Abstract
sfondo
Lo scopo del presente studio è stato quello di esaminare le risposte in vitro di cellule ERM sotto la combinazione di centrifuga e le forze di compressione, in termini di espressione di HSP70 mRNA.
Metodi
le cellule AEC sono stati positivi per CK19 che indica che essi sono stati ottenuti da epitelio odontogeno. cellule ERM coltivate sono state applicate forza centrifuga e la forza di compressione in una a tre volte come forze meccaniche. Dopo aggiunta di forze, sono state osservate cellule con microscopio elettronico a scansione (SEM) e sono stati misurati espressione di HSP70 mRNA mediante RT-PCR.
Risultati
osservazioni SEM mostrarono le cellule sono state appiattite immediatamente dopo l'applicazione della forza meccanica, ma sporgenze nucleare recuperato lo stesso del controllo 3 h dopo. Un significativamente più alta espressione di HSP70 mRNA è stata osservata in cellule ERM sotto forza meccanica rispetto al controllo, ma gradualmente diminuita con il tempo. Nessun accumulo di espressione HSP70 mRNA si è verificato con la forza intermittente. Tuttavia, l'espressione di HSP70 mRNA con forza intermittente ripetuto 3 volte era significativamente più alta rispetto a forza intermittente applicato solo una volta o due.
Conclusioni
Questi risultati suggeriscono che le cellule ERM esprimono HSP70 mRNA in risposta alla forza meccanica, e che forza intermittente mantiene il livello di espressione HSP70 mRNA.
Parole
HSP70 epiteliale resto Malassez forza meccanica in vitro centrifugazione Sfondo
E 'noto che lo spazio del legamento parodontale (PDL) è mantenuta per tutta la vita. Alcuni studi hanno riportato che il resto epiteliale di Malassez (ERM) probabilmente contribuisce al mantenimento della larghezza PDL [1]. L'ERM è separato dalla guaina epiteliale radice di Hertwig (LEI) nella fase embrionale di sviluppo delle radici dei denti. LEI cellule sono strettamente collegati e sono circondati da una membrana basale continua. Quando le cellule della papilla dentali sono attaccati alla sua, la membrana basale interna della HERS è intermittente immediatamente dopo le cellule iniziano a sintetizzare una matrice di dentina. cellule sac dentali poi migrano tra le LEI frammentati [2]. Dopo il cemento sintetizzato da queste cellule mesenchimali della SAC dentale, le cellule epiteliali si aggregano per formare gruppi di cellule nominato il meccanismo di cambio, che sono ancora circondati da una membrana basale continua e si trovano di solito vicino alla zona cemento nel PDL o nel cemento dopo la eruzione dei denti, e non sono legate all'invecchiamento [3]. Carrie e Katchburian hanno riferito che l'apoptosi delle cellule ERM può essere parte del meccanismo di fatturato di ERM [4]. Molti studi hanno riportato sia il morfologica e le modifiche funzionali delle cellule ERM in varie condizioni in vivo [5-7]. Inoue et al. riferito che la rigenerazione è verificato quando una cavità ossea-PDL-dente alveolare è stato preparato, tuttavia, anchilosi dento-alveolare verificato 2 mesi dopo l'operazione. Essi hanno osservato che non ERM esiste nel PDL rigenerata e hanno concluso che l'assenza del meccanismo di cambio deve essere correlato con anchilosi dento-alveolare [5]. Inoltre, Yamashiro et al. riferito che denervazione del nervo alveolare inferiore porta ad una riduzione della distribuzione del meccanismo di cambio a 1 settimana e anchilosi dento-alveolare avviene a 6 settimane. Essi hanno inoltre confermato che il recettore ERM era immune-positivo per trkA, che mostra una alta affinità per il recettore NGF e hanno concluso che il nervo sensitivo potrebbe svolgere un ruolo di regolamentazione nel mantenimento del meccanismo di cambio [6]. Miniera et al. osservato il processo di guarigione del Pdl dopo dente ri-piantagione in ratti e rispetto al gruppo occluso con il gruppo non occluso. Essi hanno scoperto che dento-alveolare anchilosi è stato chiaramente individuato nel gruppo non-occluso, ma non è stato rilevato nel gruppo occluso. Essi hanno concluso che gli stimoli occlusali promuovere la rigenerazione del Pdl e prevenire anchilosi dento-alveolare [7]. Questi fatti suggeriscono che la riduzione della distribuzione ERM nel PDL potrebbe precedere lo sviluppo di ankylosis dento-alveolare e che stimoli meccanici deve impedire dento-alveolare anchilosi. Tuttavia, solo pochi studi sono stati riportati sui cambiamenti del meccanismo di cambio sotto i vari tipi di forze meccaniche in vitro [8].
In generale, la risposta allo stress è considerato a rappresentare un meccanismo di difesa cellulare contro disturbi ambientali [9- 12]. Se le cellule sono esposte sia ad una lieve o moderata uno stress che è sufficiente per regolare l'espressione di proteine da shock termico (HSP), sono spesso in grado di sopravvivere successiva, altrimenti stimoli di stress letali. HSPs può essere espresso da tutti i tipi di cellule e svolgono un ruolo protettivo contro una varietà di fattori nocivi, tra ossidanti, infiammazione, ipossia, ipertermia e anche stimoli meccanici comprendono forza ortodontico [10-14]. Inoltre, è forte in ortodontico indotta l'apoptosi dei fibroblasti PDL, e molte cellule ERM anche caduto in apoptosi [15, 16]. È stato confermato che HSP70 che serve a mantenere l'omeostasi stato svolto un cochaperone da Hsp40, può inibire l'apoptosi interferendo con la funzione del fattore apoptosi induzione (AIF) [17]. L'effetto di HSP70 su apoptotico FACOR proteasi-attivando 1 (Apaf-1) rappresenta probabilmente per la sua capacità di fornire la resistenza alla apoptosi indotta da stress segnalati e la sua espressione esiste nel Pdl per tutta la vita [18].
Lo scopo di il presente studio è stato quello di esaminare le risposte delle cellule ERM sotto forze meccaniche in vitro, in termini di espressione di mRNA codifica HSP70, che è una proteina la resistenza allo stress.
Metodi
cellulare cultura
cellule suino ERM erano donata dal Prof. Yoshihiro Abiko (Patologia orale di Hokkaido Science Medical University). Le cellule ERM sono state coltivate in terreno minimo essenziale (MEM) addizionato con siero 10% fetale bovino (FBS) e gentamicina in 75 piastre di coltura mm in atmosfera umidificata di CO aria e 5% 95%
2 a 37 ° C. Dopo sub-cultura per 3 volte, le cellule sono state inoculate ERM in 35 mm piatti. Quando le cellule erano state coltivate per 7 giorni e ha raggiunto il 70% di confluenza, sono stati utilizzati per gli esperimenti
esperimento esplorativo:. Determinazione della forza meccanica in vitro (Fig. 1)
Fig. 1 L'illustrazione mostra le modalità di applicazione di forza meccanica. Per la centrifugazione, il rotore ruota a 4.800 rpm per 20 min per caricare la forza meccanica (tipo 1). Per la forza di compressione, un vetro di copertura, 24 x 24 mm2, 0,2 g di peso, è stato posto sulla superficie cellulare per 20 min (tipo 2). Combinazione di tipo 1 e tipo 2 (Tipo 3)
Tipo 1: La forza centrifuga (4.800 rpm) per 20 min (n =
4)
Tipo 2: La compressione forza (20 min) (n
= 4)
Tipo 3: la compressione vigore + forza centrifuga (4.800 rpm) per 20 min (n =
4)
per forza centrifuga, rotore micropiastra orizzontale in una centrifuga Hitachi (HimacCT6D®) sono stati utilizzati . L'esperimento centrifuga a cui si riferisce Redlish et al. stabilisce un modello di pressione mediante centrifugazione di cellule PDL in vitro [19, 20]. Dopo le piastre di coltura 35 mm, sono state inserite l'adattatore del rotore, il dispositivo è stato fissato a una forza centrifuga di 4800 rpm (47,2 kPa, 482 g /cm 2), che è quasi la stessa di una forza di espansione rapida [13 ].
per la compressione di forza, un vetro di copertura, 24 x 24 mm 2 in termini di dimensioni e 0,2 g di peso, è stato direttamente messo sulla superficie cellulare (Fig. 1). Non ci sono stati rapporto sulla forza centrifuga con materiali di compressione. Hoshina et al. usati 9,0 g lastra di vetro, tuttavia, le cellule sotto la lastra di vetro con forza centrifuga provocato morte [14]. Poi abbiamo cercato di trovare una corretta forza di compressione sotto 0,2 g vetro di copertura.
Per la combinazione di compressione e forza centrifuga, un vetro di copertura (24 x 24 mm 2, 0,2 g) è stato direttamente posizionati sulle cellule ed era rimossi dopo centrifugazione a 4.800 rpm.
cellule in ciascuna delle 3 tipologie sopra erano continuamente coltivate per 12 h e senza alcuna forza è stato utilizzato come controllo.
come risultati, tipo 3 ha mostrato una significativamente più alta espressione di HSP70 mRNA di il controllo, tipo 1 e tipo 2 (Fig. 2). Così abbiamo deciso di utilizzare il gruppo di centrifugazione e copertura in vetro combinati come gruppo sperimentale. Figura. 2 espressione di HSP70 mRNA a 3 ore dopo diversi stimoli meccanici. Tipo 3 mostra una significativamente più alta espressione di HSP70 mRNA rispetto al controllo, così come il tipo 1 e tipo coperchio 2. Non c'era alcuna differenza significativa tra il controllo, tipo 1 e tipo 2, anche se entrambi di tipo 1 e 2 tendeva ad essere maggiore rispetto al gruppo di controllo. ** P
& lt; 0.01
elettronico a scansione microscopica sono stati osservati (SEM) osservazioni
cellule ERM prima, subito dopo e 3 ore dopo forza meccanica utilizzando una emissione di campo fascio di elettroni 3D analizzatore di rugosità superficiale Elionix ERA-8900FE (4 canali 3 tridimensionale microscopio elettronico a scansione ( 4Ch-3D-SEM, Elionix Co., Ltd., Tokyo, Giappone) ad una tensione di accelerazione di 15 kV. per osservazioni SEM, le cellule sono state inizialmente fissate con 2% glutaraldeide per 1 ora a 4 ° C. Le cellule sono state poi disidratati in una serie graduata di etanolo, essiccati tetrametilsilano (Merck KGaA, Darmstadt, Germania) e quindi sputter rivestite con Au-Pd (Bio-Rad, Tokyo, Giappone). L'altezza delle cellule è stata misurata come un taglio di una riga sistema sulla figura linea di contatore utilizzando Immagine J software di analisi (NIH, Bethesda, MD, USA). Design in Sperimentale
Esperimento 1
cellule AEC sono stati raccolti utilizzando raschietto cellulare dopo l'aggiunta di forza meccanica a 3 ore , 6 ore, 12 ore, 24 ore e 36 h, e l'espressione di HSP70 mRNA è stata misurata. cellule ERM senza qualsiasi forza sono stati usati come controllo.
Esperimento 2
Esperimento 2 esaminato se il numero di forze meccaniche intermittenti influenzi l'accumulo di HSP70 mRNA (Tabella 1). Il vetro di copertura è stato rimosso dopo la centrifugazione e la cultura è stata continuata fino alla successiva ulteriore force.Table disegno 1 Esperimento di esperimento 2
Tempo
Gruppo 1
Gruppo 2
Il Gruppo 3
0 sull'oggetto - sull'oggetto - sull'oggetto -
3 h
- informazioni sull'oggetto -
Forza
6 h sull'oggetto -
Forza
Forza
9 h
Forza
Forza
Forza
12 h
mRNA
mRNA
mRNA
forza, aggiunta di forza centrifuga; mRNA, Isolamento di RNA; -, Nessuna forza
Gruppo 1: Nove ore dopo la cultura, una forza centrifuga (4.800 rpm) è stato applicato per 20 minuti e le cellule sono state osservate 3 ore dopo coltura continua
Gruppo 2: sei ore dopo la cultura. , una forza centrifuga 1 st (4.800 rpm) è stato applicato per 20 minuti e 3 ore dopo la cultura continua, a 2 nd forza centrifuga (4.800 rpm) è stato applicato per 20 minuti e le cellule sono stati osservati 3 h . dopo coltura continua
Gruppo 3: Tre ore dopo la cultura, un 1 st forza centrifuga (4.800 rpm) è stato applicato per 20 minuti e 3 ore dopo la coltura continua, un nd forza centrifuga 2 ( 4.800 rpm) è stato applicato per 20 minuti e 3 ore dopo la coltura continua, a 3 rd forza centrifuga (4.800 rpm) è stato applicato per 20 minuti e le cellule sono stati osservati 3 h dopo la coltura continua (Tabella 1).
Real-time PCR trascrizione inversa (RT-PCR)
RNA totale è stato estratto utilizzando il metodo guanidium acido thiocyante /phenochloroform, utilizzando un reagente isolamento RNA totale (Trizol reagente, Invitrogen, USA) secondo le istruzioni del produttore. Gli RNA sono stati retrotrascritto a cDNA in termociclatore utilizzando Oligo (dT) Primer (Invtirogen), RNase Inhibitor (Takara), trascrittasi inversa (Takara), dNTP miscela e tampone RNA PCR (Sigma). Un saggio RT-PCR è stata effettuata con un LightCycler ™ (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) utilizzando il DNA a doppio filamento colorante SYBR Green 1 (Roche Diagnostics) per osservare il livello di mRNA. sequenza Primer e dimensioni utilizzati in questo studio sono stati mostrati in Tabella 2. Quantificazione stata eseguita confrontando i livelli ottenuti con campioni standard come uno studio precedente [21]. Nel presente studio, le concentrazioni di cDNA nei campioni non stimolate erano 0.2, 0.5, 1.0 e 2.0 microlitri. Melting analisi della curva sono state eseguite dopo l'amplificazione PCR e per confermare nessun fondo dimmer nei prodotti di PCR. I rapporti di espressione HSP70 mRNA sono stati adeguati in base al valore del gene housekeeping GAPDH.Table 2 sequenza Primer e dimensioni utilizzato in questo studio
Gene
Sequence
Size
HSP70
Forward
5’-CGGACGAGTACAAGGTTGA-3’
206
Reverse
5’- CTCTTTCTCCGCCAACTG-3’
GAPDH
Forward
5’-AGGGGCTCTCCAGAACATCA-3’
196
Reverse
5’-GCCTGCTTCACCACCTTCTT-3’
Analisi statistica
I dati sono presentati come media ± SD. La significatività delle differenze è stato istituito con ANOVA seguito dal test di Scheffe con Excel 2013 (Microsoft, Redmond, WA, USA). Le differenze sono considerate significative con p
& lt; 0.01.
Risultati
SEM osservazioni
Le cellule AEC sono stati sparsi e sporgenze nucleo e citoplasma appiattite erano evidenti nel gruppo di controllo. Le sporgenze nucleo divennero più piatta immediatamente dopo la centrifugazione e sporgenze nucleari sono stati nuovamente osservati a 3 h dopo la centrifugazione (Fig. 3). Figura. 3 osservazioni SEM. I nuclei arrotondati e citoplasma appiattita su cellule in coltura ERM sono stati osservati nel gruppo di controllo. Solo le cellule appiattite senza sporgenze nucleari sono stati osservati dopo centrifugazione e sono stati osservati alcuni sporgenze di nuclei a 3 ore dopo la centrifugazione. barra della scala, 10 micron
L'altezza media delle celle ERM è stata di 1,4 ± 0,2 micron nel gruppo di controllo. L'altezza delle celle ERM era 0,78 ± 0,18 micron immediatamente dopo la centrifugazione e recuperato per il livello di controllo a 3 h dopo la centrifugazione. L'altezza delle cellule ERM immediatamente dopo la centrifugazione era significativamente inferiore sia al controllo e al 3 h dopo la centrifugazione (Fig. 4). Figura. 4 altezza cella dopo la centrifugazione. L'altezza delle celle ERM subito dopo la centrifugazione era significativamente inferiore sia al controllo e alle 3 ore dopo la centrifugazione. ** P
& lt; 0,01
espressione di HSP70 mRNA da parte delle forze meccaniche
Esperimento 1
L'espressione di HSP70 mRNA da parte del gruppo sperimentale (centrifugazione e compressione) era significativamente più alta rispetto al gruppo di controllo a tutti i periodi di tempo esaminati (Fig. 5) . L'espressione di HSP70 mRNA del gruppo sperimentale è stato più alto in 3 ore dopo aver aggiunto la forza. Il livello di espressione di HSP70 mRNA non era stabile e si riduce con il tempo. Figura. 5 HSP70 mRNA espressione in 3 ore, 6 ore, 12 ore, 24 ore e 36 ore dopo che la forza meccanica. L'espressione di HSP70 mRNA a 3 ore dopo la centrifugazione è stata la più alta e l'espressione gradualmente diminuita fino a 36 h. Il livello di espressione di mRNA non è rimasto costante e scomparve nel tempo. ** P
& lt; 0,01, rispetto a 3 ore dopo che la forza meccanica
Esperimento 2
L'espressione di HSP70 mRNA da parte del gruppo di controllo era significativamente più basso rispetto agli altri 3 gruppi (p
& lt; 0,01). Non vi era alcuna differenza significativa tra i 3 diversi gruppi di forze meccaniche (Fig. 6). Il numero di stimoli meccanici intermittenti non ha mostrato alcuna differenza in termini di espressione di HSP70 mRNA, il che significa che una volta verificato espressione HSP70 mRNA, non vi era alcuna ulteriore accumulo di espressione. Figura. 6 HSP70 mRNA espressione a 12 ore dopo l'stimoli intermittenti 1. L'espressione di HSP70 mRNA del gruppo di controllo era significativamente più basso rispetto agli altri 3 gruppi. Non vi era alcuna differenza significativa tra i 3 gruppi differenti sollecitazioni meccaniche. Il numero di volte di stimoli meccanici non ha mostrato alcuna differenza in termini di espressione HSP70 mRNA. ** P
& lt; 0.01
Discussione
Anche se il Pdl è continuamente esposta alle sollecitazioni meccaniche, come le forze di compressione o forze di estensione durante l'occlusione e gomme da [10-12], quelle risposte allo stress sono considerati a rappresentare un meccanismo di difesa cellulare contro disturbi ambientali a causa di l'espressione up-regolati di HSP [17]. Questi studi hanno dimostrato che le cellule ERM ridurre le funzioni di formazione di tessuto duro e aumentano il riassorbimento dell'osso alveolare e impediscono la PDL da essere suscettibile di dento-alveolare anchilosi [3, 18].
È stato precedentemente dimostrato che HSP svolgono un ruolo essenziale nel mantenere l'integrità delle strutture citoscheletriche causa della loro funzione di chaperone molecolari [9, 22]. Kaarniranta et al. analizzato gli effetti della pressione idrostatica (HP) sull'espressione genica HSP da fibroblasti umani primari e ha riferito che l'espressione del gene HSP70 è stato rilevato in fibroblasti umani [23]. I loro risultati suggerivano che HSP70 può svolgere un ruolo importante nelle prime fasi di adattamento delle cellule all'espressione carico meccanico. Inoltre, Lui e Kong hanno riferito che HSP70 è stato trovato transitoriamente upregulated durante la depolarizzazione e mantenuti AIF nel citoplasma per evitare l'apoptosi [17]
. Lee et al. riferito che l'aggiunta di centrifugazione intermittente alle cellule MC3T3-E1 stimolato l'attività ALP [24]. L'espressione di HSP70 mRNA a 3 ore dopo centrifugazione era il più alto e poi gradualmente diminuita con il tempo fino al 36 h in questo studio. L'espressione di HSP70 mRNA con forza intermittente ogni 3 ore era significativamente più alta rispetto al controllo, tuttavia, il livello trascrizionale di HSP70 mRNA non è stata mantenuta. Si suggerisce che le cellule ERM rispondono a ciascuna forza meccanica ma non hanno mantenere il livello trascrizionale di HSP70 mRNA per proteggere e sostenere le loro funzioni omeostatiche.
Un vantaggio per l'uso della forza centrifuga è che è possibile aggiungere anche più forza alle cellule senza modificare le condizioni di coltura, come meno ossigeno o nutrimento impoverito [13]. Salter et al. dimostrato l'integrina come meccanocettori che collegano i componenti della matrice extracellulare con l'actina filamento nel citoplasma [25]. Tanaka ha descritto la possibilità che questo percorso attraverso integrina potrebbe collegare il nucleo al meccanotrasduzione [26]. osservazioni SEM in questo studio ha dimostrato che sporgenze nucleari nel gruppo di controllo e appiattimento dei nuclei riportate immediatamente dopo la centrifugazione, ma restituiti alle forme originali Proprio come il controllo a 3 h dopo la centrifugazione. Ciò suggerisce che la forza centrifuga potrebbe influenzare il percorso strutturale di filamenti di actina immediatamente dopo la centrifugazione, e che la rete di trasmissione del segnale viene attivato.
Redlich et al. ha riferito che l'applicazione di un 1.000 rpm forza centrifuga di fibroblasti umani PDL promosso la morte delle cellule del 20%, mentre l'espressione di mRNA codificanti tipo 1 del collagene, metalloproteinasi della matrice e l'inibitore tissutale delle metalloproteinasi della matrice è stata aumentata [19, 20]. Naito et al. riportati gli effetti di 4.800 rpm, che è stato utilizzato in questo studio e si ritiene sia simile alla forza occlusale e la forza pungente, sulle cellule staminali del midollo osseo [13]. Essi hanno concluso che le cellule sottoposte ad una forza centrifuga 4.800 giri mostrato una maggiore attività proliferazione cellulare e l'espressione di mRNA di proteine correlate ossee rispetto alle cellule centrifugate a 600 rpm.
Al contrario, cellule al vetro di copertura come forza di compressione, come utilizzato in questo studio, sono stati segnalati dal Hoshina et al. a ipossico potenzialmente diventare e denutriti, ma hanno concluso che 0,9 g /cm 2 carico dalla lastra di vetro non aveva alcuna differenza in termini di morfologia cellulare e analisi funzionale [14]. Essi hanno riferito che la forza di compressione può sopprimere la differenziazione cellulare finale nella fase di calcificazione delle cellule osteoblastiche. In questo studio, l'espressione di HSP70 mRNA era molto più alto nel caso della combinazione di forze centrifughe e compressione che da solo forza centrifuga o la compressione sola forza. Questi risultati suggeriscono che la forza di compressione rende inizialmente cambiamenti nell'ambiente intracellulare e che la forza centrifuga cambia la struttura di filamenti di actina e accelera il cambiamento nell'espressione genica HSP70.
Conclusioni
Questi risultati indicano che le cellule esprimono ERM HSP70 mRNA in risposta alla forza meccanica, e che la forza intermittente mantiene il livello di espressione dell'mRNA HSP70. Tuttavia l'espressione di HSP70 diminuisce con il tempo e, livello trascrizionale di HSP70 mRNA gene non è stata mantenuta. Per futura considerazione, l'analisi di proteine è necessario
. Dichiarazioni
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata parzialmente supportati da un orale Health Science Center di Grant 7 dalla Tokyo Dental College e dal MEXT (Ministero della Pubblica Istruzione, Cultura, Sport, Scienza e Tecnologia) del Giappone, 2010-2012. Vorrei ringraziare i membri del Dipartimento di Fisiopatologia Clinica per la loro assistenza tecnica
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contributi degli autori
KM, TN e TI progettato il piano di ricerca. HK, KN e TSO eseguito lo studio morfologico delle cellule. HK, TSO AAW e KM effettuata l'analisi dell'RNA e l'analisi statistica. KN, TN e TI ha scritto il giornale. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.
