campioni . I plasmidi contenenti sequenze bersaglio clonati sono stati utilizzati come sostanze standard in PCR quantitativa, che hanno permesso le misurazioni più precise e costanti rispetto all'utilizzo di PCR amplicone come sostanze standard direttamente [22].
Alcuni studi hanno esaminato la prevalenza di A.actinomycetemcomitan
s in alcune popolazioni diverse [4, 13, 18]. Il nostro lavoro è il primo rapporto sull'analisi sia del tasso positivo e la quantità assoluta di A.actinomycetemcomitans
e la sua CDT gene
B in pazienti affetti da parodontite cinesi, e l'associazione della distribuzione di A.actinomycetemcomitans
e cdtB
con vari stato parodontale.
Abbiamo scoperto che A.actinomycetemcomitans
e la sua cdtB
gene erano significativamente più prevalenti e con una maggiore quantità di campioni prelevati da pazienti affetti da AGP o CP rispetto ai soggetti sani parodontali, e A.actinomycetemcomitans
e la sua CDT
gene erano anche più frequenti e con una maggiore quantità di tasche parodontali profonde che nelle tasche parodontali moderata e poco profonde.
Sebbene A.actinomycetemcomitans
è legata alla eziologia della AGP, questo batterio si trova anche in soggetti che sono sani o hanno altre forme di malattia parodontale [8]. I nostri risultati hanno mostrato che solo il 7,0% siti sani parodontali sono stati A.actinomycetemcomitans
positivo; 92,4% dei campioni CP e 87,6% dei campioni AGP esposti A.actinomycetemcomitans
positivo, a dimostrazione che la presenza di A.actinomycetemcomitans
è stata correlata con parodontite.
Dati quantitativi ha mostrato che la quantità di A.actinomycetemcomitans
in CP e campioni AGP erano palesemente superiore rispetto a campioni sani, mentre nessuna differenza tra CP e AGP. Ma la quantità di cdtB
ceppo genotipo di A.actinomycetemcomitans
in campioni AGP fosse notevolmente superiore a quello del CP e campioni sani (Tabella 3). Questi dati possono indicare risultati quantitativi sono stati più adatto per analizzare la distribuzione di A.actinomycetemcomitans
e dei suoi cdtB
ceppi genotipo
. Il cdtB
ceppo genotipo di A. actinomycetemcomitans
può essere più rilevante con parodontite aggressiva.
Tan ei suoi collaboratori hanno trovato A.actinomycetemcomitans
con il CDT
genotipo erano ad una frequenza più elevata da siti ottenuti da pazienti con diagnosi di parodontite aggressiva [23]. Il nostro studio ha dimostrato la cdtB
genotipo A.actinomycetemcomitans
erano a una maggiore quantità di siti ottenuti dalle tasche profonde. Il verificarsi elevato e la quantità di questo batterio in campioni con grave stato periodontite non era un sorprendente osservazione. A.actinomycetemcomitans
CDT tossina può essere simile a H.ducreyi
CDT tossina, che può contribuire alla patogenicità dei batteri ad una maggiore concentrazione [7]. Gli studi in vivo sono ancora necessari per esplorare l'esatto ruolo patogenetico di A.actinomycetemcomitans
CDT in futuro. I nostri dati hanno mostrato A.actinomycetemcomitans
e la sua CDT
ceppo di genotipo erano prevalenti nelle tasche parodontali profonde e moderati. Per spostare in avanti di un solo passo, l'analisi quantitativa ha mostrato cdtB
ceppo genotipo di A.actinomycetemcomitans
erano più prevalente nelle tasche parodontali profonde. Le quantità di CDT
genotipo ceppo di A.actinomycetemcomitans
sono stati correlati con forme gravi di parodontite (CP o AGP). Numerosi studi hanno considerato A.actinomycetemcomitans
come un importante microorganismo eziologico coinvolto in AGP [24-26], tuttavia, da una nuova prospettiva, i nostri dati hanno mostrato che cdtB
ceppo genotipo di A.actinomycetemcomitans
è principalmente trovato tra i siti con gravi forme di parodontite. A.actinomycetemcomitans
con cdtB
genotipo può essere più virulenta di parodonto umana.
Come ci si aspettava, nessuno dei A.actinomycetemcomitans
16 s campioni negativi rDNA era positivo per cdtB
. Questo risultato conferma che A.actinomycetemcomitans
era il membro esclusivo nella flora microbica orale individuati per trasportare ed esprimere la cytolethal distending tossina locus. Inoltre, c'erano 5 di campioni sani nel nostro studio che erano positivi per A.actinomycetemcomitans
mentre negativo per CDT
. Questo può essere risultati di minuto quantità di CDT
genotipo ceppo di A. actinomycetemcomitans
in questo 5 campioni di placca gengivale, mentre può essere una nuova prova di supporto per l'esistere di CDT
-negativa ceppo di genotipo di A. actinomycetemcomitans
in cavità orale.
Il CDT
gene così come lktA
(leucotossina a) di A.actinomycetemcomitans
è una sola copia del gene [21]. Tuttavia, 16 s gene DNA ricombinante può generalmente hanno da 4 a 6 copie per cellula (ad esempio, 6 copie per E. coli
) [22]. I nostri risultati hanno dimostrato che entro lo stesso campione la quantità assoluta di A.actinomycetemcomitans
16 s rDNA erano 1-10 volte rispetto a quella del cdtB
gene, che ha indicato che un sito parodontale può essere infettato da due o anche di più genotipi di A.actinomycetemcomitans
contemporaneamente. Alcuni genotipi di A.actinomycetemcomitans
possiedono CDT
gene, che potesse esprimere l'attività CDT; mentre altri genotipi di A.actinomycetemcomitans Quali sono CDT
-negativa, che sarebbe meno virulento di CDT
ceppi -positive. Yamano [9] ha riferito che l'89% dei A.actinomycetemcomitans
ceppi possedeva la CDT
gene. Un altro studio [4] ha scoperto che l'86% dei A.actinomycetemcomitans
isolati presentato completa operone del CDT
gene e la sua attività citotossica caratteristico. Tan ei suoi collaboratori hanno dimostrato una stretta associazione tra AGP e CDT
genotipo A.actinomycetemcomitans
ceppi -positive [23]. Questi risultati hanno suggerito che non tutti i ceppi di A.actinomycetemcomitans
CDT possedute
gene, in altre parole, non tutti A.actinomycetemcomitans
ceppi presentati citotossica attività CDT. Simile a A.actinomycetemcomitans
ceppi, Campylobacter spp.
, C.jejuni
, H.ducreyi
e altri batteri che producono CDT-non esprimono l'attività CDT o contengono tutte le cdtABC
geni in tutti i ceppi [4].
Conclusione
il nostro studio hanno studiato la prevalenza e la distribuzione di A.actinomycetemcomitans
e la sua CDT
gene nella placca sotto-gengivale da pazienti affetti da parodontite cinesi. Il significativo aumento dei quantitativi di CDT
-positive genotipo A.actinomycetemcomitans
sono stati trovati in siti parodontali AGP e in tasche profonde sia di CP e pazienti AGP, che ha indicato che CDT
gene potrebbe essere un potenziale di virulenza associata gene coinvolto nella patogenesi di AGP e gravi distruzioni parodontale. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.
