Abstract
sfondo
recettori proteasi-attivati (PAR) sono recettori G-accoppiati a proteine con un ruolo attivo nella mediazione infiammazione, dolore e altre funzioni. L'agente patogeno orale Porphyromonas gingivalis
(P. gingivalis
) secerne proteasi che attivano PAR. Lo scopo di questo studio è stato quello di chiarire il ruolo del PAR nella patogenesi della parodontite cronica per l'analisi di espressione di PAR nelle cellule umane gengivali epiteliali (GECS) prima e dopo P. gingivalis
trattamento surnatanti.
Metodi
GECS sono stati isolati da campioni di tessuto gengivale umani sani. L'espressione di PAR in GECS è stata determinata mediante reazione a catena della polimerasi di trascrizione inversa (RT-PCR) e citometria a flusso. L'effetto di P. gingivalis
proteasi è stata studiata mediante real-tempo di reazione a catena quantitativa trascrizione inversa della polimerasi (QRT-PCR) e citometria a flusso.
Risultati
PAR-1, PAR-2, e PAR-3 sono stati espressi in GECS. PAR-4 non è stato trovato sia da RT-PCR e citometria a flusso. Analisi dell'espressione genica mediante RT-PCR ha mostrato un up-regulation di PAR-2 mRNA rispetto alle cellule di controllo non trattati (P
& lt; 0,05). Al contrario, le espressioni mRNA di PAR-1 e PAR-3 erano significativamente down-regolato (P
& gt; 0,05) in risposta a P. gingivalis
surnatante rispetto a quello in cellule di controllo non stimolate. Questo effetto è stato abrogato dal TLCK inibitore della proteasi (P
& lt; 0,05). I risultati di citometria a flusso indicato livelli di proteine PARs coerenti con i livelli di mRNA nei risultati di QRT-PCR.
Conclusioni
nostro studio dimostra che PAR-1, PAR-2 e PAR-3 sono espressi in GECS. P. gingivalis
proteasi svolgono un ruolo nella regolazione delle risposte immunitarie innate in GECS. GECS utilizzare PAR riconoscere P. gingivalis
e mediare le risposte delle cellule coinvolte nella immunità innata. Recettori
Parole
proteasi-attivato umani gengivale cellule epiteliali Porphyromonas gingivalis P
roteases Sfondo
recettori proteasi attivati (PAR) sono una sottofamiglia di recettori accoppiati a proteine G (GPCR) con quattro membri, PAR-1, PAR-2, par-3 e PAR-4, che svolgono un ruolo critico in emostasi, trombosi, lo sviluppo embrionale, la guarigione delle ferite, infiammazione e cancro progressione [1]. L'attivazione di PARs avviene con un meccanismo unico che ha coinvolto specifico clivaggio proteolitico della sequenza N-terminale extracellulare da una proteasi. Questa scissione smaschera una nuova sequenza N-terminale, che agisce come un ligando legato che si lega al recettore di avviare più cascate di segnalazione [2-4]. Anche se condividono lo stesso meccanismo d'azione, è stato dimostrato che diversi PAR sono caratterizzati da diverse distribuzioni ed azioni biologiche e possono essere attivati da differenti proteasi [5]. La trombina è un importante attivatore di PAR-1, PAR-2 e PAR-3. Altri attivatori importanti del PAR-1 includono attivata proteina C (APC) e metalloproteinasi della matrice-1 (MMP-1); mentre tripsina e triptasi di mastociti umani attivare PAR-2 e tripsina e catepsina G attivano PAR-4. In termini di suscitare risposte di segnalazione a valle, PAR-1, PAR-2 e PAR-4 può segnalare autonomamente, mentre PAR-3 è principalmente considerato un co-recettore per PAR-1 e PAR-4 [6-9]. Come PAR sono espressi in una vasta gamma di tipi di cellule, è stato recentemente suggerito che essi svolgono un ruolo importante nei processi fisiologici, come la crescita, lo sviluppo, l'infiammazione, la riparazione dei tessuti e dolore.
L'epitelio gengivale sta diventando noto come un regolatore della risposta immunitaria innata orale ad una varietà di insulti, come batteri e sostanze chimiche. gengivali cellule epiteliali umane (GECS), che sono fattori chiave dell'immunità innata, non solo svolgono un ruolo importante nel mantenimento della barriera fisica tra l'host e l'ambiente, ma anche partecipare attivamente nel tessuto innata [10, 11] esprimendo specificamente certo recettori che sono coinvolti nella risposta immunitaria dell'ospite. E 'ampiamente accettato che le cellule utilizzano i recettori pattern recognition per identificare i batteri nel loro ambiente [12, 13]; Tuttavia, in aggiunta, alcuni agenti patogeni, come Porphyromonas gingivalis
(P. gingivalis
), secernono proteasi che sono riconosciuti dalle cellule tramite la famiglia di PAR [14]. PAR sono noti per essere espressa nell'epitelio della gengiva e sono stati implicati nella patogenesi della parodontite [15-18].
La parodontite è una malattia infettiva cronica che inizia come infiammazione dei tessuti parodontali e, infine, fa sì che il riassorbimento dell'osso alveolare e conseguente perdita di denti. P. gingivalis
è un importante agente eziologico della parodontite cronica. Questo batterio produce e rilascia una grande quantità di enzimi proteolitici. proteinasi tripsina-simile, chiamato gingipains, prodotti da P. gingivalis
hanno dimostrato di agire come importanti agenti patogeni [19, 20]. Recentemente, è stato dimostrato che gingipains sono riconosciuti dalle cellule mediante famiglia di PAR, che sono coinvolti nei processi infiammatori in diversi tessuti. Tuttavia, i ruoli precisi di PARs nei tessuti gengivali e l'importanza di PAR specifici nella patogenesi della periodontite restano da chiarire. Nel presente studio, inversa reazione a catena della polimerasi di trascrizione-(RT-PCR) è stato utilizzato per indagare i livelli di mRNA di Pars e citometria a flusso è stato utilizzato per indagare i livelli di proteina di Pars di GECS. Inoltre, quantitativa real-time RT-PCR (QRT-PCR) è stato utilizzato per indagare i livelli di mRNA di PAR in risposta a surnatante privo di cellule da P. gingivalis
al fine di corroborare i ruoli delle proteasi secrete.
Metodi
gengivale epiteliali di coltura cellulare
GECS umani primari sono stati isolati da campioni di tessuto gengivale umane sane da pazienti sottoposti a estrazione del terzo molare presso il Dipartimento dentale, Sir Run Run Shaw Ospedale, Facoltà di Medicina, Università di Zhejiang, Cina. Consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti gli individui che partecipano a questo studio. Lo studio sono stati valutati e approvati dal Comitato Etico della Affiliated Sir Run Run Visualizza Ospedale di Zhejiang University School of Medicine (20.131.120). tessuto gengivale fresco è stata posta in D-Hanks contenente 300 U /ml di penicillina G e 300 ug /ml di streptomicina e incubate a 4 ° C. Entro 1 ora, il tessuto era pronto per ottenere cellule epiteliali. In breve, il tessuto è stato tagliato in piccoli pezzi (1 mm x 1 mm), trattati con una soluzione al 25% dispasi II (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) e incubate per 18 ore a 4 ° C. Dopo l'incubazione, lo strato epidermico di cheratinociti umani è stato sollevato dal derma e collocato in un 15 ml provetta sterile contenente 2 ml di tripsina-EDTA. Il tessuto è stato incubato a 37 ° C per circa 10 min. Successivamente, GECS isolate sono state seminate in T-75 palloni (BD Biosciences) ad una densità cellulare di circa 3 × 10
6 cellule per pallone a 10-15 ml privo di siero media dei cheratinociti (cheratinociti-SFM) a cui erano integratori aggiunto secondo le istruzioni del produttore (Gibco BRL, life Technologies, Rockville, MD, USA). Fluidi nei palloni sono stati scambiati per mezzo fresco completo e gasati con il 5% di CO 2 ogni 2-3 giorni. Le cellule sono state diversi passaggi, quando è stato raggiunto il 75-80% di confluenza.
Trascrizione inversa PCR-analisi (RT-PCR) per la determinazione del PAR espressione
Per esaminare l'espressione di mRNA PAR, l'RNA totale è stato isolato da GECS (coltivato al 70% di confluenza) utilizzando TRIzol® reagente (Gibco BRL, life Technologies, Rockville, MD, USA) secondo il protocollo suggerito dal produttore. La sintesi del primo filamento di cDNA e RT-PCR sono stati eseguiti utilizzando un kit di PromeScript® RT-PCR (Takara Biotechnology Co., Ltd, Dalian, Cina). I primer per PAR-1, PAR-2, par 3, par-4 e β-actina sono stati sintetizzati da Sangon Biotech Co., Ltd (Shanghai, Cina; Tabella 1). Per l'amplificazione di PAR-1, PAR-2 e prodotti beta-actina, PCR è stata eseguita per 30 cicli. Il primo ciclo comprendeva una fase di denaturazione di 5 min a 94 ° C. Cicli 2-30 avevano una denaturazione di 30 s a 94 ° C, 30 s di ricottura a 60 ° C e 45 s di allungamento a 72 ° C. L'ultimo ciclo comprendeva una fase di allungamento di 10 min a 72 ° C. Per PAR-3 e PAR-4 amplificazione PCR è stata effettuata per 30 cicli. Il primo ciclo comprendeva una fase di denaturazione di 5 min a 94 ° C. Cicli 2-30 avevano una denaturazione di 30 s a 94 ° C, 30 s di ricottura a 65 ° C e 45 s di allungamento a 72 ° C. L'ultimo ciclo comprendeva una fase di allungamento di 10 min a 72 ° C. prodotti DNA e marcatore peso molecolare DL1,000 ™ DNA Marker (Takara Biotechnology Co., Ltd, Dalian, Cina) sono stati separati in gel di agarosio 1,5%, dopo di che i gel sono stati colorati con GelRed ™ e visualizzati sotto UV light.Table 1 oligonucleotidi sequenze utilizzate per RT-PCR Primer
sequenza oligonucleotidi
Lunghezza (bp)
Sense (5 'a 3')
antisenso (5 'a 3')
PAR-1
CCCGCAGGCCAGAATCAAA
AAAGGGGAGCACAGACACAAACAG
395
PAR-2
CTACTCAGATGACCCCAGAAACT
CCCAAAGTGCTAGGATTACAGG
399
PAR-3
GGCTGGACAGGAGCCACGAT
AGCGGTTGATGCTGATGCAGG
403
PAR-4
GGATCGCCTACCACCTGCGTG
CCCGTAGCACAGCAGCATGG
401
β-actin
AGGGGCCGGACTCGTCATACT
GGCGGCAACACCATGTACCCT
202
coltura batterica e surnatanti raccolta
P. gingivalis
ATCC 33277 è stato acquistato dalla American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) e anaerobico colta (80% N 2, il 10% H 2 e il 10% CO 2) in infusione cuore-cervello (BHI; Oxoid) piastra di agar contenente 5% di sangue di montone defibrinato arricchito con 5 g di estratto /l di lievito, 5 mg /l emina e 10 mg /l menadione (Sigma -Aldrich, Dorset, UK) a 37 ° C per 5 settimane. colture liquide sono stati preparati mediante inoculazione di colonie batteriche (3-4 giorni) da piastre di agar sangue nel brodo BHI 10 ml supplementato con 5 g di estratto /l di lievito, 5 mg /l emina e 10 mg /l menadione e incubate per 24 h . Dieci per cento inoculo è stato trasferito in 90 ml dello stesso terreno ed incubato per 6 giorni. Dopo questo periodo di coltura, i batteri sono state raccolte mediante centrifugazione a 10.000 g
per 15 min a 4 ° C e supernatanti sono stati raccolti, sterilizzata per filtrazione su un filtro da 0,2 mm e conservati a -80 ° C fino al momento dell'uso. Prima del trattamento, aliquote di surnatante sono stati utilizzati per la pre-incubazione (10 min) con 1 mmol /l della serina e cisteina proteasi inibitore tosile-L-lisina chloromethylketone (TLCK, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), che inibisce gingipains [15, 21].
Caratterizzazione di sovranatanti di coltura batterica e il trattamento
P. gingivalis
surnatanti sono stati diluiti in mezzo di coltura cellulare e la loro concentrazione espressi come la proteina batterica totale (mg /ml) presenti nelle colture cellulari. La concentrazione proteica è stata determinata con un kit BCA Protein Assay (Pierce, Rockford, IL, USA). Assorbanza è stata misurata a 562 nm su un lettore di piastre SpectraMax® più. attività della proteasi è stata misurata con un kit di proteasi Assay ™ (G-Biosciences, St Louis, MO, USA) [22]. L'assorbanza del peptide dye-marcato è stata misurata a 570 nm per la determinazione dell'attività della proteasi. Chimicamente tripsina stabilizzato (MSG-tripsina ™) è stato fornito con il kit come standard proteasi generale. GECS sono state coltivate al 80% di confluenza e stimolato sia con 50 mg /ml di proteine cultura surnatante da P. gingivalis
surnatanti o surnatanti TLCK-preincubate, per 6 ore [22]. medio GEC non stimolati servito come controllo per gli esperimenti di stimolazione. Ogni esperimento di stimolazione è stata eseguita in triplice copia e cellule da due a cinque differenti donatori sono stati testati
. Quantitativa real-time RT-PCR (QRT-PCR)
Dopo la stimolazione, l'RNA totale è stato estratto utilizzando un kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA, USA) e retrotrascritto utilizzando un kit SuperScript® RT-PCR (Takara, Tokyo, Giappone). Quantitativa real-time RT-PCR è stata effettuata utilizzando il sistema Applied Biosystems 7500 macchina PCR e Kit SYBR Premix (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) secondo le istruzioni del produttore. PCR sono state effettuate in piastre da 96 pozzetti in un volume totale di 20 microlitri, compreso cDNA e 0,8 microlitri primer 1 microlitri (10 mM; Tabella 2). espressione di esempio è stata normalizzata contro quella del gene housekeeping β-actina, che è stata inclusa in ogni seduta QPCR. controlli PCR sono state eseguite utilizzando acqua invece di cDNA. Tutte le reazioni sono state condotte in duplicato. Ad ogni punto di tempo, le espressioni dei mRNA selezionate in cellule incubate con P. gingivalis
surnatanti o surnatanti TLCK-preincubate sono state calcolate rispetto al gene housekeeping β-actina (ΔC
t) per ogni campione e quindi espresso rispetto a cellule non trattate allo stesso punto di tempo utilizzando il 2 -ΔΔC
T metodo [23] .table 2 sequenze oligonucleotidi utilizzati per QRT-PCR
prodotto Gene
oligonucleotidi sequenza
Sense (5 'a 3')
antisenso (5 'a 3’)
PAR-1
GTGATTGGCAGTTTGGGTCT
GCCAGACAAGTGAAGGAAGC
PAR-2
CCTGGCCATGTACCTGATCT
GACACTTCGGCAAAGGAGAG
PAR-3
GGTGTGGGCAACAGTTTTCT
GGACTCGCAAGTGTTGTGAA
β-actin
AGGGGCCGGACTCGTCATACT
GGCGGCAACACCATGTACCCT
Citometria a flusso
cellule sono state lavate in tampone fosfato salino (PBS), incubate per 30 minuti a 4 ° C con PBS contenente 20% inattivato al calore siero umano normale, nuovamente lavate e poi incubate per 30 min a 4 ° C con 15 nm di anticorpi monoclonali specifici (mAB) per PAR-1-4 umana (PE-coniugato; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA). citometria di flusso analisi sono state effettuate su un FACScan (BD Biosciences, San Jose ., cellule di controllo CA, USA) incubate con anticorpi non specifici PE-coniugato ottenute dagli stessi produttori sono stati usati per impostare la soglia per il parametro di fluorescenza, in modo tale che la frazione di cellule con fluorescenza positiva era & lt; 2,5% delle cellule totali. la percentuale di PAR-1-4 cellule positive è stata determinata dalla frazione di cellule nel campione incubato con anticorpi specifici che hanno superato la soglia per l'intensità del segnale di fluorescenza ottenuto con il campione di controllo.
analisi statistiche
Tutti i dati sono mostrato come media ± la deviazione standard (SD). dati QRT-PCR sono espressi come C
t (ciclo soglia), ΔC
t (C
t PAR mRNA - C
t β- actina mRNA) e relativa quantificazione (RQ, espressi come variazione volte). I cambiamenti piega di espressione PAR mRNA sono stati calcolati utilizzando il -ΔΔC
t metodo 2 [23]. t di Student
-test è stato utilizzato per il confronto tra i due gruppi. SPSS versione 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) è stato utilizzato per l'analisi statistica e P
≤ 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
Risultati
RT-PCR analisi del PAR in GECS
RT analisi -PCR di RNA estratto da GECS rivelato la presenza di PAR-1, PAR-2 e PAR-3 mRNA (Fig. 1). Nessun prodotto PCR è stato trovato PAR-4 (Fig. 1). Il risultato dimostra che PAR-1, PAR-2 e PAR-3 sono espressi in GECS, ma PAR-4 non è. Figura. 1 analisi RT-PCR di PAR mRNA in GECS. RT-PCR è stata effettuata utilizzando i primers specifici per ogni tipo di PAR, come descritto in Tabella 1. Il prodotti di PCR sono stati sottoposti ad elettroforesi attraverso un gel di agarosio 1,5%. Linee 1-6 rappresentano β-actina, PAR-4, par 3, PAR-2, PAR-1 e Marker separatamente. analisi RT-PCR ha rivelato la presenza di PAR-1, PAR-2 e PAR-3 mRNA in GECS. Nessun prodotto PCR è stato trovato per PAR-4
P. gingivalis
surnatante altera l'espressione genica PAR
L'attività proteolitica del surnatante da P. gingivalis
è stato dimostrato dopo 4, 8 e 16 ore. La preincubazione del surnatante con il TLCK proteasi mostrato significativamente ridotta attività proteolitica rispetto a quello surnatante nativa dopo 4 e 8 h (P
& lt; 0,05; Fig. 2). Per valutare l'effetto delle gingivalis P.
surnatante sulla espressione di PAR-1, PAR-2 e PAR-3 mRNAs, GECS state coltivate al 80% di confluenza e stimolate con surnatante per 6 h. L'analisi dell'espressione genica mediante QRT-PCR mostrava upregulation di PAR-2 mRNA rispetto alle cellule di controllo non trattati (P
& lt; 0,05; Fig. 3b). Al contrario, le espressioni mRNA di PAR-1 e PAR-3 erano significativamente inibiti (P
& lt; 0,05) in risposta a P. gingivalis
surnatante rispetto a quello delle cellule di controllo non stimolate (Fig. 3a, c) . La preincubazione dei P. gingivalis
surnatante con l'inibitore della proteasi TLCK abolito l'effetto e ripristinato i livelli di espressione di mRNA PAR a quello delle cellule non trattate. Controlli definiscono i utilizzando medie batterica vuoto e TLCK mostrato alcun effetto sull'espressione dell'mRNA di PAR-1, PAR-2 e PAR-3 (Fig. 3). I risultati sono stati in linea con gli studi precedenti [22]. Figura. 2 Le attività della proteasi di P. gingivalis
surnatante o surnatante TLCK-preincubate. attività della proteasi è stata misurata con un kit di proteasi Assay ™ ed è stato monitorato per 4, 8 e 16 ore. L'assorbanza del peptide dye-marcato è stata misurata a 570 nm per la determinazione dell'attività della proteasi. surnatante nativi hanno mostrato significativamente più alta attività proteolitica di surnatante TLCK-preincubate dopo 4 e 8 ore. le misurazioni sono state effettuate in triplicato. I dati sono mostrati come media con la deviazione standard (media ± SD). *, P
& lt; 0,05, rispetto ai valori di surnatante nativi
Fig. 3 PAR-1 (a), PAR-2 (b) e PAR-3 (c) espressione genica in risposta a P. gingivalis
surnatante. espressione del gene PAR è stata valutata mediante quantitativa real-time RT-PCR (QRT-PCR) in risposta a surnatante privo di cellule da P. gingivalis
e surnatante TLCK-preincubate in GECS. Dopo P. gingivalis
trattamento surnatante, l'espressione di PAR-2 è stato upregulated rispetto alle cellule di controllo non trattati. Al contrario, PAR-1 e PAR-3 espressione era significativamente downregulated. I dati sono mostrati come media con la deviazione standard (media ± SD). *, P
& lt; 0,05, rispetto ai valori di controllo. Controllo: senza stimolazione surnatante. P. gingivalis
S: P. gingivalis
surnatante
pars l'espressione delle proteine valutata mediante citometria di flusso
citometria a flusso ha mostrato l'espressione della proteina di PAR-1, PAR-2 e PAR-3 da GECS, ma non PAR-4 espressione (Fig. 4). Dopo P. gingivalis
trattamento surnatante per 6 h, l'espressione della proteina di PAR-2 è stato upregulated rispetto alle cellule di controllo non trattati (P
& lt; 0,05; Fig. 5). Al contrario, i livelli di proteina di PAR-1 e PAR-3 erano significativamente inibiti dopo il trattamento (P
& lt; 0,05). I risultati di citometria a flusso indicati i livelli di proteine PARs coerenti con i livelli di mRNA nei risultati di QRT-PCR. Figura. livello 4 proteine di PAR in GECS mediante citometria di flusso. a, b, c, d mostrano risultati rappresentativi della citometria a flusso analisi di PAR-1, PAR-2, PAR-3 e PAR-4, rispettivamente. Il risultato ha mostrato GECS espresso PAR-1, PAR-2 e PAR-3, ma non PAR-4. Linea nera: controllo isotipico. Linea verde: anti-PAR
Fig. 5 PAR-1 (a), PAR-2 (b) e PAR-3 (c) espressione della proteina in risposta a P. gingivalis
surnatante. espressione PAR è stata valutata mediante citometria di flusso in risposta a surnatante privo di cellule da P. gingivalis
e surnatante TLCK-preincubate in GECS. analisi di citometria a flusso sono stati eseguiti su un FACScan. Dopo P. gingivalis
trattamento surnatante per 6 ore, l'espressione di PAR-2 è stato upregulated rispetto alle cellule di controllo non trattati. Viceversa, PAR-1 e PAR-3 espressione era significativamente downregulated dopo il trattamento. I dati sono mostrati come media con la deviazione standard (media ± SD). *, P
& lt; 0,05, rispetto ai valori di controllo. Controllo: senza stimolazione surnatante. P. gingivalis
S: P. gingivalis
surnatante
Discussione
parodontite è un'infezione dei tessuti parodontali che sono la struttura di supporto per i denti. Nella struttura complessa dei tessuti periodontali, dell'epitelio gengivale è direttamente esposta a batteri parodontali e dei loro prodotti, per ricevere e trasmettere segnali, svolge un ruolo importante nel dialogo complessiva che si verifica tra patogeni e l'host. PAR sono espressi e funzione GECS come parte del sistema immuno-sorveglianza. Questi recettori sono chiaramente importanti per GECS risposte per l'ambiente che può includere i prodotti patogeni o fisiologici.
Quattro membri della famiglia PAR (PAR-1, -2, -3, -4 e) sono stati identificati finora. In questo studio abbiamo dimostrato che PAR-1, PAR-2 e PAR-3 sono espressi in GECS, ma PAR-4 non è espresso in GECS. Molti ricercatori hanno già segnalato l'espressione di PAR in un'ampia varietà di tipi di cellule, mentre c'era controversia sulla espressione di PAR [2, 3, 13, 17]. Ci sono anche alcuni studi sulla espressione di PAR in GECS, ma la maggior parte degli studi sono stati interessati sulla espressione e il ruolo di PAR-2. Sovraespressione di PAR-2 è stato positivamente associato con i parametri clinici infiammatorie e con i livelli di interleuchina-6 (IL-6), IL-8, fattore di necrosi tumorale alfa, matrice metalloproteasi-2 (MMP-2), MMP-8, il fattore di crescita degli epatociti e fattore di crescita endoteliale vascolare [5, 24, 25]. Solo una ricerca ha rilevato PAR-1, PAR-2 e PAR-3 nelle cellule KB mediante RT-PCR e PAR-1, PAR-2 e PAR-3 espressione in GECS di studi di immunoistochimica [17]. Nel nostro studio, RT-PCR e citometria a flusso sono stati utilizzati per analizzare l'espressione di PAR. I risultati sono stati confermati il PAR-1, PAR-2 e PAR-3 espressione in GECS.
In dell'epitelio gengivale, specifico per arginina cisteina proteasi (Arg-gingipain, RGP) da P. gingivalis
, un importante agente patogeno associata con periodontite cronica, installa PAR e indurre l'espressione di citochine infiammatorie [22, 26, 27]. La famiglia PAR è strutturalmente correlato al recettore famiglia pattern recognition (PRR), ma, come PRR, segnalano pericolo potenziale per l'ambiente attivando marcatori immunitarie innate e le risposte infiammatorie [28]. Tuttavia, poco si sa circa la loro funzione quando sono attivati per la loro enzimi agonisti, trombina e tripsina o tripsina-come enzimi, in dell'epitelio gengivale. PAR sono espresse da una vasta gamma di tipi di cellule e sono suggerite a svolgere ruoli importanti in processi fisiologici, come la crescita, lo sviluppo, l'infiammazione, la riparazione dei tessuti e dolore [29]. Il nostro studio ha dimostrato che l'espressione di PAR-2 è stato upregulated con P. gingivalis
trattamento surnatante rispetto alle cellule di controllo non trattati. Al contrario, PAR-1 e PAR-3 espressione era significativamente downregulated, dopo P. gingivalis
trattamento surnatante. Infatti, l'attivazione PAR-2 è stato associato a diverse condizioni infiammatorie croniche [3, 30-32]. Inoltre, in vitro ed in vivo hanno chiaramente suggerito che PAR-2 svolge un ruolo nell'infiammazione parodontale [15, 16, 33, 34]. PAR-1 attivazione, tramite trombina o artificiale attivando peptidi, è stato implicato come un potenziale regolatore della sia il dolore e l'infiammazione [35-37]. Un recente studio ha anche mostrato che il PAR-1 era espresso in tessuti gengivali [18] e PAR-1 attivazione trombina possono svolgere un ruolo nella riparazione e l'omeostasi dei tessuti parodontali [38]. Il ruolo di PAR-3 è di interesse perché la funzione di questo recettore apparentemente non segnalazione rimane oscuro [9, 39, 40]. La capacità di PAR-3 per generare un segnale intracellulare rimane in dubbio perché manca il dominio coda citoplasmatica mostrato in altre PARs, che è necessario per accoppiarsi con proteine G [9]. Un recente studio ha dimostrato che il PAR-3 è un determinante fondamentale di PAR-1 Funzione e PAR-3 possono mitigare gli effetti di PAR-1 nell'attivazione di risposte endoteliali, come ad esempio l'infiammazione vascolare [41]. PAR-3 regola la segnalazione PAR1 da recettore dimerizzazione. C'è stata polemica sul ruolo del PAR. In alcuni tessuti hanno un ruolo pro-infiammatorio [42], mentre in altri tessuti che sembrano avere un effetto anti-infiammatorio o di protezione [43]. Questa funzione di protezione può essere agevolato dalla sovraregolazione di PAR-2 e la down-regulation di PAR-1 e PAR-3 l'espressione genica in risposta a P. gingivalis
proteasi. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi per chiarire pienamente il ruolo di PAR-1, PAR-2, e PAR-3 nella patogenesi della parodontite.
Conclusioni
Lo studio qui descritto conferma il ruolo di PAR-1, PAR -2 e PAR-3 nelle risposte epiteliali gengivali che possono essere correlati a infiammazione parodontale. Di conseguenza, i meccanismi dettagliati alla base degli effetti mediati dai principali Pars di parodontite, compresa la loro correlazione con citochine, richiedono ulteriori ricerche. Queste informazioni fornirà una migliore comprensione dello sviluppo delle malattie parodontali e informare la strategia per l'identificazione di approcci terapeutici per queste condizioni.
Dichiarazioni
Ringraziamenti
Ringraziamo i dentisti (Dipartimento dentale, Sir Run Run Shaw Ospedale, Facoltà di Medicina, Università di Zhejiang) per la loro assistenza. Ringraziamo il Dott Yu Yunsong e il suo gruppo di ricerca (Dipartimento di Malattie Infettive, Sir Run Run Visualizza Ospedale, Facoltà di Medicina, Università di Zhejiang) per il loro supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Science Foundation naturale della Cina (n ° 81.000.447)
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concorrenti. interessi
Gli autori dichiarano di non avere alcun interesse in competizione.
contributi degli autori
Dr. Zhang eseguito gli esperimenti e ha scritto il manoscritto. Dr. Li era responsabile della collezione di tessuti gengivali. Dr. Hu ha aiutato a eseguire gli esperimenti. Il dottor Sheng è stato responsabile per l'analisi dei dati. Prof. Chen concepito e progettato gli esperimenti. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.
