Abstract
sfondo
Nano-idrossiapatite (NHA) è un potenziale biomateriale ideale per la rigenerazione ossea. Tuttavia, studi hanno ancora caratterizzare il comportamento di osteoblasti umani derivate da midollo alveolare NHA. Pertanto, l'obiettivo del presente studio è stato quello di valutare l'influenza di Nha sulla adesione, la proliferazione e la differenziazione di queste cellule ossee di derivazione alveolari.
Metodi
osteoblasti alveolari umani primari sono stati raccolti dalla cresta alveolare di un maschio paziente parodontale durante l'intervento chirurgico resettiva ossea e coltivate su piastre di coltura rivestite sia con polilisina o polilisina con (POL /Nha) compositi nano-idrossiapatite. Le cellule sono state coltivate e osservati per 14 giorni, e quindi valutate di potenziali modifiche al osteoblasti omeostasi come valutato dalla reazione a catena quantitativa inversa transcriptasi-polimerasi (real time RT-PCR), microscopia elettronica a scansione e microscopia a forza atomica.
Risultati
tempo reale PCR ha rivelato un significativo aumento dell'espressione dei marcatori selezionati di differenziazione degli osteoblasti (proteina ossea morfogenetica (BMP) -2, -5, -7, ALP, COLL-1A2, OC, oN) in cellule coltivate sul POL /Nha substrato. Inoltre, in confronto con la superficie POL, cellule coltivate sul POL /NHA substrato dimostrato migliori proprietà osteoconduttive, come dimostra l'aumento della adesione e diffusione, probabilmente a causa della maggiore rugosità superficiale del composito.
Conclusioni
l'aumentata espressione di BMP e biomarcatori osteoinduttivi suggeriscono che nano-idrossiapatite può stimolare la proliferazione e la differenziazione degli osteoblasti alveolari locali, favoriscono la rigenerazione ossea nei siti di rigenerazione dell'osso alveolare.
osteoblasti Parole
Nanohydroxyapatite umani osso alveolare materiale supplementare di rigenerazione elettronica
La versione online di questo articolo (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-22) contiene materiale supplementare, che è disponibile per gli utenti autorizzati
Sfondo
Il principale. preoccupazione di Parodontologia è la riabilitazione di denti parodontalmente compromessi, possibilmente finalizzato alla rigenerazione dei tessuti parodontali completa [1]. Idealmente, questo processo dovrebbe includere la formazione di nuovo osso, nuovo legamento periodontale e nuovo cemento, o meglio un nuovo allegato sulla radice che è stata precedentemente priva di tutte le apparecchiature di fissaggio [2]. Gli approcci terapeutici che tentano di raggiungere questo obiettivo includono l'uso di diversi materiali innesto (autologo, allogenico, xenogenico e innesti alloplastici), barriere fisiche per il tessuto guidata Regeneration (GTR), smalto proteine della matrice di derivazione, e vari fattori di crescita [3, 4 ].
si presume che l'uso di innesti ossei o materiali alloplastici comporterebbe sia nella ricrescita di osso alveolare e la formazione di un nuovo strato di cemento con fibre di collagene inseriti sulla superficie radicolare precedenza periodontite-coinvolti [5]. Il meccanismo di azione può essere sia tramite la stimolazione della osteogenesi (formazione di nuovo osso dalle cellule ossee contenuta nel graft), osteoconduzione (quando l'innesto serve come impalcatura per la formazione ossea dall'osso ospitante adiacente), o osteoinduzione ( la matrice dell'innesto osseo contiene sostanze ossee inducono che provocano la formazione ossea nei tessuti circostanti, anche se non tessuto osseo) [6]. materiali alloplastica si presumono promuovere la guarigione ossea attraverso osteoconduzione e successivamente comportarsi come impalcatura per questo processo [5].
Un ponteggio ideale è un materiale biocompatibile che fornisce supporto meccanico appropriato [7]. Si dovrebbe possedere una struttura simile alla matrice extracellulare nativo, esibire proprietà superficiali favorevoli, e portare ad un aumento della adesione, proliferazione e differenziazione delle cellule osteoblastiche [7]. Idrossiapatite (HA) [Ca
5 (PO 4) 3 OH] è un materiale alloplastico, chimicamente simile al componente inorganica di matrice ossea che traduce queste proprietà in una biocompatibilità prezioso ed ottimale [7] . Quando HA si innesta sotto un periostio sano e ossa ben vascolarizzato, innanzitutto diventa integrato da un coagulo [8] e quindi rilascia ioni fosfato nell'ambiente circostante, che stimola neo-osteogenesi.
Un fattore fondamentale che disciplina integrazione ottimale HA con osso è dimensioni dei cristalli. particelle di HA con dimensioni più vicine alla dimensione dei cristalli naturali trovato in tessuti duri vertebrati (cioè, che vanno da 1 a 10 nm), sono ora disponibili [9], e sono stati segnalati per imitare la matrice extracellulare del tessuto osseo in dimensioni e struttura [10]. Studi in vitro
condotti con lo scopo di comprendere il meccanismo di azione di questo materiale nano-dimensioni hanno descritto un effetto stimolante sulle cellule mesenchimali staminali [11], un aumento dell'assorbimento di proteine e adesione degli osteoblasti rispetto ai tradizionali micro-sized HA [12 13], la stimolazione della proliferazione delle cellule osteoblasti-like umano causando la formazione di osso [14], e la stimolazione di adesione cellulare PDL [15]. Nonostante questo, ci sono poche informazioni fino ad oggi per quanto riguarda le risposte di osteoblasti alveolari umani in contatto con questo materiale innesto una volta che il difetto osseo è pieno. Pertanto, l'obiettivo del nostro studio è stato quello di valutare in vitro
gli effetti di Nha sulla adesione e la proliferazione degli osteoblasti alveolari umani e per determinare l'impatto che questo materiale alloplastico ha sulla espressione di biomarcatori di formazione ossea durante HA-mediata rigenerazione ossea parodontale.
Metodi
Isolamento di primari umani osteoblasti
fresco osso umano rimosso dalla cresta alveolare sono stati ottenuti con l'approvazione del Comitato Etico della Sapienza Università di Roma e il consenso informato del paziente.
umana primaria osteoblasti alveolari (piastre di cottura) sono state raccolte da un 53-year-old paziente parodontale maschio durante la chirurgia parodontale resettiva secondo un protocollo precedentemente convalidato [16, 17].
campioni di ossa raccolte sono stati conservati in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS, Sigma -Aldrich, St. Louis, MO) contenente 100 U /ml di penicillina e 100 mg /ml di streptomicina fino lavorazione. Per l'elaborazione, campioni ossei sono stati risciacquati in sterile tampone fosfato salino (PBS), pH 7,4, frammentato con un bisturi, e digeriti in soluzione di 1 mg /ml tipo IV collagenasi e 0,25% tripsina (in PBS) a 37 ° C per 30 min con agitazione, seguita due fasi di digestione aggiuntive per 40 min e 90 min, come precedentemente descritto [18, 19]. Le cellule ottenute dal secondo e terzo digestioni sono state raccolte, centrifugate e risospese in Modified Eagles medio Dulbecco (DMEM, Gibco-BRL, Rockville, MD) integrato con 50 U /ml di penicillina, 50 mg /ml di streptomicina, 4 mmol /l L- glutammina e 10% di siero fetale bovino (FBS, Hyclone, Thermo Scientific, Wilmington, DE). Le cellule adesione, la proliferazione e la morfologia sono stati ispezionati visivamente al microscopio (Nikon Eclipse TS100, Nikon, Tokyo, Giappone) per il periodo di tempo di 2 settimane. Dopo che le cellule hanno raggiunto 70-80% di confluenza, sono state staccate con tripsina-EDTA, raccolti e utilizzati per esperimenti tra i passaggi 2 e 4.
Poly-L-lisina e Poly-L-lisina-NHA rivestimento Preparazione
Un millilitro per 25 cm 2 dello 0,01% di poli-L-lisina soluzione (POL, Bioreagent, mol wt 150.000-300.000, filtrata sterile, Sigma-Aldrich) è stato utilizzato per rivestire le superfici delle piastre di Petri. I campioni sono stati delicatamente agitati a 4 ° C a 1200 rpm per 10 min per omogeneizzare stratificazione. Le superfici furono lavate con acqua sterile e lasciati asciugare a temperatura ambiente. Successivamente, 10 mg di Nha in polvere (Ghimas Spa, Casalecchio di Reno, BO, Italia) è stato risospeso in 1 ml di acqua sterile e utilizzato per rivestire le lastre POL-trattata. Infine, superfici rivestite sono stati risciacquati con acqua sterile e lasciate asciugare
osteoblasti-POL e osteoblasti-POL-nha campioni preparazione
comportamento degli osteoblasti è stata esaminata su piastre rivestite con due prove:. In Test 1, piastre rivestite solo POL sono state seminate con fornelli su con una densità di 2 × 10 4 celle /cm 2; in Test 2, piani di cottura sono state seminate alla stessa densità su piastre rivestite di POL e polvere di Nha. Esempi di Test 1 e Test 2 sono stati coltivati nelle stesse condizioni sperimentali (95% di umidità, 5% CO 2, 37 ° C) in DMEM contenente 10% FBS. Gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato e ripetuti tre volte al microscopio elettronico.
Scansione
proprietà superficie delle piastre rivestite e osteoblasti morfologia sono stati indagati visivamente microscopio elettronico a scansione (SEM). Dopo 24 h di coltura su POL o superfici POL-nha rivestite, i campioni sono stati lavati due volte con PBS, fissate in glutaraldeide al 2,5% per 1 ora, lavate con acqua distillata, disidratato con concentrazioni crescenti di alcool (50%, 70%, 90% , 100% etanolo) e infine trattato con CO 2 al punto superiore critico. I campioni sono stati fissati su mozziconi di alluminio con un nastro di carbonio conduttivo e poi rivestiti con uno strato d'oro 10-nm (Coating Unità E5000, Polaron Ltd. Watford, Regno Unito). I campioni sono stati osservati al SEM (Leo 1450VP, Carl Zeiss, Jena, Germania) a vari ingrandimenti, usando elettroni secondari a 15 kV.
Microscopia a forza atomica
microscopia a forza atomica (AFM) è stata effettuata utilizzando un Nanonics Imaging AFM sistema (Gerusalemme, Israele) in nessuna modalità di contatto e una tensione di riferimento di 0,8-1,0 V tra la punta e la superficie campione durante tutti gli esperimenti.
espressione genica
Dopo 14 giorni di coltura su POL e POL-NHA superfici, RNA è stato estratto secondo il protocollo precedentemente descritto [18]. RNA è stato invertito trascritto usando kit TaqMan trascrizione inversa (Applied Biosystems, tecnologie della vita, Foster City, CA), utilizzando esameri casuali. Real time PCR è stata poi effettuata utilizzando test SYBR espressione genica verde (Applied Biosystems) su un ABI Prism 7300 sistema di Real Time PCR (Applied Biosystems) per valutare le variazioni di espressione di marcatori osteogeniche: fosfatasi alcalina (ALP), A2 pro-collagene tipo 1 catena (COLL-1A2), proteina morfogenetica dell'osso (BMP) -2, BMP-5, BMP-7, osteocalcina e osteonectin. Gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) è stato utilizzato come controllo endogeno. Le sequenze sono stati progettati utilizzando il software Primer Express (Applied Biosystems) e sintetizzati da Primm (Milano, Italia). Primer sono elencati nella tabella 1. L'espressione genica è stato analizzato secondo il metodo ΔΔCT , con i livelli di espressione di Test 2 (POL /Nha) campioni normalizzati verso Test 1 (POL) values.Table 1 primer umani utilizzati in RT PCR per gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH), fosfatasi alcalina (ALP), A2 pro-collagene di tipo 1 catena (COLL-1A2), morfogenetica dell'osso proteina-2, -5, -7 (BMP-2, -5, -7)
target gene
Primer sequences
GADPH
5′-GGAGTCAACGGATTTGGTCGTA-3′
5′-GGCAACAATATCCACTTTACCAGAGT-3′
ALP
5′-TGCGGAAGAACCCCAAAG-3′
5′-ATGGTGCCCGTGGTCAAT-3′
Coll-1A2
5′-CCCAGCCAAGAACTGGTATAGG-3′
5′-GGCTGCCAGCATTGATAGTTTC-3′
Osteocalcin
5′-AGCAAAGGTGCAGCCTTTGT-3′
5′-GCGCCTGGGTCTCTTCACT-3′
Osteonectin
5′-CCACACGTTTCTTTGAGACC-3′
5′-GATGTCCTGCTCCTTGATGC-3′
BMP-2
FW5′-CCAGCTGTAAGAGACACCCTTTG-3′
RV5′-ACCCACAATCCAGTCATTCCA-3′
BMP-5
FW5′-CGTCCTCTGCACCTCTCTTTATG-3′
RV5′-CTCCGACTCTTCAGGATTTTCTTC-3′
BMP-7
FW5′-TCTTCCACCCACGTACCA-3′
RV5'-GCTTCCCCTTCTGGGATCTT 3 '
Analisi statistica dei dati
il pacchetto di statistica per le Scienze Sociali (SPSS v15.0, SPSS Inc. Chicago, IL) è stato utilizzato per l'analisi statistica . Le analisi sono state eseguite utilizzando t
-test di Student. Significatività è stato fissato a p & lt; 0.05
. Risultati
umana primaria estrazione osteoblasti e cultura
osteoblasti attaccati con successo alle superfici di substrato e sono stati osservati a subire proliferazione dal giorno 4 al giorno 14, come determinare mediante ispezione visiva al microscopio (Figura 1A-C ). Figura 1 osteoblasti primari umani. (A) Dopo 4 (B) Dopo 5 giorni (C) dopo 14 giorni (ingrandimento originale, 20 ×).
POL e POL-nha proprietà rugosità superficiale
La rugosità di entrambe le superfici del substrato è stata valutata mediante SEM e AFM. La rugosità superficiale nanometrica valutate dalla AFM era 49,7 RMS /nm per POL-nha e 6.3 rms /nm per POL. Così, piatti ricoperti di POL-nha mostrato un 7.89 volte più alta rugosità superficiale nanometrica rispetto a piastre Pol (Figura 2A-D). Inoltre, osservazioni SEM rivelato la morfologia delle particelle NHA avere una forma astiforme di 70-90 nm di diametro. Figura 2 la microscopia a scansione. (A) La microscopia elettronica immagine dei polilisina substrati (POL). (B) microscopia a forza atomica di POL /nanohydroxyapatite. (C) microscopia elettronica a scansione. (D) microscopia a forza atomica POL /nanohydroxyapatite (POL /nha)
. Effetto di nano-idrossiapatite sulla adesione degli osteoblasti e la proliferazione
sono state seminate I potenziali modificazioni morfologiche a piani di cottura sono stati valutati dopo che le cellule su piastre rivestite di POL e POL-nha. Dopo 24 ore, le cellule crescono sulle piastre POL rivestite mantenuto una forma sferica (Figura 3A), mentre le cellule sul substrato POL-NHA sembravano essere montato saldamente, come dimostra la presenza di numerose estensioni filopodi (Figura 3B), suggerendo che le particelle Nha migliore adesione degli osteoblasti e la diffusione. Inoltre, le immagini ottenute mediante AFM mostrato che piastre in coltura su POL /NHA osservate forti di quelli da solo POL, come dimostra l'aumento nanometrica rugosità superficiale (Figura 3C-D). Figura 3 microscopio elettronico a scansione (SEM) e microscopia a forza atomica (AFM). (A) Le cellule coltivate su POL apparso sferica con fibre ritratta. (B) Le cellule coltivate su POL /Nha apparvero allungata e con molti filopodi. (C) Le cellule coltivate su POL apparso sferica con fibre ritratta. (D) Le cellule coltivate su POL /Nha apparso allungato e con molti filopodi.
Effetti della nano-idrossiapatite sulla espressione genica di osteoblasti umani
RNA è stato estratto dalle cellule in coltura per 14 giorni su entrambe le superfici (POL contro POL /NHA) e sottoposto a real time RT-PCR per valutare le variazioni di espressione di specifici geni di differenziazione osteoblastiche (Tabella 1): BMP-2, -5 e -7, ALP, COLL-1A2, OC e ON, ben noto marcatori di differenziazione. Come mostrato in Figura 4, BMP-2, BMP-5 e BMP-7 è stato aumentato di circa 1,7, 4,5 e 4,3 volte, rispettivamente, nelle piastre di cottura coltivati su POL /substrati NHA rispetto a quelli coltivati su POL solo (p & lt; 0.05). È interessante notare che, COLL-1A2, OC e ON espressione era di 1,6, 1,9 e 2,1 volte più elevato, rispettivamente, in piani di cottura coltivati su POL /Nha rispetto a quelli cresciuti su POL (p & lt; 0,01). ALP è stata anche aumentata di 2,5 volte in piani di cottura coltivati su POL /Nha (p & lt; 0,01), suggerendo un aumento nella differenziazione di queste cellule in condizioni di coltura attuali. Figura 4 Gene espressione di piani di cottura poste in coltura in POL POL e /Nha.
Nel complesso, i nostri risultati mostrano che, entro un lasso di tempo di 14 giorni, POL /Nha substrato può aumentare l'espressione di specifici geni osteoblastiche, che indica fortemente un effetto positivo di Nha sulla differenziazione degli osteoblasti (Figura 4).
discussione
idrossiapatite, tra i vari sostituti di innesto osseo, è stato ampiamente studiato in rigenerazione parodontale nel corso degli ultimi tre decenni [4, 20]. HA innesti alloplastici, nonostante la loro composizione chimica simile all'osso, sono noti soprattutto per le loro proprietà osteoconduttive [5]. Il nostro studio ha confermato le proprietà osteoconduttive di una versione nano-dimensioni di questo materiale, dimostrando che Nha può stimolare gli osteoblasti per produrre selezionato biomarcatori rappresentante della formazione ossea e reclutamento di cellule mesenchimali.
Il razionale per la scelta degli osteoblasti alveolare umana si basa sul fatto che queste cellule si trovano sulla superficie ossea del difetto, il che significa che il materiale innestato sarà in contatto diretto con questi osteoblasti durante la guarigione. Il metodo di raccolta delle cellule è stata eseguita utilizzando un bisturi osso come parte di una tecnica ben documentata usato durante la chirurgia parodontale resettiva [21, 22]. coltura cellulare e la formazione sono stati effettuati dei substrati seguivano modelli utilizzati in precedenza (dispersione di particelle di Nha in poli-etilene-glicol-dimetacrilato o nha associati ad un policarbonato, poliammide, polisaccaride) [23-27]. osteoblasti alveolari umani sono cellule primarie responsabili della formazione dell'osso alveolare, anche se non sembrano essere in grado di migrare e proliferare in siti distanti dove è richiesta la rigenerazione ossea. Albrektsson & amp; Johansson suggerito che le cellule osteoblastiche preesistenti contribuiscono soltanto una porzione minore del nuovo osso necessaria in una situazione guarigione delle fratture e che il reclutamento di cellule immature e loro differenziazione in osteoblasti sono probabilmente la guarigione ossea meccanismo di base e fondamentale regolazione [6]. Infatti, osteoblasti hanno dimostrato di contribuire alla produzione di fattori di crescita che incoraggiano la migrazione cellulare e la differenziazione osteogenico e condrogenica delle cellule progenitrici mesenchimali [28]. Il nostro studio dimostra che NHA stimola osteoblasti alveolari locali per produrre rilevanti osso-specifica BMP, che sono noti per avviare e regolare la formazione dell'osso partendo dalle cellule progenitrici.
Diversi tipi di BMP, che appartengono al fattore di crescita trasformante (TGF ) -β famiglia, sono stati studiati e caratterizzati per il loro ruolo di modulazione nella omeostasi del tessuto osseo. BMP-2 e BMP-7 sono di particolare interesse, in quanto sono naturalmente rilasciati in risposta a traumi o durante rimodellamento osseo e sono, ad oggi, le uniche noti agenti induttivi [6]. Stimolazione della BMP-2, -5 e -7 è un aspetto importante di osteogenesi, come queste proteine sono tre dei fattori di crescita più potenti migliorando la formazione ossea. I risultati presentati qui dimostrano che Nha promuove l'espressione BMP da osteoblasti alveolari in vitro
. Questa osservazione suggerisce che NHA potrebbe agire come promotore di rigenerazione ossea al sito del difetto osseo in due modi: per indurre la differenziazione osteogenica come osservato da Lock et al. [11] e /o inducendo la secrezione di fattori specifici, come BMP o altri fattori di crescita non testati in questo esperimento. Inoltre, il NHA ha influenzato un aumento significativo l'espressione di alcuni importanti indicatori di osteogenesi ALP, OC, ON e COLL-1A2.
Di istigare la formazione di osso, le cellule hanno bisogno di aderire e proliferare. rugosità superficiale è una considerazione importante nella scelta di un substrato di osso che induce. Secondo i principi fisici e meccanici, un substrato con rugosità superficiale mostra una più elevata capacità di adesione se confrontato con una superficie liscia [29-32]. In questo studio, l'adesione degli osteoblasti è stata valutata in base alle modifiche alla forma delle cellule e sulla presenza di filopodi. SEM e AFM immagini ha mostrato che Nha aveva una superficie più ruvida rispetto al substrato di controllo e ha favorito l'adesione e la proliferazione degli osteoblasti umani. Questi risultati sono in accordo con quelli riportati da Thian et al., Dimostrando che Nha migliorato l'adesione e la diffusione delle cellule umane osteoblasti-simili [33] e Liu et al., Dimostrando l'induzione di adesione e la proliferazione di MG- osteoblasti, come l'essere umano 63 celle di Nha [14]
. Conclusioni
Entro i limiti di questo studio, abbiamo osservato che Nha può aumentare in modo significativo sul posto adesione degli osteoblasti alveolari umani e la differenziazione, e quindi ipotizzare che Nha potrebbe favorire la formazione di osso da osteoblasti locali nei siti di ricostruzione dell'osso alveolare. Inoltre, l'aumentata espressione di BMP sulla superficie NHA potrebbe indicare un aumento nel reclutamento di cellule progenitrici durante la guarigione con ponteggi NHA. Questi in vitro
risultati potrebbero spiegare, almeno in parte, la formazione di nuovo osso assistito in difetti ossei riempiti di NHA materiale d'innesto [34, 35] e suggerire l'ulteriore funzione di NHA nei processi di riattacco parodontali, compresa la formazione di nuova cemento e nuovi legamento parodontale. Ulteriori studi istologici e clinici sono necessari per dare un significato alle in vitro
risultati così come una spiegazione biologica dei risultati clinici osservati da altri.
Dichiarazioni
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gli autori dichiarano di non avere interessi in gioco.
autori contributi
AP e SM sono stati i principali ricercatori di questo studio. Hanno fatto i contributi sostanziali alla ideazione e progettazione, nonché l'acquisizione, l'analisi e l'interpretazione dei dati; GP, MS, GDC e BZ sono stati coinvolti nella stesura del manoscritto o rivedere criticamente per importante contenuto intellettuale, e ha dato l'approvazione finale della versione da pubblicare. LR, MB e FW fatti sostanziali contributi in acquisizione di dati e hanno partecipato alla stesura del manoscritto e ha aiutato nella revisione del manoscritto. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.
