Abstract
sfondo
Porphyromonas gingivalis
ha dimostrato di invadere la osteoblasti ed inibire la loro differenziazione e mineralizzazione in vitro. Tuttavia, non è chiaro se P. gingivalis
possono invadere osteoblasti in vivo e in che modo questo potrebbe influenzare le dinamiche alveolari osteoblasti /osteoclasti. Questo studio si propone di rispondere a queste domande utilizzando un modello di topo sotto parodontite ripetitivi P. gingivalis
vaccinazioni.
Metodi Compra di 3 mesi di età BALB /cByJ topi femmina, 10
9 CFU di P. gingivalis
sono stati inoculati sul margine gengivale dei molari superiori 4 volte ad intervalli di 2 giorni. Dopo 2 settimane, sono stati applicati altri 4 inoculazioni a intervalli di 2 giorni. Calceina è stato iniettato 7 e 2 giorni prima di sacrificare animali per etichettare l'osso neoformato. Quattro settimane dopo l'inoculazione finale, i topi sono stati sacrificati e della mascella raccolti. Immunoistochimica, micro-CT, e Istomorfometria osso sono stati eseguiti su campioni. infezione Sham con solo veicolo era il controllo
. Risultati
P. gingivalis
è stato trovato per invadere epiteli gengivale, fibroblasti del legamento parodontale, e osteoblasti alveolari. Micro-CT mostrato riassorbimento dell'osso alveolare e significativa riduzione della densità minerale ossea e contenuti nei topi infettati rispetto ai controlli. istomorfometria Bone ha mostrato una diminuzione in osteoblasti, un aumento di osteoclasti e riassorbimento osseo, e sorprendentemente maggiore formazione ossea osteoblasti in topi infettati rispetto ai controlli.
Conclusioni
P. gingivalis
invade osteoblasti alveolari in modello di topo periodontite e causare la perdita di osso alveolare. Sebbene P. gingivalis
sembra sopprimere piscina osteoblasti e migliorare il riassorbimento osseo osteoclastico, la capacità di formazione ossea è temporaneamente elevati nei topi infettati, eventualmente attraverso alcuni meccanismi compensational antimicrobiche.
Parole
osteoblasti P. gingivalis materiale supplementare
Invasion Micro-CT Bone istomorfometria elettronica
La versione online di questo articolo (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-89) contiene materiale supplementare, che è disponibile per gli utenti autorizzati <. br> Sfondo
parodontite colpisce fino al 20% della popolazione del mondo [1]. È un'indicazione di cattiva salute orale ed è legato alla scarsa salute generale e una qualità della vita compromessa, soprattutto in popolazione geriatrica [2]. Il segno distintivo di parodontite è la perdita di connettività tra il dente, tessuti parodontali e l'osso alveolare. Distruzione del tessuto ed il riassorbimento di osso risultati nella formazione della tasca parodontale, uno spazio subgengivale allargata che è un habitat protettivo per microrganismi parodontali. Lo sviluppo della parodontite è un processo multifattoriale che ruota attorno complesse interazioni ospite-microrganismo [3]. P. gingivalis
è un anaerobio pigmentato nero gram-negativo che colonizza la fessura subgengivale, ed è stato identificato come uno dei principali agenti patogeni parodontali. Ha molteplici fattori di virulenza noti che contribuiscono alla sua sopravvivenza nell'ambiente orale, come fimbrie, gingipains, lipopolisaccaridi (LPS), capsula, e emoagglutinine [4].
Ampia evidenza indica che più componenti di P. gingivalis
può agire su osteoblasti di inibire la formazione di osso alveolare. P. gingivalis
LPS, lipidi, prodotti metabolici ed estratti sonicati grado di inibire la differenziazione e la osteogenesi degli osteoblasti [5-10], e modulare RANKL (recettore attivatore del nucleare ligando fattore-kB) e OPG di espressione /o (osteoprotegerina) in osteoblasti di stimolare indirettamente osteoclastogenesi [11-14]. Recentemente, il nostro laboratorio ha stabilito che P. gingivalis
possono invadere osteoblasti e inibire la loro maturazione e mineralizzazione in vitro [15], e fimbrie svolgere un ruolo importante nel mediare il processo invasivo iniziale [16].
Patogeni parodontali hanno dimostrato di intromissione superficie alveolare e occupare lacune vuoto in pazienti affetti da parodontite più gravi [17]. Non è chiaro se P. gingivalis
possono invadere osteoblasti in vivo, e se sì, come questo avrebbe influenzato omeostasi ossea a siti infetti. I topi non hanno P. gingivalis
come parte del loro microflora orale endogena [18]. Tuttavia, periodontite e la perdita di osso alveolare sono stati indotti con successo nei topi da inoculazione intraorale di vivere P. gingivalis
[19-21]. L'obiettivo di questo studio è quello di indagare l'invasione degli osteoblasti alveolari di P. gingivalis
, e come accoppiamento osteoblasti-osteoclasti è affetto da un'infezione batterica in un modello di topo sotto parodontite ripetitivi P. gingivalis
vaccinazioni. Si è constatato che P. gingivalis
è stato in grado di invadere le cellule parodontali e disturbare l'omeostasi degli osteoblasti e osteoclasti, che in ultima analisi contribuisce alla perdita di osso alveolare.
Metodi
Batteri e condizioni di coltura
P. gingivalis
ceppo ATCC 33277 è stato coltivato anaerobicamente a 37 ° C in una camera anaerobica Coy sotto atmosfera di azoto 86%: 10% di anidride carbonica: 4% di idrogeno. terreni di coltura era Trypticase Soy Broth (TSBY) integrato con il 5% di estratto di lievito, 2% di bicarbonato di sodio, 7,5 micron emina e 3 micron menadione. TSB piastre di agar sangue (BAP) sono stati effettuati con l'aggiunta di sangue 5% di pecora e 1,5% agar. I batteri sono stati inoculati da BAP in 5 ml di TSBY e coltivate in anaerobiosi per 18 a 24 ore a 37 ° C, poi diluite in TSBY e cresciuti a fase di log precoce. Le cellule batteriche sono state raccolte mediante centrifugazione a bassa velocità, lavate e risospese in tampone fosfato (PBS). La concentrazione di batteri è stata determinata con uno spettrofotometro ad una densità ottica a 600 nm (OD = 1 10 9P. Gingivalis
per ml). 10 9 CFU di tensione gingivalis P.
è stato raccolto e pellettato per centrifugazione a bassa velocità, quindi risospeso in 20 ml di PBS con il 2% di carbossimetilcellulosa. La sospensione batterica è stata applicata al margine gengivale di topo molari superiori come dettagliato di seguito.
Inoculazioni batteriche
un modello di topo parodontite è stato istituito con una leggera modifica del metodo descritto in precedenza [22]. In breve, 10-12 settimane di età topi femmina BALB /cByJ sono stati tenuti in ambiente privo di specifici patogeni. Hanno ricevuto kanamicina a 1 mg /ml in acqua deionizzata acqua ad libitum per 7 giorni. Tre giorni dopo il trattamento antibiotico, i topi sono stati messi sotto breve anestesia isoflurano, e 10 9 UFC di vivi gingivalis P.
in 20 ml di PBS con 2% di carbossimetilcellulosa è stato applicato al margine gengivale del topo molari superiori quattro volte, 2 giorni di distanza. I topi sono stati trattenuti dal cibo e l'assunzione di acqua per 1 ora dopo l'inoculazione. Abbiamo usato una concentrazione di inoculazione di 1 × 10 9 CFU, dal momento che il nostro studio preliminare ha dimostrato che questa concentrazione fosse sufficiente a indurre P. gingivalis
invasione del parodonto e la perdita di osso alveolare. Sham gruppo infetto ricevuto 20 ml di PBS con il solo 2% di carbossimetilcellulosa. Due settimane più tardi, altri quattro dosi (2 giorni di distanza) sono stati applicati ai topi. Quattro settimane dopo la seconda sfida orale, i topi sono stati sacrificati, e gli esemplari mascellari sono stati raccolti per gli studi Istomorfometria osso micro-CT e. Per P. gingivalis
studio invasione, immunoistochimica è stata eseguita su campioni mascella raccolto 3 giorni dopo tre volte di vaccinazioni batteriche. Dieci animali ciascuno sono stati inclusi per entrambi i gruppi infetti e sham per gli studi di cui sopra. Tutti gli esperimenti sugli animali legati sono stati approvati dal Centro per la Medicina di Laboratorio e cura degli animali presso l'Università del Texas Health Science Center a Houston (approvato protocollo animale HSC-AWC-10-145).
Immunoistochimica
Mice esemplari mascellari erano isolato, fissato in 10% formalina tamponata neutra, decalcificata nel 3,4% formiato di sodio /acido formico al 15% e inclusi in paraffina. Antigen recupero è stata effettuata utilizzando 4 N HCl per 10 min a 37 ° C. perossidasi endogena è stata bloccata incubando 10 minuti con il 3% H 2O 2. proteine non specifici sono saturati con blocco di proteine DAKO (Dako, Carpinteria, CA) per 30 minuti a temperatura ambiente (RT). Le sezioni sono state incubate a temperatura ambiente per 1 h con 1: 4000 di coniglio anti P. gingivalis
anticorpo policlonale. anticorpo secondario e il substrato colorazione sono stati eseguiti con kit DAKO LSAB + e DAB + liquido sistema substrato-cromogeno (Dako). I vetrini sono stati di contrasto con ematossilina. Il numero di osteoblasti con invasione batterica è stato contato manualmente. Per entrambi P. gingivalis
gruppi -infected e di controllo, 10 campioni sono stati analizzati. Il numero totale degli osteoblasti rivestimento superficie ossea alveolare sezione è stato contato. La formula per cacluate percentuale di marcatura positiva è stata: (numero di osteoblasti marrone-macchiato /numero totale degli osteoblasti contato) × 100
