Abstract
sfondo
C'è confusione sulla definizione del termine "stato vitalità (s)" di microrganismi. "Vitalità colorazione" o "tecniche di colorazione vitali" sono utilizzati per distinguere in diretta da batteri morti. Queste colorazioni, stabilito in primo luogo sui batteri planctonici, possono avere gravi carenze quando applicata a biofilm multispecie. I risultati di tecniche di colorazione devono essere confrontati con opportuni dati microbiologici.
Discussione
Molti termini descrivono "vitalità stati" di microrganismi, però, molti di loro sono fuorvianti. Gli autori definiscono "vitale" come "in grado di crescere". Di conseguenza, metodi di colorazione sono sostituti, dal momento che nessuna colorazione può dimostrare la vitalità
L'affidabilità di un "viabilità" commerciale colorazione assay (Molecular Probes) è discussa in base alla corrispondente scheda prodotto:. (I) principio di colorazione; (II) Le concentrazioni di batteri;.
(III) Calcolo /proporzioni morti vivi in vitro
Risultati del kit "viabilità" dipendono dalla concentrazione delle macchie 'e la loro relazione con il numero di batteri nel test. Generalmente questo sistema di colorazione non è adatto per multispecie biofilm, quindi dichiarazioni non corrette sono stati pubblicati dagli utenti di questa tecnica.
Per confrontare i risultati della colorazione con parametri batteriche tecniche appropriate devono essere selezionati. La valutazione di Unità Formanti Colonie è insufficiente, piuttosto il calcolo di placcatura efficienza è necessario. Vital colorazione a fluorescenza con fluoresceina Diacetate e bromuro di etidio sembra essere il metodo migliore provata e adatto nella ricerca biofilm.
Per quanto riguarda la mutagenicità dei componenti di colorazione gli utenti dovrebbero essere consapevoli del fatto che non solo bromuro di etidio potrebbe essere dannoso, ma anche una varietà di altri sostanze di cui la tossicità e mutagenicità non viene segnalato
Sommario
-. la nomenclatura in materia di "vitalità" e "vitalità" dovrebbe essere usato con cautela
-. il manuale del kit commerciale "viabilità" si fa notare che il kit non è adatto per la ricerca multispecie naturale biofilm, come supportato da una serie di letteratura
-. I risultati ottenuti con varie macchie sono influenzati dal rapporto tra conta batterica e la quantità di colorante utilizzato nel test. I dati corrispondenti vitalità sono inclini a spostamento artificiale
-. Come parametro microbiologico per l'efficienza placcatura deve essere utilizzato per il confronto
-. Etidio bromuro è mutageno. I ricercatori devono essere consapevoli che i composti di colorazione alternativi possono anche essere, o addirittura sono mutageni.
Parole
stato dentale placca biofilm Microrganismi Viabilità Vital fluorescenza batterica vitalità kit Mutagenesi Sfondo
La definizione del cosiddetto "stato viabilità ( s) "di microrganismi è stata una questione di confusione e discussione per decenni (per un assaggio della pletora di letteratura vedi [1-5]). Recentemente due manoscritti discusso questo argomento. Hannig et al. [6] studiato l'influenza di un romanzo collutorio contenente microclusters idrossiapatite sulla aderenza dei batteri utilizzando il BacLight ™ live /tecnica di colorazione morti. Tawakoli et al. [7] confrontato diversi live /colorazioni morte "per il rilevamento e la quantificazione dei microrganismi aderenti"
nel biofilm orale iniziale. In linea con la letteratura in precedenza questi due articoli dimostrano che seri tentativi sono stati fatti negli ultimi decenni per definire i diversi stati tra i morti e vivere microrganismi (marine e orali), e che "la vitalità colorazione" o "tecniche di colorazione vitali" sono stati e sono ancora utilizzati come un processo per superare il problema della distinzione tra microrganismi vivi e morti in biofilm.
Negli ultimi anni sempre più gli scienziati nella ricerca biofilm dentale sono diventati familiari con macchie vitalità /vitalità disponibili in commercio, in particolare il BacLight Assay ( BLA; BacLight ™ live /tecnica di colorazione morti). Tuttavia, questo principio colorazione ha gravi carenze quando applicata a indefinite multispecie naturali campioni biofilm. I risultati di questa e di altre tecniche di colorazione devono essere confrontati con tecniche microbiologiche classiche come la valutazione delle unità formanti colonie (CFU) e, più affidabili, il calcolo del rendimento placcatura batterica (PE). Questi paragoni con un "gold standard" sono piuttosto rari in cui kit commerciali sono utilizzati nella ricerca biofilm. Inoltre, i componenti di queste macchie vitali possono essere potenzialmente mutageno.
In sintesi, lo scopo di questo manoscritto è discutere la base, utilità e il rischio di "vitali" e "vitali" macchie soprattutto nella ricerca biofilm, con particolare attenzione a biofilm dentali naturali e vitali colorazione a fluorescenza con fluoresceina Diacetate /bromuro di etidio [8]. Da un punto di vista scientifico, è importante che i dati derivati da tali tecniche di colorazione dovrebbero riflettere lo stato batterica correttamente.
Discussione
Qual è la radice del problema?
Da un punto di vista olistico del dibattito copre diversi livelli. In primo luogo, la discriminazione di microrganismi vivi o morti rappresenta un problema cruciale in batteriologia (ambientale). Questo problema fondamentale esiste da decenni e non è ancora stato risolto. A questo proposito, i termini "vitalità" e "vitalità" sono spesso utilizzati e molto spesso mescolati - alcuni ricercatori scambiano completamente questi termini [9]
In secondo luogo, "macchie vitali" sono generalmente surrogati solo, ma sono veloce e semplice. dispositivi in studi che esaminano, per esempio, l'effetto antibatterico di sostanze. Qui il problema è la grande varietà di sostanze macchianti e quindi di principi di colorazione, in modo che la "pletora di scelte aggiunge alla confusione"
[10].
Analogamente Pamp et al. [11] stato: "macchie Più recentemente sviluppati, come le macchie Syto .... può macchiare in modo efficace le cellule praticamente in qualsiasi colore dell'arcobaleno "
Questo potrebbe sembrare divertente -. ma semplicemente riflette il problema. Come appena accennato, Tawakoli et al. [7] utilizzate combinazioni di diverse macchie (ad esempio FDA, CFDA, TCFDA, EB, nonché SYTO 9 /PI, Sytox rosso, oltre calceina AM). Davey [10] si riferisce anche alla FDA, PI e SYTO 9, ma soprattutto per sostanze come SYTO I verde, DIBAC4, pironina Y, rodamina 123 e arancione thiazole. Non c'è da stupirsi che questo autore [10] si riferisce ad altri quattro recensioni solo per informare circa il "modus operandi"
delle diverse macchie fluorescenti e la "grande diversità di possibilità in termini di selezione macchia, concentrazione, tempo di colorazione, etc ".
analizzando ulteriormente, il problema diventa ancora più complesso. Alcuni autori criticano l'uso limitato di ioduro di propidio (PI) come vitalità cellulare (sic!)
Indicatore [12, 13], mentre altri monitorati colpisce differenze tra SYTO 9 e SYTO 12 per quanto riguarda l'influenza della porine sulla cinetica di assorbimento di questi coloranti [14]. Ciò significa che quando le sostanze antibatteriche che disturbano l'integrità della membrana cellulare vengono valutati l'uso di queste tecniche di colorazione vitali può essere fuorviante. Un aspetto intrinseco di questo problema, vale a dire l'idoneità dei metodi di colorazione, è la dipendenza concentrazioni delle macchie "dei risultati (vedi più avanti).
Terzo luogo, gli utenti sono per la maggior parte purtroppo inconsapevoli che tali test" seducenti " sono stati solo convalidato per un numero molto limitato di specie batteriche [13, 15]. Da 15 000 "colpi" (250 recensioni) generati in PubMed chiedendo "citometria a flusso & amp; batteri ", solo tre sono stati lasciati dopo la filtrazione del database quando si utilizza" biofilm "come un termine ulteriore analisi. Niente di tutto questo tre articoli contribuisce al dibattito.
E 'fondamentale che "macchie vitali" e, molto più importante, le loro combinazioni sono direttamente confrontati con i dati batteriologici convenzionali. Come discusso più avanti in dettaglio questo non può essere la valutazione di CFU, ma di PE. In odontoiatria alcuni corrispondente lavoro è stato completato con singolo o una serie lucida di specie in vitro
senza condurre test batteriologici [6, 16-18], mentre alcune aziende hanno utilizzato questo metodo di colorazione fidarsi di per sé
nella sua affidabilità [ ,,,0],19, 20]. Quando il SYTO combinazione di 9 /PI è stato infatti legato alla corrispondenti valutazioni microbiologiche l'esito è stato incoerente [21-23]. A nostro parere, è impossibile scoprire studi in cui particolari esempi di queste macchie vitali e le sue combinazioni erano adeguatamente confrontati e correlati ai dati microbiologici relativi multispecie naturali biofilm come placca dentale.
Infine, i coloranti possono essere o sono tossici o mutageni . Per quanto riguarda la lista di composti, come precedentemente menzionato e tratto da [7] e [10], occorre determinare se vi sia un danno o rischio nell'uso di queste sostanze.
Viability rispetto vitalità
Netuschil [8] ha registrato 49 termini per descrivere "vitalità stati" di microrganismi (ad esempio: i microbi attivi, la crescita criptico, conta vitale diretta [DVC], dormienza progressiva, dormienza vegetativo, le cellule nani, le cellule moribonde, nonculturability, nonplateable, la sopravvivenza di stasi, vitalità riproduttiva, vitali ma non coltivabili [VBNC], non vitale, ma resuscitable, vitale, viviform, ecc), come citato in 34 diverse pubblicazioni corrispondenti [1, 2, 4, 24-54] (cfr Tabella 1). Mentre la tabella mostra i riferimenti, dal 1962 fino al 1998, il dibattito è più vecchio e già pertinenti a cavallo del 19
al 20 secolo [55-60]. Un esempio è "Conte Grande Targa anomalia" la [61, 62] Si veda anche [63]. Anche a quel tempo colorazioni vitali sono state discusse per essere usato come una prova per superare le carenze di tecniche di coltura [64-68]. Sembra che il passato discussione [69] è stato "rivitalizzato" alla fine di questo secolo [41, 70-78]. Da segnalare anche che alcuni termini (ad esempio, dormiente, VBNC) sono anche rilevanti quando si parla di batteri probiotici [79, 80] .table 1 termini usati per descrivere "vitalità stati" di microrganismi (da [8])
acclimatazione [ ,,,0],30]
"cellule quiescenti" [17]
microbi attivi [20]
rianimazione [3, 4, 15, 24, 28-31]
Alive, "vitalità" [15]
"spegnere le cellule", "spegnere stato" [17]
"Anabiotic (dormiente) stato "[15]
Somnicells [8, 11, 30]
" Borse di enzimi "[4, 12]
fame [10, 17, 29]
Cryptic crescita [24, 26, 27, 29] sull'oggetto - "La vera fame" [15]
coltivabili, culturability [4 , 10, 11, 31]
"substrato della morte accelerato", "substrato
- non coltivabili, nonculturability [22, 24]
lo stress accelerato" [6 , 15, 26, 29, 31, 33]
Debilitazione [9]
sopravvivenza [5, 11, 20, 22, 29]
morto, morte [3, 4, 9, 11, 15, 16, 20, 26], [29] sull'oggetto - "sopravvivenza" [3]
- "morte fase "[15, 29] sull'oggetto -" Stasis sopravvivenza "[25]
" Die-off "[31]
valida [3, 10, 15, 16, 18, 30, 31]
numero di organismi vitali diretta (DVC), metodo DVC [3, 4, 10, 15, 18, 29-31, 34]
- non vitali [3, 15, 16, 20]
Viability [3, 4, 6, 9, 12, 13, 15, 16], [19, 22, 23, 26, 29]
inattivo, dormienza [11, 12, 15, 20, 23, 28-30, 32] sull'oggetto - "vitalità apparente" [6, 15]
sull'oggetto - "dormienza Progressive" [1, 30] sull'oggetto - "vitalità riproduttiva" [23]
- "dormienza vegetativo" [15]
- "La vera vitalità" [6]
cellule nani, nani inattive, ultramicrobacteria [6, 14, 15, 29, 32]
"vitale ma non coltivabile" ( VBNC) [3, 4, 8, 10, 12, 15, 16, 21], [22]
crescita arresto [25] sull'oggetto - VBNC ipotesi [2-4 , 7]
"Killer fenotipo" [15] sull'oggetto - VBNC stato [3, 4, 10, 22, 24, 29, 31, 33], [34]
Lysis [20] sull'oggetto - [31] cellule
moribondi "vitale ma non recuperabile" [29] sull'oggetto - "non -viable ma resuscitable "[16]
'Nonplateable" [24] sull'oggetto - "non coltivabile, ma fattibile" [28]
protisti pascolo [ ,,,0],11]
Vital, vitalità [15, 16, 26]
"Pseudosenescent" [29]
Viviform [11, 30]
Riferimenti:
1Barcina et al. 1989 [24]
18Kogure et al. 1979 [40]
2Barer et al. 1993 [25]
19Korber et al. 1996 [41]
3Bogosian et al. 1996 [26]
20Mason et al. 1986 [1]
4Bogosian et al. 1998 [27]
21McKay 1992 [42]
5Bowden & amp; Hamilton 1998 [28]
22 Morgan et al. 1993 [43]
6Button et al. 1993 [29]
23Nebe-von Caron et al. 1998 [44]
7Colwell 1993 [30]
24 Nilsson et al. 1991 [45]
8 Colwell et al. 1985 [31]
25Nyström 1995 [46]
9 Dawe & amp; Penrose 1978 [32]
26 Postgate 1977 [47]
10 Duncan et al. 1994 [33]
27 Postgate & amp; Hunter 1962 [48]
11 Gonzáles et al. 1992 [34]
28 Rose et al. 1990 [49]
12Gribbon & amp; Barer 1995 [35]
29Roszak & amp; Colwell 1987a [2]
13Höfle 1983 [36]
30 Roszak & amp; Colwell 1987b [50]
14 Hood et al. 1987 [37]
31 Roszak et al. 1984 [51]
15Kaprelyants et al. 1993 [4]
32Stevenson 1978 [52]
16Kell et al. 1991 [38]
33 Whitesides & amp; Oliver 1997 [53]
17Koch 1996 [39]
34 Wilson & amp; Lindow 1992 [54]
Purtroppo, molti dei termini presenti e utilizzati nelle pubblicazioni sono inesatte, fuorvianti o addirittura paradossali, in particolare il termine spesso usato "fattibile ma non coltivabili (VBNC)", che sfuma la linea tra vitalità e viabilità. Per minimizzare la confusione quanto possibile ci riferiamo a Kaprelyants et al. [4]: "sono state presentate diverse classificazioni degli stati fisiologici di microrganismi. Abbiamo già suggerito
[3] che tutti i tipi di cellule considerate potrebbe essere ridotto a tre gruppi, come segue: 'vitale' per riferirsi a una cella che può formare una colonia su una piastra di agar, 'vitale' per riferirsi a uno che può farlo solo dopo la rianimazione e 'non vitale' per fare riferimento a una cella che non può farlo in qualsiasi condizione testato. Secondo questa terminologia, le cellule dormienti sono vitali "
(vedi tabella 2) .table 2" Glossario dei termini usati per descrivere i 3 principali stati fisiologici definiti nel presente documento "(citato da [3])
stato fisiologico
fenotipo
valida
grado di divisione; si forma una colonia su una piastra di agar.
Vital o dormiente
Impossibile dividere o per formare una colonia su una piastra di agar senza una fase di rianimazione precedente .
non vitale
incapace di divisione; non formerà un colonia su una piastra di agar in qualsiasi condizione testato.
Usiamo le frasi 'fame' o 'cellule muoiono di fame' di fare riferimento alle condizioni ambientali in cui le cellule sono incubate, piuttosto che ad uno stato fisiologico. Così le cellule affamate (o cellule che hanno subito altre sollecitazioni) possono o non possono essere inattivo. Nonostante l'uso storico di questi termini, le frasi 'diretto Conta vitale' e termini impropri 'vitali ma-non-coltivabili' sono, dal momento che queste cellule non sono vitali come sopra definiti.
In conformità con [4] noi definire "fattibile" rigorosamente come "capace di crescere". A questo proposito tutti gli altri test, per i test esempio di allungamento (DVC; [50]) o metodi di colorazione, non sono altro che i proxy, dal momento che nessun tipo di colorazione può dimostrare la vitalità. Così, il termine "sostenibilità macchia" è un termine improprio per definizione
e queste macchie deve correttamente essere chiamato "macchie vitali". Purtroppo, il termine improprio è spesso utilizzato da Invitrogen Ltd. (BacLight ™), ed è di conseguenza - ma in modo errato - adottata da parte degli utenti di questi test di vitalità
Il BacLight ™ kit di vitalità batterica (BacLight Assay, BLA)
. secondo il produttore [81] BLA è costituito da due macchie, propidio ioduro (PI) e Syto 9, che sia acidi nucleici macchia. SYTO9 è un verde fluorescenti membrana intercalante molecola permeabile e macchie tutte le cellule. Al contrario, PI è un intercalante macchia rossa ed è membrana impermeabile, ed è quindi escluso dalle cellule "sane". Il produttore descrive che PI ha una forte affinità per gli acidi nucleici che SYTO 9; pertanto, quando entrambe le macchie sono presenti all'interno di una cella, SYTO 9 sarà spostato dagli acidi nucleici e la cella (s) sarà fluorescenza in rosso. Per dimostrare le scorte meccanismo [82] hanno condotto misurazioni fisico-chimiche "cell-free" con la "vitalità Stain, Bac
Light", e potrebbe rivelare che il principio di colorazione non è così semplice. Questo autore ha istituito un cosiddetto trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET), anche se, in determinate condizioni di colorazione, emissione SYTO 9 supera l'emissione PI. Aumentando la concentrazione SYTO 9 può migliorare di conseguenza l'emissione PI, provocando una doppia colorazione di cellule. Azioni [82] sottolinea più volte che per l'interpretazione del risultato della colorazione "delle relative concentrazioni di PI, SYTO9 e il DNA sono stati di fondamentale importanza"
e "che gli esperimenti di controllo o di validazione appropriate (dovrebbe essere) eseguito".
doppia colorazione e /o FRET è stata documentata anche da altri autori [41, 83], che hanno esaminato i parametri di vitalità di colture vitali e formaldeide uccisi o UVA-trattati, rispettivamente. La seguente discussione del manuale sonde molecolari dovrebbe essere considerata in questo contesto
Per quanto riguarda l'affidabilità del "kit di sopravvivenza" utilizzato nella ricerca biofilm vorremmo citare direttamente il foglio informativo del prodotto (s) di sonde molecolari. 2001; Informazioni sul prodotto Live /Dead ® Kit BacLight ™ batterica Viabilità, Revised: 26 gennaio 2001, così come riveduto: 15-Luglio-2004 (per cui quest'ultimo rappresenta la versione più recente nel mese di ottobre 2013) [81] :( I) "... macchie differiscono sia nelle loro caratteristiche spettrali e la loro capacità di penetrare nelle cellule batteriche sane. Se usato da solo, la macchia SYTO 9 etichette in generale tutti i batteri in una popolazione - quelli con membrane intatte e quelli con le membrane danneggiate. In contrasto propidio ioduro penetra solo i batteri con membrane danneggiate, causando una riduzione della SYTO 9 macchia quando entrambi i coloranti sono presenti. Così, con una miscela appropriata delle Syto 9 e ioduro di propidio macchie, batteri con le membrane delle cellule intatte macchiare fluorescente verde, mentre i batteri con membrane danneggiate macchia rossa fluorescente. "
(II)" batteri colorazione con o Kit L7007 o L7012 - 4.1 Regolare le sospensioni di E. coli (live e uccisi) a 1 × 10
8
batteri /ml o le sospensioni S. aureus (vivere e ucciso) a 1 × 10
7
batteri /mL. S. aureus sospensioni in genere dovrebbero essere 10 volte meno concentrato di E. coli per la microscopia a fluorescenza. "
qui i numeri di E. coli
e S . aureus
differiscono da un logaritmo.
(III) Infine, a causa di (i) una miscela al 50% di vita e il 50% dei batteri morti normalmente non portare ad una 50/50 verde /fluorescenza rossa . E viceversa:
50% dei batteri fluorescenti verdi in un campione non significa che ci sono 50% di cellule vitali. Pertanto, "rapporti di verde /fluorescenza rossa
(devono essere), calcolato per ogni quota di Live /Dead E. coli."
Questo ultimo punto è stato confermato da Hannig et al . [6] nel loro articolo riguardante la fattibilità di S. mutans in vitro
. Hanno determinato che una "concentrazione iniziale di batteri vitali nel test"
del 50% porta a diverse "emissione rapporto vitali /batteri morti di emissione" valori
di circa 9.5, 6.5 o 8.0 nei loro campioni di NaCl-controllo. Inoltre, Hannig et al. [6] affermano che "la percentuale di batteri Avital aumentato come indicato dal rapporto di Avital di cellule vitali. Si era compresa tra 0,1 e ... ... 29,0 ... Dopo il risciacquo con clorexidina, il rapporto è pari a 190 (6 ore) o 10.2 (12 h) ... "
Prendendo le informazioni di loro figura un conto, non è ancora chiaro che cosa questi diversi rapporti in realtà può significare in termini di valori di vita "reale".
in sintesi, i tre sopra citati punti descritti nel mondo dello spettacolo manuale dell'utente BLA che, in conformità con le scorte [82], un "appropriata miscela
" dei due macchie deve essere determinata e fissata per i singola specie di batteri prima di utilizzarli in un esperimento. Questo può essere possibile in una vitro
situazione, in cui il BLA può aiutare a risparmiare tempo nel lungo periodo seguente, attento, e il tempo passi lunghi calibrazione critici per ogni singola specie batteriche. Tuttavia, questo è impossibile da gestire in naturalmente biofilm causa della unicità delle biofilm matrice placca dove in realtà ci possono essere più o meno di 1000 diverse specie microbiche [84]. Inoltre l'applicazione della macchia SYTO 9 /PI non è considerato adatto per biofilm, a causa di fenomeni di diffusione a causa exo-polimeri che risultano "in una sottostima del conte vitali"
[21].
Tuttavia, sembra essere un ulteriore inconveniente. Giertsen et al. [23] ha criticato notevoli discrepanze tra la vitalità del biofilm previsto e il risultato del metodo di colorazione SYTO 9 /PI. Inoltre, questi autori descrivono un comportamento instabile e un cambiamento del colore colorazione dal verde al rosso, cioè
verso un controllo più batteri "morti". Proprio di recente questi risultati sono stati spiegati da Tawakoli et al. [7] postulando che cellule colorate perdono la loro vitalità poco dopo intercalazione dei coloranti, scrivendo: "Questa ipotesi è stata confermata dall'analisi TEM in questo studio (Figura due). Le immagini hanno mostrato immensa lisi e la distruzione delle cellule aderenti ... ".
Tabella 3 elenca una pletora di studi [5-7, 9, 16-20, 22, 23, 41, 71, 73], [ ,,,0],82, 83, 85-98] che ha utilizzato il BLA. Tuttavia, in quasi tutti gli studi che doveva chiarito (a) se biofilm placca simili o, almeno, campioni di saliva sono stati valutati, o se le indagini sono state fatte con singole specie batteriche e /o (monospecies) biofilm artificiali; (B) se il regime colorazione dei campioni biofilm è stata regolata in base al manuale BLA (validazione); (C) che il fattore di diluizione è stato utilizzato tra SYTO 9 e PI, a causa di una procedura di validazione secondo (b); (D) come la procedura di incubazione è stata seguita, in particolare il tempo di incubazione dei campioni batterici insieme miscela le macchie; (E) se i risultati del BLA sono stati confrontati con altri parametri, e se questi ultimi fossero appropriata (g) o meno (f); (H) se il BLA risultati in forma con gli altri parametri (sia opportuno o meno). Ultimo non ultimo eravamo interessati (i) se i risultati BLA soddisfatto le aspettative di informazioni di sfondo users.Table 3 relativo all'utilizzo del test BacLight® (BLA) per la valutazione di (dentale) biofilm vitalità
Studi utilizzando il BLA (n = 30)
[5-7, 9, 16-20, 22, 23, 41, 71, 73], [82] * [83, 85-98]
(a) sono stati biofilm della placca-come valutati
No:? [5, 16-18, 22, 23, 41, 82, 83, 86], [87, 93, 96-98]
Sì: [6, 7, 9, 19, 20, 71, 73, 85], [88-92, 94, 95]
(b) convalida
No: [5, 7, 9, 16-18, 20, 22, 23, 41], [71, 73, 82, 85-91, 94-98]
Sì: [6, 19 ?, 83, 92, 93?]
fattore (c) diluizione
Non dichiarato: [16, 18, 23, 73, 86, 94, 95, 98]
1: 1 [6, 7, 9, 17, 20, 22, 41, 71], [85, 87-92, 96, 97]
2: 1 [93]
4: 1 [5]
6: 4 [19]
1: 6 [83]
(d) procedura di incubazione
Non dichiarato: [16, 18, 71, 86, 95, 96]
10 min, RT [6, 7, 20]
15 min, RT [5, 9, 17, 19, 22, 23, 41, 73], [85, 87 -91, 97, 98]
20 min, RT [83, 92]
& gt; 20 minuti, 2 ° C [93]
30 min [94]
(e) Confronto
No: [16-18, 20, 22, 71, 82, 83, 85, 88], [90, 91, 94, 95]
Sì: [5-7, 9, 19, 23, 41, 73, 86, 87], [89, 92, 93, 96-98 ]
(f) ... con metodi inadeguati
[6, 7, 9, 19, 23, 41, 73, 86], [87, 89, 92, 93, 96-98]
(g) ... con metodi appropriati
[5] *
(h) è avvenuto il BLA risultati in forma per l'altra parametri
No:? [7, 19, 86, 89, 92, 93] (DAPI), [96, 97]
Sì: [5, 23, 41, 93] (FDA), [98]
(i) Forse i risultati BLA soddisfare le aspettative degli utenti (s)
No:? [23, 83, 86]
Sì: [5, 7, 16, 18-20, 22, 41, 71, 82], [85, 87-98]
(a) (i) vedi descrizione nel testo
Non dichiarato:. o nessuna informazione è stata data dagli autori, o gli autori ha dichiarato che la colorazione è stata condotta "secondo le istruzioni del produttore", che cosa significa in genere un fattore di diluizione di 1 : 1 e un tempo di incubazione di 15 minuti
* [5]:. Decker registrata la conta batterica totale (come log BC /ml) e la CFU (come log CFU /ml), ma non ha fornito dati relativi alla PE .
* [82]:. misurazioni fisico-chimiche "cell-free" per chiarire il meccanismo della procedura di colorazione BacLight
Dal 30 indagini elencate nella tabella 3 la metà (15) è stata classificata nella rubrica "plaque- come biofilm ". Questa porzione alta è dovuto al fatto che si è cercato di considerare letteratura riguardante biofilm orali. saliva naturale è stato anche incluso ad esempio
[89-91], così come "placche microcosmo", che sono state coltivate in una bocca artificiale e /o sono stati per esempio stabilito dalla saliva [20, 71, 92] o da una placca sottogengivale campione [96]. Alcuni altri studi trattate con i batteri di acque profonde sedimento o campioni di acque reflue [73, 93], che sono state considerate da noi come sistemi multispecie naturali.
E 'sorprendente, ma attesi, che si basavano solo cinque studi su una procedura di convalida precedente (line (b) nella tabella 3) [6, 19, 83, 92, 93], da cui due casi sono stati anche discutibile [19, 93]. Tuttavia, una calibrazione può supporre lì. La descrizione di Filoche et al. [92] chiarisce la metodologia laboriosa (cfr loro Materiali & amp; sezione Metodi, punti 2.5 generazione dello standard fattibilità; 2.6 Preparazione del singolo standard di sostenibilità placca, 2.7 Preparazione dello standard fattibilità aggregati; 2,8 protocollo di colorazione per Live /Dead® BacLight ™ e 2,9 fluorescenza di misurazione e analisi dei dati). Sorprendentemente, la procedura di calibrazione di questi autori [92] anche sembrava funzionare quando i campioni ei controlli sono stati fissati in paraformaldeide al 4%, e /o sono stati conservati per un massimo di tre mesi.
Come conseguenza di non avere convalida i massimi utenti affidarsi a consigli del produttore per quanto riguarda il fattore di diluizione tra le due macchie Syto 9 e PI. Solo quattro gruppi di ricerca non hanno seguito la raccomandata 1: 1 diluizione. È interessante notare, i rispettivi fattori coprono un intervallo da 1: 6 a 4: 1 (line (c) nella tabella 3). Questo rispecchia in generale la natura seducente della procedura di colorazione [13] e le richieste dei ricercatori hanno verso un'applicazione facile e veloce. La preoccupazione degli stock [82] che le relative concentrazioni di PI, SYTO9 e gli acidi nucleici sono di importanza cruciale è per lo più trascurati dagli utenti.
A prima vista lo stesso vale per la procedura di incubazione (linea (d) in Tabella 3), tuttavia, questo potrebbe essere un problema più grave. Ventidue degli utenti non stabiliva la procedura o invocato le istruzioni del produttore. Alcuni altri ridotti raccomandata incubazione di 15 minuti a 10 minuti [6, 7, 20], mentre altri esteso il tempo di incubazione tra le macchie BacLight e rispettivi campioni a 20 o anche 30 minuti [83, 92-94]. Tuttavia, il ritrovamento di Tawakoli et al. [7] che le cellule colorate in esame modificati o addirittura perso la loro vitalità poco dopo intercalazione dei coloranti suggerisce che il tempo di incubazione "semplice" è un fattore cruciale e potenzialmente distruttive. È chiedersi se un tempo di 10, 20 o 30 minuti ( "al buio", ma a temperatura ambiente, e solo una volta a 2 ° C [93]) può esercitare un effetto deterioramento sull'esito della procedura di colorazione. [7]. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.
