dentale
Abstract
sfondo
Questo studio ha esaminato la prevalenza di Enterococcus faecalis
, i suoi fattori di virulenza putativi e la suscettibilità agli antibiotici nei soggetti con e senza malattie dentali. Un totale di 159 campioni di risciacquo orale sono stati raccolti da pazienti (n = 109) che soffrono di malattie dentali e controlli sani (n = 50).
Risultati
E. faecalis
è stato rilevato utilizzando solo la cultura in 8 /109 (7,3%) dei pazienti con vari tipi di malattie dentali, mentre nessuna E. faecalis
è stato trovato nei controlli sani weather utilizzando sia la cultura e la PCR. caratterizzazioni fenotipo del 8 E. faecalis
isolati hanno indicato che il 25% degli isolati prodotte emolisina e il 37,5% prodotto gelatinase. La maggior parte dei più importanti geni di virulenza; collagene Binding Protein (ace
) ed endocardite antigene (EFAA
) erano presenti in tutti 8 E. faecalis
isolati, mentre attivatore del gene emolisina (Cyla
) è stato rilevato solo nel 25% degli isolati, e tutti gli isolati sono risultati negativi per esp
gene. Tutto E. faecalis
isolati erano 100% sensibili alla ampicillina, cloramfenicolo, ciprofloxacina, vancomicina e teicoplanina, e in misura minore a eritromicina (62,5%).
Conclusione
Questo studio dimostra che tutte E. faecalis
isolati sono stati recuperati solo da pazienti affetti da malattie dentali polpe soprattutto necrotiche, e tutti gli isolati effettuate sia vincolante geni delle proteine e antigene endocardite e altamente suscettibili di collagene per uso frequente farmaci antimicrobici in Giordania.
materiale supplementare elettronica
La linea versione di questo articolo (doi:. 10 1186 /1472-6831-8-17) contiene materiale supplementare, che è disponibile per gli utenti autorizzati
Sfondo
Molti studi hanno dimostrato che E. faecalis
è. frequente in pazienti affetti da infezioni orali come gengiviti, parodontiti, denti con endodontico fallito così come lesioni cariose acidi associati a canali radicolari persistentemente infetti. [1-4] Altri studi hanno dimostrato la frequente presenza di E. faecalis
in associazione con una grande varietà di specie di batteri aerobici e anaerobici coinvolti in varie malattie endodonzia e parodontite apicale cronica [4-7].
Fattori virulenti di E. faecalis
rientra la conformità per ospitare il tessuto, l'invasione e la formazione di ascessi, la modulazione delle risposte infiammatorie ospitanti, la secrezione di vari prodotti che aumenta la formazione di biofilm [8-10]. I dati sulla prevalenza di E. faecalis orale
e dei suoi fattori di virulenza variano da uno studio all'altro [1, 6, 7]. Pertanto, ulteriori indagini sui potenziali fattori di virulenza di E. faecalis
sarebbe utile per comprendere il loro ruolo nelle infezioni dentali. Inoltre, isolati clinici di E. faecalis
recuperati da infezioni canale radicolare possono esprimere la resistenza antimicrobica a regimi di trattamento convenzionali previsti per le procedure dentali [11-13].
Questo studio ha lo scopo di indagare la presenza di E. faecalis
, i suoi fattori di virulenza e di sensibilità agli antibiotici in associazione con e senza alcune malattie dentali in una popolazione giordana
Risultati
età dei pazienti variava da 14 a 75 anni (media, 36,4 anni), e le persone di controllo erano tra i 20 e 69 anni (media, 28.3 anni). La prevalenza di E. faecalis
isolati in campioni di risciacquo orale di pazienti con malattie dentali è stato 8/109 (7,3%) utilizza sia la cultura e la PCR, mentre tutti i campioni di risciacquo orale ottenuti dalle 50 persone sani di controllo sono risultati negativi per E . faecalis
utilizzando entrambi i metodi. Tutto il DNA estratto da 8 E. faecalis
isolati sono stati dimostrato di essere positivo per la specifica E. faecalis
16s rRNA gene. La differenza tra i risultati dei due gruppi è statisticamente significativa (P value = 0,031). Inoltre, vi era 2 E. avium
isolati (Tabella 1). Il modello di crescita di E. faecalis
isolato dai casi positivi varia da pochi a numerose colonie (2 - 50 × 10
3 colonie /ml). La distribuzione dei 8 E. faecalis
isola tra i pazienti in associazione del sesso, il fumo, igiene orale e malattie dentali è indicata nella (Tabella 2). Rilevamento di putativi geni fattore di virulenza tra 8 E. faecalis
isolati mediante PCR sono stati i seguenti; sia ace EFAA
geni
ed erano presenti in tutti gli isolati (100%), mentre Cyla
gene è stato rilevato solo in 2 isolati, e tutti gli isolati sono risultati negativi per esp
gene (Tabella 3, Figura 1). Tutti 8 E. faecalis
isolati erano 100% sensibili alla, ampicillina, cloramfenicolo, ciprofloxacina, teicoplanina e vancomicina, mentre il 62,5% e il 12,5% degli isolati erano sensibili a eritromicina, imipenem, rispettivamente, e tutti erano resistenti alla gentamicina, clindamicina e OxacillinTable 1 rilevazione di Enterococcus specie
in pazienti e controlli
Caratteristiche
109 pazienti con malattie dentali No. (%)
50 Controlli persone No. (%)
età media (anni)
36.4 ± 13.98
28,3 ± 12.59
Sex
|
Maschio
39 (36)
24 (48)
Donna
70 (64)
26 (52)
E. faecalis
8 (7.3)
0
E. avium
2 (1.8)
0
Tabella 2 distribuzione di 8 E. faecalis
isolati in associazione di sesso, fumo, igiene orale e malattie dentali tra i 109 pazienti
Caratteristiche
E. positivo faecalis
*
negativo E. faecalis
*
totale No.
P-value***
Female
7
63
70
0.134
Male
1
38
39
|
Nonsmoker
7
83
90
0.228
Smoker
1
18
19
|
scarsa igiene orale
7
68
75
0.222
buona igiene orale
1
33
34
|
gengivite + ve
7
64
71
0.161
gengivite ve
1
37
38
|
polpa necrotica
8 **
101
109
0
carie + ve
4 **
77
81
0.115
carie -VE
4
24
28
|
* conteggio delle colonie:. 2 - 50 × 103colonies /ml
** ognuno paziente è stato trattato con antibiotici durante l'ultimo mese.
*** Non significativa tra E. faecalis positivo
e ciascuno di sesso, fumo, igiene orale, gengiviti, carie ma significativo con puples necrotiche.
Tabella 3 Presenza di 16S rRNA gene e la prevalenza di ESP, Cyla, ace, EFAA
geni tra l'8 E. faecalis orale
isolati rilevato mediante PCR.
Isolate No.
16S rRNA
esp
Cyla
*
asso
EFAA
3
+
-
-
+
+
44
+
-
-
+
+
1
+
-
-
+
+
2
+
-
+
+
+
6
+
-
-
+
+
12
+
-
-
+
+
18
+
-
-
+
+
59
+
-
+
+
+
Total ceppi No. (%)
8 (100%)
0 (0.0%)
2 (25%)
8 (100%)
8 (100%)
* Due isolati espressi attività emolitica in vitro
Figura 1 distribuzione di EFAA gene tra le 8 E. faecalis orale isolati. M, 100 bp marcatore del DNA; Corsia 1, EFAA
(688 bp); controllo positivo (E. faecalis
ATCC 29212); Corsia 2, EFAA
controllo negativo; Lanes da 3 a 10, positivo per EFAA Con gli E. faecalis orale
isolati
. Metodi
Un totale di 159 soggetti che frequentavano la clinica dentistica /University Hospital Jordan (JUH), Amman, Giordania sono stati esaminati per la presenza di malattie dentali da due dentisti (N. Dar-Odeh & amp; O. Abu Hammad) durante il periodo di studio del 2005. I soggetti sono stati divisi in due gruppi in base alla presenza o assenza di malattie dentali. Il gruppo di controllo era costituito da 50 persone sane che non hanno alcuna malattia dentale ovvio. malattie dentali indagati sono: carie, gengiviti placca indotta, e la malattia canale radicolare. I dati personali, storia di fumo, presenza o assenza di malattia dentale clinica, igiene orale e terapia antibiotica durante il mese scorso sono stati registrati per ogni persona esaminata. La carie dentale e gengivite sono stati registrati come presente /assente. Root malattia canale incluso: pulpite irreversibile, solo polpa necrotica, e parodontite apicale. L'igiene orale è stato considerato come sia scarsa o buono secondo indice di placca. Tutti i pazienti e le persone di controllo avevano dato il loro consenso scritto per essere inclusi nello studio. Tutti i pazienti ed i controlli sono stati invitati a sciacquare la bocca per 60 secondi con 10 ml di acqua distillata sterile e restituito il risciacquo orale in un contenitore sterile
. I campioni di elaborazione
Tutti i campioni sono stati trasferiti immediatamente al Laboratorio di Microbiologia Ricerca /Facoltà di Medicina /Università della Giordania. campioni risciacquo orale sono stati versati in provetta sterile e centrifugato per 10 min a 10.000 g. Il surnatante scartato e il pellet rimanenti sono stati ri-sospeso dal vortice in un ml di soluzione fisiologica sterile allo 0,9% [14].
Isolamento delle specie Enterococcus
Un ciclo completo dei pellet in sospensione (0,01 ml) è stato coltivato su bile-esculina piastre di agar per rilevare e contare la presenza di grigio colonie nere di specie Enterococcus
. Il resto dei campioni sospesi sono stati conservati a -70 ° C per ulteriori investigazioni. Almeno tre colonie cresciute su piastre di bile-esculina erano sub-coltivate in piastre di agar sangue per isolare Enterococcus specie
(Oxoid, Inghilterra). Tutte le colture effettuate attraverso lo studio sono stati incubati in un barattolo candela (5% CO 2) per 24-48 ore a 37 ° C. Pure la crescita ottenuta da piastre di agar sangue è stato ancora una volta inoculato su cisteina lattosio elettroliti carente (CLED) piastre di agar (Oxoid, Inghilterra), 6,5% soluzione di NaCl e bile-esculina tubo agar. Ogni crescita che mostra gram-positivi cocchi, positivo bile-esculina, positivi 6,5% prove di NaCl, catalasi-negativi e che appare come il giallo, piccole /medie dimensioni su CLED agar (Oxoid, Inghilterra) sono stati registrati provvisoriamente come Enterococcus
isolati. E. faecalis
ATCC 29212 è stato incluso come controllo positivo attraverso lo studio.
Rilevamento biochimica di E. faecalis isolati
Tutti tentativo Enterococcus
isolati sono stati sottocoltura sul cuore cervello piastre di infusione di agar (Oxoid, Inghilterra) e testato con biochimico sistema Remel (sistema Rapid ™ STR, USA) per confermare la loro identità di E. faecalis
. emolisina e attività gelatinasi
E. faecalis
isolati sono stati valutati per l'attività emolitica sulla base di sangue agar (Oxoid, Inghilterra) supplementato con 5% (v /v) sangue umano. Una singola colonia è stato coltivato su piastre di agar sangue e la sua attività emolitica è stata determinata dalla presenza di zone chiare attorno alle colonie (beta emolisi) come riportato da Creti et al
. [15]. attività gelatinase è stata valutata mediante l'inoculazione di colonie singole di ogni isolato come forma posto il 12% piastre di gelatina (Defico, Stati Uniti d'America). Le piastre sono state incubate a temperatura ambiente per 48 ore. attività gelatinasi era evidente dalla presenza di zone liquefatto attorno alle colonie. mercenses Serratia
ATCC 13880 è stato utilizzato come controllo positivo per il test di produzione gelatinase.
test di suscettibilità antimicrobica
suscettibilità di E. faecalis
isolati a 9 agenti antimicrobici è stata determinata con il metodo del disco di diffusione in base al NCCLS ( ora CLSI) le linee guida [16]
. Il rilevamento di E. faecalis in campione risciacquo orale mediante PCR
estrazione del DNA è stata effettuata utilizzando guidata DNA genomico Purification Kit (Promega, USA), secondo le istruzioni del produttore. Le estrazioni di DNA sono stati utilizzati per la rilevazione delle specifiche 16S rRNA gene di E. faecalis
in campioni di risciacquo orale [17]. condizioni di PCR sono stati compiuti da un termociclatore PCR (MJ ricercatori INC, USA), e sono stati i seguenti: 15 min denaturazione attivazione enzimatica iniziale /DNA a 95 ° C seguiti da 35 cicli consecutivi a 94 ° C per 20 s; 68 ° C per 45 s; 72 ° C per 15 secondi. I prodotti di PCR sono stati analizzati mediante elettroforesi utilizzando 2% gel (Promega, USA) contenente bromuro di etidio in 1 tampone × TBE, e correre per 1 ora con 70V, e visualizzati da UV Trans-illuminatore (UVP) e Gel sistema di documentazione (UVP) . La stessa reazione PCR è stata testata con ogni singolo ceppo di controllo di E. faecium
e S. mutans
che sono stati isolati da altri campioni clinici a JUH, e utilizzando E. faecalis ATCC 29212.
il test PCR utilizzato, ha dato un risultato negativo con il DNA estratto da E. faecium
e S. mutans
. Inoltre, l'estrazione del DNA di recuperato e identificato E. faecalis
isolati sono stati confermati utilizzando la stessa procedura di estrazione del DNA e PCR nelle stesse condizioni utilizzate per i campioni di risciacquo orale (Tabella 4) .table 4 sensibilità agli antibiotici di 8 E. faecalis
con il metodo di disco diffusione
Gli agenti antimicrobici
No. (%) Degli isolati sensibili
ampicillina
8 (100)
cloramfenicolo
8 (100)
La ciprofloxacina
8 (100)
Teicoplanina
8 (100)
Vancomicina
8 (100)
Eritromicina
5 (62.5)*
Gentamycin
Null
Clindamycin
Null
Oxacillin
Null
Nutriva solo ace
, EFAA
geni
. Il rilevamento di E. faecalis geni di virulenza putativi
DNA di E. faecalis
isolati è stato preparato con la sospensione di un ciclo completo di colonie di crescita durante la notte coltivate su sangue agar in un tubo che conteneva acqua distillata sterile 500 ml, seguito da bollire per 10 min e poi centrifugati a 12.000 g per 6 minuti. Un'aliquota del surnatante (5 ml) è stato usato come template in un volume finale di 25 microlitri miscela PCR [15]. PCR per i seguenti geni: collagene binding protein (ace
), endocardite antigene (EFAA
), emolisina attivatore (Cyla
), e una proteina di superficie (esp
) sono stati preparati come Uniplex in un volume di reazione finale di 25 microlitri. La tabella 5 mostra i primer utilizzati nello studio [15, 17, 18] .table 5 E. faecalis
primer utilizzato nello studio
Gene
Sequenza
formato del prodotto (bp)
Riferimento
E. faecalis
16S rRNA
Ef16SF 5 '- CCGAGTGCTTGCACTCAATTGG - 3'
138
17
Ef16SR 5 '- CTCTTATGCCATGCGGCATAAAC - 3'
|
|
Esp
5'-TTGCTAATGCTAGTCCACGACC-3 '
932
18
|
5'-GCGTCAACACTTGCATTGCCGA-3 '
|
|
Cyla
5'-GACTCGGGGATTGATAGGC-3 '
688
15
|
5'-GCTGCTAAAGCTGCGCTTAC-3'
|
|
ace
5'-GGAATGACCGAGAACGATGGC-3 '
616
15
|
5'-GCTTGATGTTGGCCTGCTTCCG-3 '
|
|
EFAA
5' -GCCAATTGGGACAGACCCTC-3 '
688
15
|
5'-CGCCTTCTGTTCCTTCTTTGGC-3'
|
|
campioni sono stati amplificati in un ciclatore termico PCR (MJ ricercatori INC, USA), riscaldando per 5 min a 95 ° C, seguita da 30 cicli di 95 ° C per 60 s , 58 ° C per 60 s (63 ° C per esp
) e 72 ° C per 60 s, e una fase finale di 72 ° C per 10 min. I prodotti di PCR sono stati analizzati nello 0,8% gel di agarosio (contenente 0,5% di bromuro di etidio in 1 × tampone TBE) che corrono per 50 minuti con 80 tensioni utilizzando apparecchiature elettroforesi orizzontale e visualizzati tramite Sistema Gel Documentation (UVP, USA). E. faecalis
ATCC 29212 è stato utilizzato come controllo positivo in ogni serie di PCR per rilevare Cyla
, ace
, EFAA
geni, e per testare il DNA preparato da alcuni E. faecalis
ceppi (EFS121, EFS87, EFS16, EFS27B, EFSU85, e EFS118) che sono stati ottenuti dalla Dott.ssa Roberta Creti (Dipartimeno di Malattie Infecttive, parassitarie eD Immunomediate, Istituto Superiore di Sanità, Viale Regina Elena, 299-00.161 Roma, Italia). Queste preparazioni di DNA sono stati utilizzati come controllo positivo per esp
gene con 1 Kb /100 bp marcatore Ladder (Promega, USA).
Analisi statistica
test Z è stato utilizzato per confrontare la prevalenza di E. faecalis
in gruppo pazienti e gruppo di controllo secondo la seguente equazione:
Z = P 1 - P 2 /√P (1-P) (1 /n 1 + 1 /n 2). P & lt; . 0.05
era
considerato statisticamente significativo Discussione
Il presente studio dimostra che E. faecalis
isolati sono stati recuperati da pazienti giordani in associazione con uno o più dei seguenti malattie dentali; carie, gengivite, gengiviti placca indotta, e infezione endodontico, e in un tasso significativo (7,3%; P = 0.031) rispetto ai soggetti sani di controllo (zero). Nonostante il fatto che generalmente PCR è più sensibile metodo di coltura nel rilevamento di batteri in campioni clinici, questo studio non ha rilevato alcun positiva E. faecalis
utilizzando campioni risciacquo orale diretta. Sedgley CM et al., 2005 (19) ha trovato che una real-time PCR quantitativa ha riportato una maggiore incidenza di E. faecalis
in campioni di risciacquo orale di tecniche di coltura e garantita una maggiore sensibilità. Lo studio ha rivelato che la scarsa igiene orale, gengiviti e polpe necrotiche sembrano essere importanti fattori predisponenti per l'infezione da E. faecalis con
(Tabella 2). Un recente studio simile da Stati Uniti d'America ha isolato E. faecalis
dal 11% dei campioni di risciacquo orale di pazienti che ricevono il trattamento endodontico, ma solo l'1% di E. faecalis
è stato recuperato da studenti di odontoiatria senza storia di trattamento endodontico [ ,,,0],14]. Gli enterococchi sono in grado di colonizzare la cavità orale, in particolare nei pazienti con parodontite o infezioni canalari associati a lesioni della mucosa orale e nei pazienti immunocompromessi [20, 21]. Inoltre, E. faecalis
è la specie più comunemente isolati dai canali radicolari campioni con insufficienza endodonzia [2, 21, 22]. E. faecalis
è stato spesso isolato in coltura pura o come un organismo predominante nei denti precedentemente root- riempiti con lesioni periapicali o parodontite apicale cronica [3, 19, 23, 24]. Inoltre, si è scoperto che questo organismo persistentemente infetti canale radicolare dove idrossido di calcio farmaco è inefficace [25].
Questo studio dimostra che la produzione di emolisina e gelatinase come determinanti di virulenza putativi non sono state sempre espresse da E. faecalis
isolati in associazione con malattie dentali, dal momento che solo il 25% di E. faecalis
isolati emolisina e il 37,5% attività gelatinase espresso in vitro, rispettivamente. Due studi condotti da Sedgley et al
. [14, 23] hanno riportato risultati diversi con produzione emolisina, primo studio ha dimostrato che il 36% delle E. faecalis
ceppi recuperati da pazienti endodontici prodotta emolisina, mentre il secondo non ha rilevato la produzione di emolisina in qualsiasi enterococchi isolati da endodontico casi. Inoltre, Sedgley et al
. [22] ha rilevato che gene gelatinasi (Gele) è stato rilevato in tutti gli isolati di E. faecalis endodonzia
mentre espresso attività gelatinase è stata osservata in due terzi degli isolati. Questi studi hanno concluso che la prova di potenziali fattori di virulenza sono stati identificati in endodonzia Enterococcus spp
., In particolare la produzione di gelatinasi e la risposta ai feromoni. Altri studi hanno indicato che l'espressione del gene gelatinase contribuito alla maggiore diffusione di E. faecalis
in ambienti ad alta densità ed è stato associato con una maggiore aderenza di E. faecalis
alla dentina in vitro
[26, 27] .
Il presente studio ha dimostrato che sia l'asso EFAA
geni
ed erano presenti in tutti E. faecalis
isolati, mentre Cyla
gene è stato rilevato solo in due isolati, e tutti gli isolati erano negativo per esp
gene che si trova soprattutto in E. faecalis
ceppi isolati da infezioni del tratto urinario [18].
Un recente studio molecolare basata ha indicato che la virulenza determinanti EFAA
e ace
geni è stato trovato in tutta E. faecalis
isolati da canalare dei pazienti endodontici, mentre ESP
gene era presente in (58%) e Cyla
gene in (19,4%) degli isolati [11] . Questi risultati sono in accordo con i nostri risultati, tranne per esp
gene. In generale, l'espressione di attività emolisina e gelatinasi o loro geni insieme con la presenza di altri geni di virulenza (ESP
, Cyla
, ace
, efa
a) in E. faecalis
ceppi ampiamente variati rispetto a uno studio all'altro e probabilmente a causa della differenza nelle loro origini clinici e geografici [5, 9, 11, 26-29]. Inoltre, né esp nè gelatinase sembrava essere necessaria per la formazione di biofilm; sia E. faecalis
ed E. faecium
non hanno mostrato una correlazione tra la presenza di entrambi esp o la produzione di gelatinasi e formazione di biofilm [30]. Sembra che molti fattori ambientali e genetici possono essere associati con la produzione di biofilm da E. faecalis
[31].
Negli ultimi anni, enterococchi hanno ricevuto una crescente attenzione a causa dello sviluppo di resistenza a diversi farmaci antimicrobici e la sua prevalenza comune nelle infezioni nosocomiali. enterococchi resistenti alla vancomicina (VRE) probabilmente rappresentano attualmente la sfida più seria tra molti microbi con infezioni umane resistenza agli antibiotici che causa [32]. I nostri risultati hanno dimostrato che tutti E. faecalis
isolati fossero sensibili al cloramfenicolo, ampicillina, vancomicina, ciprofloxacina, e teicoplanina, ma gli isolati erano molto meno sensibili alla eritromicina. Uno studio condotto da Pinheiro et. al
. [12] hanno dimostrato che E. faecalis
isolati da campioni orali non sono state completamente sensibili in vitro
di amoxicillina, acido clavulanico amoxicillina-, vancomicina e in misura minore suscettibile di eritromicina, moxifloxacina, cloramfenicolo, tetracicline, doxiciclina, e la ciprofloxacina . Il risultato di suscettibilità del nostro numero limitato di E. faecalis
isolati indicato maggiore frequenza di tassi di resistenza rispetto a quelli riportati in studi recenti provenienti da paesi occidentali [11-13]. Inoltre, il nostro risultato predisposizione correla bene con l'elevata prevalenza di resistenza tra clinica e di comunità Staphylococcus aureus isolati
in Giordania [33].
In conclusione, questo studio dimostra che tutte E. faecalis
isolati sono associati con polpe varie malattie dentali soprattutto necrotiche nei pazienti e hanno realizzato entrambi legame con le proteine ed endocardite geni antigene collagene
. Dichiarazioni
Ringraziamenti
Questo studio è stato in parte sostenuto dalla concessione della Facoltà di Graduate Studies, Università della Giordania, Amman , Jordan. Gli autori ringraziano il Dr. Roberta Creti (Laboratorio di Batteriologia, Istituto di Igiene Speciale, Università La Sapienza, Roma, Italia) per l'invio di DNA preparata da alcuni E. faecalis
ceppi che è stato usato come controllo positivo per esp
gene.
autori fascicoli presentati originali per
di seguito sono riportati i link ai degli autori fascicoli presentati originali per immagini. 12903_2007_92_MOESM1_ESM.pdf Autori file originale per la figura 1 interessi in competizione
Gli autori dichiarano di non avere interessi in gioco.
Autori contributi
AAS e ND-O hanno contribuito alla progettazione di tutti gli esperimenti e la scrittura del manoscritto . ND-O e OAH esaminati tutti i pazienti e le persone di controllo e raccolti i campioni orali. RS eseguiti tutti i test di laboratorio e co-scritto il manoscritto.
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