clinico controllato randomizzato
Abstract
sfondo
cura orale è importante per la salute orale e sistemica, soprattutto per gli anziani gli individui istituzionalizzati e pazienti compromessi. Tuttavia, il controllo della placca convenzionale meccanico è spesso difficile per questi pazienti a causa del dolore o il rischio di aspirazione. Anche se la terapia fotodinamica antimicrobica (aPDT), che è considerato una alternativa o in aggiunta alla approcci meccanici, ha un potenziale applicazione come un metodo meno stressante di controllo della placca quotidiano, è stata riportata alcuna applicazione clinica di questa tecnica.
Metodi
Noi studiato l'effetto inibitorio di una combinazione di toluidina O blu (TBO), e un rosso diodi emettitori di luce (LED) sulla formazione della placca dentale nei volontari sani. La concentrazione ottimale di TBO è stata determinata in vitro
esperimenti preliminari in per valutare l'effetto battericida di aPDT su Streptococcus oralis
e di chiarire la sua sicurezza in cellule di fibroblasti. Per controllare il meccanismo di TBO-mediata aPDT, la qualità e la quantità delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) generato durante aPDT sono stati esaminati anche usando la spettroscopia di risonanza di spin elettronico (ESR). Successivamente, l'effetto inibitorio di aPDT sulla formazione della placca dentale è stata studiata in undici soggetti uno studio clinico pilota. I premolari mandibolari destra o sinistra sono stati assegnati in modo casuale al trattamento (con aPDT) o di controllo (senza aPDT) gruppi. In totale, aPDT stato applicato sei volte (due volte al giorno) per i denti nel gruppo di test per un periodo di quattro giorni. Il quarto giorno, lo studio ha concluso e sono state effettuate le analisi.
Risultati
Una combinazione di 500 o 1000 mg /ml TBO e irradiazione LED per 20 s riduce sensibilmente il numero di unità formanti colonia di Streptococcus oralis
. La citotossicità di aPDT era paragonabile a quella di antisettici standard utilizzati nella cavità orale. I radicali ossidrile sono stati rilevati attraverso l'analisi ESR, ma ossigeno singoletto non era. Uno studio randomizzato controllato dimostrato che aPDT con 1.000 mg /ml TBO e irraggiamento LED rosso significativamente soppressa la formazione della placca dentale senza danneggiare i denti o tessuti circostanti
. Conclusioni
aPDT ha il potenziale per essere una modalità tecnica romanzo promettente per dentale controllo della placca.
registrazione di prova
Questo studio è stato registrato con la University Hospital Medical Information Network Clinical Trials Registry (numero UMIN000012504).
Parole
antimicrobica terapia fotodinamica LED rosso illuminato blu di toluidina controllo della placca dentale O ossidrile radicale randomizzato e controllato elettronico materiale supplementare
La versione online di questo articolo (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-152) contiene materiale supplementare, che è disponibile per gli utenti autorizzati
Sfondo
terapia fotodinamica antimicrobica (aPDT) è una procedura in cui l'attivazione dall'ossigeno di un fotosensibilizzatore da luce (principalmente laser) porta alla generazione di citotossici specie reattive dell'ossigeno (ROS). Recentemente, questa procedura è stata introdotta in campo medico [1, 2] e dentali [3-6] campi. Oltre conferma del suo potenziale antimicrobica in vitro
[7, 8], precedenti studi clinici hanno valutato l'applicazione aPDT per il trattamento di acne vulgaris in dermatologia [9], e parodontale [10, 11], endodontico [12 , 13], e peri-impianto [14] malattia in odontoiatria. Inoltre, dal momento che utilizza composti di luce generati, aPDT può essere in grado di debellare i batteri multiresistenti senza influenzare l'insorgere di ulteriore resistenza a quei batteri [15]. L'aumento
prove che l'igiene orale è fondamentale per la salute sistemica, soprattutto nei pazienti compromessi. In precedenza, Yoneyama et al
. ha riferito che una buona igiene orale riduce il rischio di polmonite e il tasso di mortalità nei soggetti anziani istituzionalizzati [16, 17]. Abe et al
. anche suggerito che l'igiene orale è efficace nella prevenzione dell'influenza [18]. Il National Institutes of Health (NIH) ha raccomandato che "tutti i malati di cancro dovrebbero avere un esame orale prima dell'inizio della terapia del cancro, e il trattamento della preesistente o malattia orale concomitante è essenziale per ridurre al minimo le complicanze orali in tutti i pazienti affetti da cancro" [19 ]. Convenzionalmente, strumenti meccanici come uno spazzolino da denti, filo interdentale, o pennello spugna realizzare la rimozione della placca batterica dentale. Tuttavia, il controllo della placca meccanico è tecnicamente impegnativo, e può essere fisicamente stressante per i soggetti con una ridotta gamma di movimento del braccio, o una condizione medica che impedisce loro di mantenere una buona igiene orale. Pertanto, l'applicazione di mezzi non meccanici per controllare la formazione della placca dentale potrebbe essere di grande interesse.
Nel 1993, Wilson et al
. [20] ha proposto aPDT come alternativa ai mezzi farmaceutici e meccanici di eliminare la placca batterica dentale. Tuttavia, non ci sono rapporti clinici sull'uso di aPDT come metodo cura orale preventiva per il controllo della formazione della placca dentale. Se aPDT potrebbe essere utilizzato come un nuovo metodo per controllare la formazione della placca dentale, i pazienti possono essere in grado di ricevere cura del cavo orale efficiente senza stress sgradevoli che accompagnano convenzionale pulizia meccanica dei denti, come sanguinamento o dolore.
Di conseguenza, abbiamo voluto indagare gli effetti inibitori del aPDT nella cavità orale di volontari sani come uno studio pilota, prima della sperimentazione clinica che coinvolgono pazienti reali. Ci siamo concentrati su toluidina O blu (TBO), che è un classico fotosensibilizzante di sale phenothiazinium, perché i suoi effetti battericidi sono stati già chiariti in vitro
precedenti studi in [8, 21-23], nonché nel trattamento della parodontite [4]. Inoltre, gli effetti battericidi di TBO-mediata aPDT utilizzando rosso diodi emettitori di luce ad alta potenza (LED) su due batteri tipici parodontopatogeni, Porphyromonas gingivalis
e Aggregatibacter actinomycetemcomitans
, sono anche stata dimostrata in vitro
[ ,,,0],3].
Prima dello studio pilota in volontari sani, gli effetti antimicrobici di aPDT su oralis Streptococcus (S. oralis),
uno dei tipici batteri anaerobi facoltativi nella placca dentale umana, e l'effetto citotossico di aPDT su fibroblasti, sono stati esaminati in vitro
. Inoltre, la caratterizzazione dei ROS generati durante il trattamento aPDT è stato indagato dalla risonanza di spin elettronico (ESR)
Metodi
Esperimento 1:. Valutazione in vitro
degli effetti battericidi di aPDT su Streptococcus oralis
preparazione della sospensione batterica planctonici zona S. oralis
OMZ 607 è stata mantenuta su piastre di agar sangue (E-MP23; Eiken Chemical Co. Ltd., Tochigi, Giappone) a 37 ° C in condizioni aerobiche. Un un'ansa di ciascun ceppo è stato inoculato in 9 ml di infusione, cuore, cervello (BHI) brodo, e coltivate anaerobicamente a 37 ° C per 16 h. Successivamente, 500 microlitri della sospensione cellulare batterica è stata trasferita in 5 ml di brodo BHI fresco, e in seguito incubate anaerobicamente a 37 ° C per circa 5 ore. Infine, una sospensione batterica di 10 8 cellule /ml è stato preparato utilizzando una camera di conteggio, e conservati in ghiaccio fino al momento dell'uso.
Fotosensibilizzante e la sorgente luminosa
blu di toluidina O (TBO) in polvere (massimo assorbimento = 626 nm, Sigma, St. Louis, MO) è stato sciolto a concentrazioni di 100, 500, 1000 mg /ml in soluzione salina sterile. Dispositivo (elementi attivi = AlInGaP, lunghezza d'onda = 600-700 nm, picco di lunghezza d'onda = 660 nm, la densità di potenza = 1.1 Una spia rossa prototipo ad alta potenza W /cm 2, dimensione dello spot = 9 mm al fine dispositivo; modificato da PenCure ™ con un profondo LED 660 nm banda rossa [LZ1-00R205; LedEngin, Inc., Santa Clara, CA]. da J Morita Mfg Kyoto, Giappone) è stato utilizzato come fonte di luce. Il tempo di irradiazione del LED è stata fissata a 20 s, secondo i risultati del nostro vitro
precedente studio in [3], che ha dimostrato di eliminazione batterica efficace utilizzando la procedura aPDT TBO-mediata con 20 s irradiazione.
Fotosensibilizzazione letale
un'aliquota di 30 microlitri di sospensione batterica è stata mescolata con soluzione salina o un volume uguale di soluzione TBO alle varie concentrazioni (100, 500, 1000 mg /ml) nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti a fondo piatto sterile (Falcon®; Becton Dickinson Co., NJ). Le concentrazioni finali di TBO nella soluzione mista erano 50, 250, e 500 pg /ml, rispettivamente. Dopo incubazione a temperatura ambiente per 20 s, irradiazione LED è stata eseguita per 20 s. L'estremità di uscita della luce (diametro = 8 mm) del LED è stato posizionato in corrispondenza con l'apertura del pozzo (diametro = 7 mm) durante l'irradiazione. La distanza tra la superficie superiore della sospensione batterica mista e l'estremità di uscita della luce era di 7 mm e la profondità della soluzione mista era di 3 mm. La potenza effettiva alla superficie sospensione batterica era 310 mW, e la densità di potenza è stato calcolato in 0,94 W /cm 2 (energia totale 6,2 J per 20 s irradiazione). Ogni sospensione batterica è stato esposto ad irradiazione singolarmente LED dopo la preparazione della sospensione in ciascun pozzetto. e un gruppo di controllo non trattato sono stati preparati per ogni bene (irradiazione solo ha portato l'esposizione a 100, l'irradiazione solo 500, 1000 mg /ml TBO, combinazione di TBO e 20 s LED e 20 s) Un totale di 7 gruppi sperimentali.
Dopo il trattamento, una aliquota di 10 microlitri da ogni pozzetto è stato diluito serialmente 10 2-10 5 volte con soluzione salina, e 10 ml di campioni diluiti sono stati placcati in triplicato su piastre di agar sangue. Tutte le procedure compresa la preparazione soluzione, irradiazione e campioni placcatura sono state eseguite per ogni pozzetto singolarmente (ossia uno per uno). Le piastre a 96 pozzetti sono state incubate aerobicamente a 37 ° C per 48 h, e il numero di unità formanti colonie (CFU) sono stati determinati. L'esperimento è stato ripetuto per cinque volte in modo indipendente
Esperimento 2:. Effetto citotossico di aPDT sui fibroblasti
cellulare cultura
linea cellulare di fibroblasti del mouse L929 (Riken, Saitama, Giappone) è stato colto in 75 cm 3 tessuto fiasche di coltura a 20 ml RPMI 1640 medium (Nacalai Tesque, Kyoto, Giappone) contenente 100 U /ml penicillina, 100 U /ml di streptomicina, e integrato con 2,5 mmol /l L-glutamina e 5% di siero fetale di vitello inattivato al calore (Gibco Costar®;, Corning, NY), e incubate a 37 ° C
trattamento con cellule
1 × 10 4 cellule sono state seminate in ogni pozzetto di 96 pozzetti neri test (fondo chiaro piatta ®). in un incubatore umidificato con 5% di CO 2 per 48 h fino a quando il monostrato cellulare divenne confluenti.
per gruppi sperimentali, dopo la rimozione del mezzo, TBO 100 microlitri (100, 500, oppure 1000 mcg /ml) è stato aggiunto a ciascun pozzetto. Le cellule sono state incubate per 20 s, e la soluzione è stata poi TBO aspirati da tutti i pozzetti. Dopo che le cellule sono state lavate due volte con 100 microlitri di PBS, medio 100 microlitri è stato aggiunto al pozzetto, e subito la cella è stata esposta alla luce del LED dalla parte superiore della piastra a 0.94 W /cm 2 per 20 s ( energia totale = 6.2 J). I controlli erano o non trattati o trattati con TBO (100, 500, 1000 mg /ml) soltanto, e sono state lavate due volte con PBS.
Il gruppo di cellule trattate con 1000 mcg /ml TBO e LED è stato confrontato con un gruppo di cellule trattate con 2,5-3% H 2O 2 (Oxydol; Yoshida Pharmaceutical Co. Ltd., Saitama, Giappone), o cloruro di benzalconio 0,025% (OSVAN®; Nihon Pharmaceutical Co. Ltd., Tokyo , Giappone), che sono i antisettici standard per mucosa orale. Le cellule sono state esposte a H 2O 2 e benzalconio cloruro per 20 s, e lavate due volte con PBS. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato e ripetuti cinque volte.
Saggio di citotossicità
Un saggio colorimetrico contenente il composto di tetrazolio 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-solfofenil) -2H-tetrazolio, sale interno; MTS (CellTiter 96® acquosa Una soluzione Cell Proliferation Assay; Promega, WI), è stata utilizzata per determinare la vitalità cellulare [21]. Chi sono stati aggiunti a ciascun pozzetto 100 microlitri aliquote di terreno di crescita e 20 ml di MTS reagente. Dopo incubazione per 2 ore a 37 ° C in un CO 5% 2 incubatore, l'assorbanza di ciascun pozzetto è stata misurata a 490 nm usando un lettore di micropiastre e la vitalità cellulare è stata calcolata
Esperimento 3:. Analisi di ROS generato durante aPDT
spettroscopia ESR è stato utilizzato per la valutazione qualitativa e quantitativa dei ROS generato durante aPDT. I reagenti trappola di spin 2,2,6,6-tetrametil-4-piperidinolo (4-OH-TEMP; 98% di purezza; Sigma), e 5,5-dimetil-1-pirrolina-N
-oxide (DMPO ; Dojin Chemicals, Kumamoto, Giappone) sono stati utilizzati per l'ossigeno singoletto e rilevazione radicali idrossile, rispettivamente. Una miscela di 800 microlitri di PBS, 100 microlitri 1000 mcg /ml TBO, e 100 microlitri 4-OH-TEMP è stato utilizzato per misurare l'ossigeno singoletto. Una miscela di 400 microlitri di PBS, 50 microlitri 50 mM DMPO, e 50 ml di 1000 mg /ml TBO è stato utilizzato per misurare radicali idrossilici. Le misurazioni sono state ottenute dopo il trasferimento delle miscele ad una cuvetta piatta quarzo e l'esposizione alla luce LED rosso per 20 s. La misurazione è stata effettuata utilizzando ESR (JES-RE 3X, JEOL, Tokyo, Giappone) collegato ad un ESR Data Analyzer WIN-RAD (Research radicale, Tokyo, Giappone) ai seguenti impostazioni dello strumento: microonde potenza = 8 mW, campo magnetico = 335,8 mT, modulazione di larghezza = 0,079 mT, spazzare tempo = 1 min e costante di tempo = 0,03 s. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato a temperatura ambiente
Esperimento 4:. Effetto di inibizione di aPDT sulla formazione della placca dentale
Un studio clinico randomizzato in singolo cieco aperto con split-mouth (ogni soggetto ha ricevuto test e controllo trattamenti, ciascuno ad un lato separata della bocca) è stata condotta per valutare l'effetto inibitorio di aPDT sulla formazione della placca dentale (Figura 1). Figura 1 Consort diagramma di flusso della sperimentazione clinica dell'efficacia di aPDT per l'inibizione della placca dentaria.
Soggetti
Questo studio clinico è stato approvato dal Comitato Etico della Facoltà di Odontoiatria, Tokyo Medical and Dental University (TMDU) (n ° 836), ed è stata effettuata in conformità con la Dichiarazione di Helsinki. Questo studio è stato registrato con la University Hospital Medical Information Network Clinical Trials Registry (numero UMIN000012504) ed è stata eseguita seguendo le linee guida CONSORT per la sperimentazione clinica sui file 1. Il reclutamento dei soggetti e sperimentazione sono state condotte dal gennaio 2013 al febbraio 2013 presso il Dipartimento di Parodontologia , Dental Hospital di TMDU.
Undici dentisti volontari sono stati reclutati per questo studio, e il consenso informato è stato ottenuto da tutti i partecipanti. I soggetti inclusi sette uomini e quattro donne, di età compresa 26-33 anni (media = 28.0 ± 2.3 anni). I criteri di inclusione per soggetti iscrizione incluse buona salute generale, senza apporto antimicrobica negli ultimi tre mesi, la presenza di almeno 20 denti, la normale eruzione tutti premolari mandibolari, l'assenza di gonfiore o arrossamento della gengiva, e l'assenza di siti con profondità di sondaggio ≥ 4 mm
. Esempio dimensioni calcolo
La dimensione del campione è stato calcolato utilizzando una potenza statistica del 80%, di tipo I errore tasso del 5%, e una differenza presunta del 10% e di deviazione standard del 10% i valori di area di deposizione della placca. Sulla base di questi dati, il numero di soggetti necessario per condurre questo studio è stato calcolato come 10. Tuttavia, considerando la possibilità di avere un drop-out soggetto, iscrizione di 11 partecipanti è stato progettato.
La aPDT procedimento
il primo e secondo premolari sui lati sinistro e destro della mandibola sono stati valutati. La selezione dei denti è basata sulla posizione, e l'idoneità per l'irradiazione del LED, fotografare, e raccolta del campione, così come l'accumulo di placca date le condizioni di studio. La sperimentazione clinica è stata effettuata nel corso di quattro giorni, che iniziano e terminano la sera (Figura 1). Il primo giorno, la placca dentale depositato sulle superfici buccali e linguali dei premolari mandibolari su entrambi i lati è stata tinta di rosso con una soluzione di targa Rivelatrice (PROSPEC®, GC, Tokyo, Giappone). La placca sopra e sottogengivale è stato accuratamente rimosso per pulizia dentale professionale (PTC) utilizzando un misuratore ultrasonico, così come una tazza di gomma e un pennello cono-figura montato su un manipolo micromotore.
Successivamente, destra o premolari lato sinistro sono stati randomizzati per il trattamento (con aPDT) o come controlli non trattati (senza aPDT) utilizzando il metodo busta, in cui i partecipanti selezionati casualmente una busta opaca contenente una nota ripartizione lato trattamento (destro o sinistro). TBO (1 mg /ml) è stato applicato delicatamente alle superfici buccali e linguali dei denti gruppo di test utilizzando una piccola pallina di cotone. Dopo 10 s, TBO è stato spazzato via dal risciacquo della bocca. Dopo il lavaggio, LED è concentrata a 90 ° su ogni superficie vestibolare e linguale di ciascun dente per 20 s, risultando in un tempo di radiazione totale di 80 s sulle quattro superfici di due premolari in ciascuna sessione di trattamento (Figura 2). In totale, aPDT è stato applicato per sei volte (due volte al giorno, una volta al mattino e una alla sera) per i denti gruppo di prova per quattro giorni. Durante il periodo di prova, i partecipanti sono stati proibiti dalla spazzolatura premolare e denti adiacenti, e di utilizzare colluttorio. Il quarto giorno, lo studio ha concluso e sono state eseguite analisi. Figura 2 fotografie che mostrano la procedura clinica aPDT. (A) Prima di aPDT. (B) Dopo la rimozione iniziale della placca dentale (prima della prima procedura aPDT). (C) Durante l'applicazione di TBO. (D) Dopo l'applicazione di TBO e bocca risciacquo. (E) Durante l'irradiazione LED. (F) Dopo l'irraggiamento LED.
Determinazione della superficie dentale deposizione della placca
Dopo le superfici dei denti sono stati tinti con una soluzione placca divulgazione, la buccale e linguale del primo e del secondo premolare nel trattamento e controllo gruppi sono stati fotografati con un angolo di 90 ° rispetto alla superficie del dente. Le fotografie sono state scattate linguale con uno specchio progettato appositamente per mandibolare linguale fotografia (fotografica specchio ST per linguale 13262, YDM Corp., Tokyo, Giappone). L'area di colore rosso-macchiata della deposizione placca dentale, così come l'area di tutta la superficie del dente sui buccali e linguali lati, è stato determinato sulla fotografie utilizzando un programma software (Photoshop CS5 Extended, Adobe Systems Inc., CA). Per ridurre la variabilità inter, la determinazione delle aree è stata eseguita in modo indipendente per ogni sito da due esaminatori cieco ai gruppi sperimentali (A. A. e Y. T.), e la media delle due misure è stato utilizzato come il valore dell'area rappresentante di ciascun sito. La percentuale della superficie della deposizione della placca rispetto alla superficie totale del dente è stata calcolata.
Determinazione del numero di batteri della placca dentale raccolti dalla superficie linguale dei secondi premolari
La superficie linguale dei secondi premolari stato selezionato come il sito rappresentativo per la raccolta della placca, poiché la superficie linguale solito ha accumulo di placca più costante rispetto alla superficie vestibolare, e secondo premolare ha una superficie linguale maggiore del primo premolare. campioni di placca sopragengivali sono stati raccolti con una curette Gracey dalla superficie linguale del secondo premolare prima del trattamento (baseline), e 4 giorni dopo il completamento della sperimentazione clinica da esaminatori in cieco (A. A. o Y. T). Il numero di batteri è stata misurata usando un contatore batterica disponibili sul lato sedia (rivelatore batteri orali Rapid; Panasonic Healthcare, Tokyo, Giappone), che era adatto per rapidamente contare un gran numero di batteri. Il dispositivo contatore impiegato il metodo di misurazione dell'impedenza dielettroforetica, che è stato segnalato per dimostrare una buona correlazione con il metodo della coltura convenzionale [24].
Analisi statistica dei dati
dal primo esperimento sono stati valutati mediante analisi della varianza (ANOVA) , seguita da test di Dunnett. L'influenza di TBO e irraggiamento LED sui fibroblasti è stato analizzato utilizzando due vie fattoriale ANOVA, seguito dal test di Tukey. Il confronto tra l'applicazione combinata di 1000 mg /ml TBO e irraggiamento LED con le due antisettici conosciute è stata effettuata con ANOVA, mentre la quantità di ROS generati durante aPDT è stato analizzato utilizzando un t-test
. I dati del quarto esperimento sono stati analizzati utilizzando un paired t-test
. Tutte le analisi sono state eseguite utilizzando il programma software statistico JMP 8.0 (SAS Institute, Cary, NC), con l'eccezione di due vie fattoriale ANOVA, che è stato eseguito da PASW 18.0 (SPSS, IBM, Tokyo, Giappone). A P
& lt; 0.05 è stato considerato statisticamente significativo per tutte le analisi
Risultati
Esperimento 1:. Battericida effetto di aPDT su S. oralis in vitro
nei gruppi trattati con LED o TBO da solo, il numero di CFU non differiscono da quelle del controllo non trattato. Al contrario, i gruppi che hanno ricevuto TBO + LED esposti numero di CFU che erano significativamente inferiore a 500 e 1000 mg /ml (P
& lt; 0,01 e P
& lt; 0,05, rispettivamente), rispetto al controllo. Il minor numero di CFU è stato osservato nel gruppo trattato con 500 mg /ml TBO LED + (riduzione del 1,42 log, 96,2% tasso di uccidere, Figura 3). Figura 3 In effetti di riduzione di batteri in vitro di aPDT con TBO e LED S. oralis. Le barre blu mostrano l'effetto di TBO soltanto e barre rosse presentano l'effetto di TBO con irradiazione LED. I dati rappresentano media ± DS (n = 5)
Esperimento 2:. Effetto citotossico di aPDT sui fibroblasti
TBO da sola ha causato una diminuzione dose-dipendente della vitalità cellulare. A due vie fattoriale ANOVA ha rivelato che il LED, TBO, e TBO + LED significativamente ridotto la vitalità cellulare (P
& lt; 0,01). Inoltre, l'applicazione di LED a tutte le concentrazioni di TBO migliorato la riduzione della vitalità cellulare (Figura 4A). Tuttavia, la vitalità delle cellule trattate con 1000 mcg /ml TBO e irradiazione LED non era significativamente differente dalla vitalità delle cellule trattate con 2,5-3% H 2O 2 o 0,025% cloruro di benzalconio (Figura 4B). Figura 4 effetti citotossici di aPDT su fibroblasti. (A) L'effetto della concentrazione TBO sulla vitalità cellulare. (B) Confronto di vitalità cellulare tra il aPDT e antisettici standard. I dati rappresentano media ± DS (n = 5)
Esperimento 3:. Analisi dei ROS generati durante aPDT
non esistevano differenze significative nella produzione di ossigeno singoletto tra la PBS + LED e il TBO + gruppi LED (Figura 5A). Tuttavia, rispetto al controllo, la produzione di radicale ossidrile è risultata significativamente più alta nel gruppo LED TBO + (P
& lt; 0,01, figura 5B). Lo specifico DMPO-OH rotazione addotto, che dimostra la produzione di radicali idrossile, è stata osservata nel gruppo LED TBO + (Figura 6). Figura 5 ROS rilevato durante la procedura di aPDT TBO-mediata. (A) ossigeno singoletto. (B) ossidrile radicale.
Figura 6 tipico spettro ESR durante la procedura di aPDT TBO-mediata.
Esperimento 4: effetto inibizione della aPDT sulla formazione della placca dentale
Non sono state osservate complicanze sistemiche o locali dopo l'applicazione aPDT durante il periodo sperimentale. La colorazione blu residua sulla gengiva seguente applicazione TBO non era visibile macroscopicamente, ed è stato osservato solo immediatamente dopo l'applicazione. La colorazione era sia minimo e temporaneo, e non ha causato problemi estetici per i soggetti.
La formazione della placca sui denti gruppo aPDT era ovviamente inibito dopo quattro giorni di aPDT, che era evidente nelle fotografie intraorali rappresentativi (Figura 7). Le percentuali di placca aree di deposizione a buccale totale (Figura 8A) e superfici dentali linguali (Figura 8B) sono risultati significativamente ridotti nel gruppo aPDT (buccale = 14 ± 9,1% e linguale = 12 ± 5,4%, media ± SD, rispettivamente), rispetto al gruppo di controllo (buccale = 25 ± 13% e linguale = 21 ± 7,0%, rispettivamente; P
& lt; 0.01). Figura 7 I risultati di uno studio clinico di efficacia di aPDT per l'inibizione della placca dentale. Fotografie di premolari mandibolari di soggetto # 6 dopo aPDT. Buccale (A) o linguale (C) superficie dei denti gruppo aPDT e buccale (B) o linguale (D) superficie dei denti di controllo.
Figura 8 Il rapporto tra l'area della placca depositato alla superficie totale di buccale ( a) e linguale dei denti (B) di superficie in premolari mandibolari.
Nessuna differenza significativa è stata rilevata al basale tra il gruppo aPDT (6,17 ± 0,38 log) e il gruppo di controllo (6,29 ± 0,39 log; P = 0,49
) del numero totale di batteri nella placca dentale raccolto dal superficie linguale del secondo premolare. Tuttavia, il numero totale di batteri nella placca dentale era significativamente più basso di 4 giorni dopo la sperimentazione clinica nel gruppo aPDT (6,17 ± 0,49 log) rispetto al gruppo di controllo (6,68 ± 0,48 log; P
& lt; 0,01; Figura 9). Figura 9 Il numero di batteri nella placca dentale raccolti dal secondo premolare.
Discussione
A nostra conoscenza, questo è il primo studio clinico per dimostrare l'efficacia di aPDT nell'inibire la formazione della placca dentale sui denti senza indurre effetti nocivi per ospitare i tessuti. Inoltre, questo studio ha confermato che TBO con LED rosso effettivamente ridotto i batteri S. oralis,
che è conosciuto come un colonizzatore iniziale nella formazione della placca dentale, ed è spesso rilevato nel sangue di pazienti che soffrono di endocardite infettiva [25, 26]. L'uso di TBO con un dispositivo LED ad alta potenza e 20 s tempo di irraggiamento, ha determinato una significativa riduzione dose-dipendente CFU in vitro
. Tuttavia, la riduzione è stata meno quando 1000 TBO ug /ml (concentrazione finale di 500 mg /ml) è stato utilizzato rispetto a quando è stato applicato a 500 pg /ml (concentrazione finale di 250 mg /ml). Una possibile spiegazione è il fatto che il /ml TBO soluzione batterica mista di colore blu 1000 mcg era troppo buio per la luce rossa di penetrare attraverso la soluzione al fondo della piastra a 96 pozzetti, e quindi la sensibilizzazione dei TBO mediante irradiazione LED era potenzialmente bloccato. Ciò nonostante, 1000 TBO mg /ml è stata utilizzata perché in situazioni cliniche, la diluizione immediata di TBO con la saliva e la sua diffusione superficiale sulla superficie del dente potrebbe portare alla più efficiente di sensibilizzazione luce di TBO rispetto assistito in vitro
. Nel presente studio, l'attenzione si è concentrata solo su S. oralis
; Tuttavia, la formazione di biofilm dentale consiste di diversi colonizzatori primari e complesse interazioni inter-microbici. Pertanto, molti altri batteri formando la placca tra cui Actinomyces viscosus
e Streptococcus sanguis
dovrebbero essere studiati in studi futuri.
Per quanto riguarda la sicurezza della procedura, TBO influenzato negativamente da solo la vitalità di fibroblasti in una concentrazione- dipendente manner, e l'applicazione di LED migliorato l'effetto. Tuttavia, in vitro
riduzione della vitalità cellulare nelle attuali condizioni aPDT (irraggiamento 1000 TBO mg /ml con 20 s LED) non ha superato quella osservata con altri antisettici, che ha indicato che la citotossicità della aPDT era entro i livelli tradizionali . Inoltre, anche se i rapporti precedenti hanno indicato la resistenza dei batteri agli antisettici come benzalconio cloruro, che è un tensioattivo cationico di ammonio quaternario che interrompe la membrana lipidica delle cellule [27, 28], la mancanza di resistenza batterica a seguito dell'applicazione di aPDT sarebbe un'altra beneficiare in applicazione clinica [29]. Nel presente studio, però, abbiamo osservato solo citotossicità acuta a 2 ore dopo singola applicazione di aPDT, e, quindi, ulteriori studi sono necessari per studiare l'influenza a lungo termine di aPDT sulla proliferazione delle cellule, così come l'azione cumulativa seguenti applicazioni ripetute.
l'analisi dei ROS generate durante TBO-mediata aPDT portato nel romanzo constatazione che il radicale ossidrile è stato il prodotto primario. Sebbene il meccanismo di aPDT [30] è generalmente ritenuto avvenire da un tipo I processo, che produce un radicale ossidrile mediante trasferimento di elettroni, o un processo di tipo II, che produce ossigeno singoletto da trasferimento di energia, senza modalità di morte cellulare per TBO mediata aPDT è stata chiarita. ossigeno singoletto è considerato come le principali specie dannose in aPDT [31], e il comune blu di metilene fotosensibilizzante è un produttore noto di ossigeno singoletto. Nel nostro studio pilota precedente (dati non riportati), abbiamo confermato la produzione di ossigeno singoletto in metilene aPDT blu-mediata. Tuttavia, l'analisi ESR chiaramente rivelato che il radicale ossidrile è stato il prodotto predominante di TBO-mediata aPDT. Inoltre, Tipo macchinari sono stato speculato per svolgere un ruolo importante in questa procedura aPDT.
Seguito i risultati delle sperimentazioni in vitro
, abbiamo tentato l'applicazione clinica della aPDT per l'inibizione della formazione di placca dentale, e osservato un significativa soppressione della deposizione di placca sui denti trattati con aPDT. La durata quadriennale giorno della sperimentazione clinica è stata breve, e quindi una maggiore durata era desiderabile. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.
