Abstract
sfondo
infiammazione all'interno della cavità orale si verifica a causa di una disregolazione tra i biofilm microbici e la risposta dell'ospite. La comprensione di come diversi prodotti per l'igiene orale influenzano infiammatorie è importante per lo sviluppo di nuovi prodotti. Pertanto, la creazione di una piattaforma di biofilm ospite-patogeno robusta in grado di valutare i composti di assistenza sanitaria per via orale romanzo è un'opzione attraente. Abbiamo quindi elaborato un modello di biofilm co-coltura multi-specie per valutare il resveratrolo derivazione naturale polifenolo (RSV) e clorexidina gold standard (CHX) rispetto al anti-biofilm e anti-infiammatori proprietà.
Metodi
An in vitro
multi-specie di biofilm contenente S. mitis, F. nucleatum, P. gingivalis
e A. actinomycetemcomitans
è stato creato per rappresentare un biofilm associata a malattia e la cellula epiteliale orale in OKF6-TERT2. studi di citotossicità sono stati effettuati utilizzando RSV e CHX. biofilm multispecie sono stati trattati sia con molecola, o, in alternativa cells epiteliali sono stati trattati con questi prima di biofilm co-coltura. Composizione biofilm è stato valutato e quantificato le risposte infiammatorie a livello trascrizionale e proteine
. Risultati
CHX era tossico per le cellule epiteliali e biofilm multi-specie a concentrazioni comprese 0,01-0,2%. RSV non ha effetto multispecie composizione biofilm, ma era tossico alle cellule epiteliali a concentrazioni superiori a 0,01%. In co-coltura, biofilm CHX-trattati hanno portato nella regolazione verso il basso della chemochina infiammatoria IL-8, sia a livello di mRNA che di proteine. cells epiteliali RSV-trattati in co-coltura sono in calo-regolati nel rilascio di IL-8 proteine, ma non mRNA.
Conclusioni
CHX possiede potenti proprietà battericide, che possono avere un impatto mediatori infiammatori a valle. RSV non sembra avere proprietà battericida contro i biofilm multi-specie, tuttavia, sembra di sopprimere le cellule epiteliali di rilasciare mediatori infiammatori. Questo studio dimostra il potenziale per comprendere i meccanismi con cui diversi prodotti per l'igiene orale possono influenzare l'infiammazione gengivale, convalidando così l'uso di un modello di biofilm co-coltura.
Parole
cella parodontale malattia biofilm epiteliale elettronico materiale supplementare
la versione online di questo articolo (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-80) contiene materiale supplementare, che è disponibile per gli utenti autorizzati
Sfondo
la malattia parodontale si verifica da una disregolazione tra i batteri. biofilm al margine gengivale e la risposta immunitaria, con conseguente distruzione irreversibile dei due tessuti molli e duri sostengono i denti, portando in definitiva alla perdita dei denti. Nella salute, molecole immunitarie innate e adattative mediano l'equilibrio tra l'host e le prevalentemente Gram sospensioni batteriche eterogenei positivi nella saliva e le comunità biofilm aderenti su superfici dei tessuti molli e duri per tutta la cavità orale. Nella malattia parodontale lo spostamento del microbiota da Gram positivi per Gram specie negativi porta a una risposta dell'ospite deregolazione sia dai tessuti locali e cellule del sistema immunitario che induce l'infiammazione e crea una nicchia alla base per le specie anaerobiche per sopravvivere, esacerbando ulteriormente la malattia [1 ]
. Numerose specie procarioti sono state identificate all'interno della cavità orale esistente all'interno degli ecosistemi biofilm complessi sia come sovranazionali o placca sub-gengivale. Molti sono incolti e senza nome, ma tutti giocano importanti ruoli strutturali e funzionali [2]. Microarray e la generazione di sequenziamento prossima studi del microbiota orale ha permesso la classificazione di alcune specie di batteri in complessi a base di associazioni con la salute e la malattia [3, 4]. Questi hanno permesso di condurre studi sui specie, come la malattia associata al batterio Porphyromonas gingivalis
, e capire il loro ruolo nel contestare la risposta dell'ospite [5]. Tuttavia, biofilm orali sono complessi e all'interno di queste strutture biofilm polimicrobiche una miriade di interazioni intime verificano, rendendo difficile delineare i trigger precise per i risultati patogeni associati disregolazione immunitaria. Pertanto, la creazione di un modello semplificato con molti di questi agenti patogeni chiave è una proposta interessante per valutare le interazioni ospite-patogeno e principi attivi di prova per potenziale trattamento
Curare la malattia parodontale è difficile.; i dentisti eseguono debridement sui denti, la somministrazione di collutori antimicrobici per indirizzare biofilm e in parodontite avanzata, chirurgia. Tuttavia, i successi di trattamento sono variabili e su base individuale e suggerendo la composizione biofilm possono influenzare l'esito del trattamento [6]. collutori antimicrobici attualmente impiegati per gestire malattie orali includono una varietà di composti con clorexidina (CHX) essere considerato il 'gold standard' per la sua battericida e proprietà batteriostatiche [7]. Inoltre, polifenoli, trovato naturalmente nelle piante come uva sono diventati un punto di riferimento per terapie orali a causa delle loro proprietà anti-infiammatorie e anti-batteriche [8]. Resveratrolo (RSV) è un polifenolo derivazione naturale, che ha dimostrato di avere potenti proprietà anti-infiammatori in una varietà di cellule tumorali e recentemente parodontite in ratti [9, 10].
Sia CHX e RSV hanno proprietà desiderabili per periodontite prevenzione, essendo antimicrobica o anti-infiammatori e antimicrobico, rispettivamente. Lo scopo di questo studio era quindi di creare e validare un modello di biofilm multispecie per essere utilizzato in co-coltura con le cellule epiteliali ospitante per testare i principi attivi CHX e RSV per convalidare se il sistema modello può essere utilizzato come metodo sensibile di delineare le modalità di base di azione. Qui riportiamo che le cellule epiteliali orali producono una risposta pro-infiammatoria riproducibile al nostro biofilm multi-specie, sia a livello di geni e proteine. Inoltre il trattamento di entrambi i cellule epiteliali o biofilm multi-specie con principi attivi ha determinato una alterazione di infiammazione all'interno del modello di co-coltura.
Metodi
la crescita e la standardizzazione dei batteri
Porphyromonas gingivalis
ATCC 33277, Fusobacterium nucleatum
ATCC 10953, Aggregatibacter actinomycetemcomitans
ATCC 43718 e Streptococcus mitis
ATCC 12261 sono stati utilizzati nel corso di questi studi. P. gingivalis
ATCC 33277 e F. nucleatum
ATCC 10596 sono state coltivate a 37 ° C in brodo Schaedler anaerobio (Oxoid, Cambridge, UK) per 2 giorni e 1 giorno, rispettivamente, in una camera anaerobica (85% N
2, il 10% di CO 2 e il 5% H 2, [Don Whitley Scientific Limited, Shipley, Regno Unito]). A. actinomycetemcomitans
ATCC 43718 e Streptococcus mitis
ATCC 12261 sono state coltivate a 37 ° C in brodo di soia trittico (Sigma, Poole, UK) integrato con 0,8% w /v di glucosio (BDH, Poole, UK) e 0,6 % w /v di estratto di lievito (Oxoid, Cambridge, UK) per 1 giorni in 5% CO 2. I batteri sono stati lavati con PBS poi normalizzati ad un OD 550 di 0.2, tranne S. mitis
, che è stato standardizzato ad un OD 550 di 0,5, in un colorimetro per ottenere circa 1 × 10 < sup> 8 ufc /ml di ciascuna specie batterica sul loro giorno specificato di utilizzo. composti attivi
clorexidina (CHX [Sigma]) e resveratrolo (RSV [Sigma]) sono stati utilizzati in questo studio. soluzione CHX è stata preparata a 0,01, 0,05 e 0,2% v /v in cheratinociti siero media liberi (KSFM) e utilizzata per le prove successive antimicrobica. Polvere RSV è stato solubilizzato in DDH 2O prima della preparazione in KSFM a 0,01, 0,05 e 0,5% v /v e utilizzati per gli studi successivi di stimolazione delle cellule
. Lo sviluppo di multi-specie biofilm
batteri sono stati standardizzati (1 × 10 7 ufc /mL) in saliva artificiale (AS), che conteneva i seguenti componenti, come precedentemente descritto [11]. Questo comprendeva mucine porcine stomaco (0.25% w /v), sodio cloruro (0,35 w /v), cloruro di potassio (0,02 w /v), cloruro di calcio diidrato (0,02 w /v), estratto di lievito (0,2 w /v), polvere di laboratorio LEMCO (0,1 w /v), peptone proteoso (0,5 w /v) in DDH 2O (Sigma, Poole, UK). Urea è stato poi aggiunto in modo indipendente ad una concentrazione finale di 0,05% (v /v). Per avviare lo sviluppo del biofilm multispecie specie pioniere S. mitis
biofilm sono stati formati per 24 h in 5% di CO 2 su 13 vetrini mm di diametro Thermanox ™ entro 24 pozzetti (Corning, NY, USA). Il surnatante è stato quindi rimosso e F. nucleatum
aggiunto, che è stato incubato anaerobicamente a 37 ° C per altre 24 h. Il surnatante è stato rimosso e P. gingivalis
e A. actinomycetemcomitans
aggiunto alla duplice biofilm specie, che è stato incubato anaerobicamente a 37 ° C per altre 4 giorni, sostituendo l'AS quotidianamente per produrre una quattro specie mista biofilm (Figura 1A). Figura 1 Sviluppo di multi-specie di modello di biofilm co-coltura. A. Multi-specie protocollo cultura biofilm. vetrini Thermanox ™ sono stati collocati in 24 pozzetti per la cultura biofilm. I batteri sono state coltivate su opportune piastre di agar e coltivate in brodo per 1-2 giorni. Le colture sono state poi lavate tre volte in PBS e normalizzato alle 1 × 109 CFU /ml, inserito in saliva artificiale per fare un /volume finale ml 1 × 108 CFU e aggiunto al biofilm nei giorni appropriate e coltivate in condizioni aerobiche e anaerobiche. Dopo 7 giorni la cultura saliva artificiale viene rimosso dal biofilm maturi che vengono poi lavate con PBS e conservati a -80 ° C. B. Hanging modello di co-coltura cesto. biofilm multi-specie sono state coltivate su vetrini Thermanox ™ e precedentemente descritti. Le cellule epiteliali (OKF6-TERT2) sono state seminate in 24 pozzetti a 1 × 105 cellule /ml in mezzi di coltura cellulare. I biofilm sono stati attaccati inversamente agli inserti colture cellulari Millipore che utilizzano vaselina e disposti sopra pozzetti contenenti cellule. Cellule e biofilm sono stati co-coltura per 4 e 24 ore.
L'analisi quantitativa dei biofilm composizione Real-time PCR quantitativa (qPCR) è stata poi eseguita per enumerare la composizione definitiva e relativa dei biofilm. Brevemente, biofilm batterici sono stati rimossi mediante sonicazione in un bagno sonico a 35 kHz per 10 minuti, come precedentemente descritto [12]. Per qPCR il ultrasuoni biofilm è stato utilizzato per l'estrazione del DNA utilizzando il Gram positivi DNA Purificiation Kit MasterPure (Epicentre®, Cambridge, UK), le istruzioni del fabbricante, con la modifica che il ultrasuoni è stato incubato per 4 ore per garantire la lisi cellulare. Il DNA estratto sottoposto a controlli di qualità utilizzando lo spettrofotometro NanoDrop (Fischer Scientific, Loughborough). In breve, 1 ml di DNA estratto è stato aggiunto a un Mastermix contenente 12,5 ml SYBR® Greener ™, 9,5 ml UV-trattati RNase-free acqua e 1 ml di 10 micron primer avanti /indietro per ciascuna specie batteriche. I primer utilizzati sono stati pubblicati in precedenza, come elencate nella Tabella 1. Tre repliche indipendenti di ciascun parametro sono stati analizzati in triplicato utilizzando la macchina MxProP PCR quantitativa e software MxProP 3000 (Stratagene, Amsterdam, Paesi Bassi). I campioni sono stati quantificati per calcolare l'equivalente formanti colonie (CFE) sulla base di una curva standard precedentemente stabilito di unità formanti colonie batteriche che va da 1 × 10 3 a 10 8 ufc /ml. I 2 valori di R per queste curve standard variavano 0,956-0,994. Melting analisi della curva è stata eseguita per tutti Primer imposta per garantire un singolo picco, che era indicativa di primer specificità. architettura Biofilm stata successivamente analizzata mediante microscopia elettronica a scansione (SEM). Per questo provini biofilm sono state lavate in PBS, fissate in 2% para-formaldeide, 2% glutaraldeide, 0,15% w /v Alcian Blu di 0,15 M cacodilato di sodio (pH 7,4) [13]. I campioni fissi e essiccati sono stati sputtering rivestite d'oro e viste al microscopio elettronico a scansione JEOL JSM-6400 [14] .table 1 primer utilizzati per qPCR in questo studio
Gene
Forward 5'-3 '
Reverse 5'-3'
Riferimento
citochine
IL-8
CAGAGACAGCAGAGCACACAA
TTAGCACTCCTTGGCAAAAC
[15]
GAPDH
CAAGGCTGAGAACGGGAAG
GGTGGTGAAGACGCCAGT
[15]
specie batteriche
S. mitis
GATACATAGCCGACCTGAG
CCATTGCCGAAGATTCC
[16]
F. nucleatum
GGATTTATTGGGCGTAAAGC
GGCATTCCTACAAATATCTACGAA
[17]
P. gingivalis
GCGCTCAACGTTCAGCC
CACGAATTCGCCTGC
[18]
A. actinomycetemcomitans
GAACCTTACCTACTCTTGACATCCGAA
TGCAGCACCTGTCTCAAAGC
[19]
sviluppo di un modello di co-coltura epiteliali biofilm cellule
OKF6-TERT2 (gentile dono del laboratorio Rheinwald, Brigham e Hospital di donna , Boston) sono una linea immortalato umano orale delle cellule cheratinociti [20] è stato utilizzato nel corso di questi accertamenti. cells OKF6 sono state coltivate in cheratinociti terreno privo di siero (KSFM) come descritto in precedenza [21]. Al 90% di confluenza were trypsinised le cellule, lavate in soluzione salina bilanciata Hanks poi ri-testa di serie a circa 1 × 10 5 cellule /ml e seminate su un vetrino Thermanox ™ all'interno di una piastra di coltura cellulare 24 bene (Corning, NY, STATI UNITI D'AMERICA). Le cellule epiteliali sono state lavate e poi oggetto di discussione con il biofilm invertiti, collegati mediante vaselina per appesi inserti colture cellulari (Millipore, MA, USA) come illustrato in figura 1B. I biofilm sui dischi Thermanox ™ sono stati separati dalle cellule epiteliali sul fondo del pozzo da un piccolo spazio di & lt; 0,5 mm rappresentativo di un gengivale. Multispecie biofilm sono state incubate nel modello di co-coltura per 4 e 24 ore e la vitalità delle cellule epiteliali ± trattamenti attivi (CHX e RSV) valutati utilizzando un test metabolico del 10% v /v alamarBlue®, secondo le istruzioni del produttore ( life Technologies, Paisley, UK). Dopo 4 ore di incubazione l'assorbanza è stata letta a 570 nm e la lunghezza d'onda di riferimento a 600 nm, e la percentuale di riduzione del biofilm vitalità calcolato con la formula del produttore.
Valutare alterazioni infiammatorie durante biofilm co-coltura
surnatanti e lisati cellulari sono stati raccolti da OKF6 /TERT2 cellule stimolate con diversi biofilm multispecie, che sono stati utilizzati rispettivamente per proteine e analisi trascrizionale, per valutare la regolamentazione dei mediatori pro-infiammatori. Iniziale analisi di espressione genica è stata effettuata utilizzando un personalizzato progettato RT 2 Profiler PCR Array (Qiagen, Crawley, Regno Unito). RT 2 array Profiler sono in tempo reale basato SYBR® Greener ™ PCR che consentono l'individuazione di diversi geni di interesse, allo stesso tempo. In breve, l'RNA è stato estratto da lisati cellulari (Qiagen, Crawley, Regno Unito) e 55 ng /ml di cDNA sintetizzato utilizzando la RT 2 First Strand cDNA kit di sintesi (Qiagen, Crawley, Regno Unito), come da istruzioni del produttore. In breve, 24 pl di una Mastermix contenente SYBR® Greener ™, cDNA sintetizzato utilizzando la RT 2 First Strand Kit (Qiagen) e acqua RNase-free è stato aggiunto a ciascun pozzetto del 2 piastra Profiler RT, che già conteneva i primer avanti e retromarcia per i geni di interesse (iL-1α, iL-1b, iL-6, TNF, QCS2, CSF3, iL-8, CXCL1, CXCL3, CXCL5, CCL1 e GAPDH), sulla base di una gengivite sperimentale modello [22]. Due repliche di ogni condizione sono stati utilizzati in RT 2 Profiler, che è stata effettuata in due diverse occasioni.
Maggiori verifica è stata effettuata utilizzando IL-8 espressione genica analizzati utilizzando basato SYBR® verde qPCR (Invitrogen), utilizzando GAPDH come gene housekeeping. sequenze primer e fonti di riferimento sono elencate nella tabella 1. Tutti i primer sono stati testati contro ogni specie batteriche per garantire la specificità, che è stato il caso (dati non riportati). RNA è stato sintetizzato in cDNA poi aggiunto ad una Mastermix contenente 12,5 ml SYBR® verde ™, acqua RNase-free 10.5 ml UV-trattati e 0,5 ml di primer avanti /indietro. Tre repliche indipendenti di ciascun parametro sono stati analizzati in duplicato utilizzando macchina MxProP PCR quantitativa e software MxProP 3000 (Stratagene, Amsterdam, Paesi Bassi) e l'espressione genica normalizzato per la GAPDH gene housekeeping secondo il -ΔΔCT
metodo 2 [23 ]. IL-8 immissione in sovranatanti di coltura cellulare è stata valutata mediante test ELISA (Invitrogen, Paisley, UK), secondo le istruzioni del produttore. I risultati sono stati calcolati utilizzando un 4 parametri della curva in forma, quantificare i cambiamenti colometric a 630 nm (BMG-Labtech, Ortenberg, Germania).
Analisi statistica
produzione Grafico, la distribuzione dei dati e l'analisi statistica sono state eseguite utilizzando GraphPad Prism (versione 4, La Jolla, CA, USA). Dopo aver valutato se i dati conformi ad una distribuzione normale prima e dopo la trasforma i dati, a senso unico l'analisi della varianza (ANOVA) e test t
sono stati utilizzati per studiare le differenze significative tra i gruppi indipendenti di dati che approssimata a una distribuzione gaussiana. Una correzione Bonferroni è stata applicata al valore p per tenere conto di confronti multipli dei dati. I dati non parametrici è stato analizzato utilizzando il test U di Mann-Whitney per valutare le differenze tra i due gruppi di campioni indipendenti. Student t-test sono stati usati per misurare le differenze statistiche tra i valori Δ
Ct dei due gruppi indipendenti valutati in studi di espressione genica, anche se i dati possono essere rappresentati come percentuale o piegare cambiamento nelle figure. La significatività statistica è stata ottenuta se P & lt; 0.05
. Risultati
Analisi quantitativa di un modello di biofilm parodontale multi-specie
sonicato biofilm multi-specie sono stati quantificati dalla qPCR (Figura 2A). E 'stato dimostrato che quantitativamente che S. mitis
era la specie più dominante all'interno del biofilm maturi (1.36 × 10 7 CFE /mL; 83.24%), seguita da
F. nucleatum
(2.28 × 10 6; 15,16%), P. gingivalis
(3,53 × 10 4; 1,01%) e A. actinomycetemcomitans
(1.13 × 10 5; 0,58%). La composizione biofilm è stato poi esaminato utilizzando l'analisi SEM. Il biofilm ha dimostrato di essere un fitto complesso di diversi morfotipi dominate da F. nucleatum
(Figura 2B e C). Figura 2 Analisi dei biofilm multi-specie anaerobica e condizioni aerobiche. Multi-specie biofilm sono state coltivate su vetrini Thermanox ™ a 24 pozzetti per 6 giorni come precedentemente descritto. Dopo la maturazione DNA è stato estratto usando il DNA kit di purificazione Masterpure ™ Gram-positivi per la quantificazione di ogni specie che utilizzano SYBR® verde ™ basato qPCR (A). Biofilm morfologia stato analizzato mediante SEM a 2000x (B) e 5000X (C). I campioni sono stati elaborati e visualizzati su un microscopio elettronico a scansione JEOL JSM-6400 e immagini assemblati utilizzando il software Photoshop. I biofilm possono essere visti come complesso (B). Ad ingrandimenti maggiori differenti morfologie possono essere identificati con S. mitis Comprare e F. nucleatum
che costituiscono la maggioranza del biofilm (C). biofilm maturi sono stati anche coltivati in terreni di coltura cellulare in 5% di CO2 per 4 e 24 ore prima estrazione del DNA e la quantificazione di ogni specie che utilizzano usando SYBR® verdi ™ basato qPCR (D). Tutti i campioni sono stati analizzati in triplicato in tre diverse occasioni. I dati sono media ± SD.
Al fine di testare i biofilm multi-specie in co-coltura con cellule epiteliali, abbiamo esaminato l'impatto di spostare il biofilm da condizioni anaerobiche all'interno di AS al 5% di CO 2 in KSFM. Per fare questo abbiamo valutato la composizione biofilm come descritto sopra. Non sono state osservate differenze significative nella composizione e la quantità delle 4 specie all'interno della CO 2 biofilm a 4 e 24 h (Figura 2D). Non c'era alcuna differenza significativa tra le 24 h biofilm formatisi in condizioni anaerobiche e quelli poi messo in CO 2 per un ulteriore 24 h. Questi biofilm sono stati poi utilizzati in un sistema di co-coltura per indagare le proprietà biologiche di due diversi agenti bioattivi.
Studio degli effetti di agenti bioattivi in un multi-specie di biofilm cellule epiteliali modello di co-coltura
In primo luogo, per ottimizzare le concentrazioni di RSV e CHX da testare in questo modello abbiamo intrapreso test citotossicità su entrambe le cellule epiteliali e sulle cellule epiteliali biofilms.Oral stati trattati per 30 minuti con tre concentrazione del CHX attiva antimicrobico (0,01, 0,05, 0,2% v /v ) e anti-infiammatori RSV attiva (0,01, 0,05, 0,5% w /v) prima del lavaggio con PBS e incubate per 4 e 24 ore prima vitalità cellulare è stata misurata valutata usando un saggio AlamarBlue®. I dati hanno mostrato una diminuzione significativa (p & lt; 0,001) in vitalità cellulare rispetto ai controlli non trattati multimediali quando le cellule epiteliali vengono incubate con CHX in qualsiasi concentrazione sia per 4 e 24 ore (Figura 3A). Quando le cellule epiteliali sono stati co-coltura con RSV significative diminuzioni vitalità cellulare rispetto al controllo dei media sono stati osservati con 0,05 e 0,5% w /concentrazioni v RSV, sia a 4 (p & lt; 0,001) e 24 ore (p & lt; 0,01), con una diminuzione di circa il 50% della vitalità cellulare in ogni momento (Figura 3B) .Next, da questi dati le concentrazioni portate avanti per il resto dello studio erano 0,2% v /v CHX e 0,01% w /v RSV. biofilm multi-specie sono state trattate con le concentrazioni scelte di principi attivi per 30 minuti e biofilm vitalità misurati utilizzando un test AlamarBlue® (Figura 3C). Trattamento del biofilm multispecie con RSV non influisce significativamente redditività biofilm rispetto al controllo non trattato biofilm. Tuttavia, il trattamento con CHX ha mostrato una riduzione significativa (p & lt; 0,001) del 75% nei batteri vitalità rispetto al greggia biofilm.To determinare se il trattamento con questi principi attivi alterato la composizione specifica del biofilm, che sono stati trattati per 30 min quindi DNA estratto e la quantificazione di ogni specie eseguite da qPCR (Figura 3D). I dati mostrano alcun cambiamento significativo nella composizione dopo un trattamento di 30 minuti con CHX o RSV rispetto al biofilm non trattato. Per investigare ulteriormente questo effetto analisi SEM è stata eseguita per esaminare l'impatto di ogni attivo sull'architettura dei biofilm post-trattamento (Figura 3E-J). CHX sembrava destabilizzare il biofilm, come la complessità del biofilm è stato ridotto, mentre RSV sembrava avere alcun effetto visivo sull'architettura. Figura 3 Effetto diretto di attivi sulle cellule epiteliali orali e biofilm multi-specie. La linea di cellule epiteliali orali OKF6-TERT2 è stato seminato a 1 × 105 cellule /ml a 24 pozzetti per gli studi di tossicità. Le cellule sono state trattate con concentrazioni di CHX (0,01, 0,05, 0,2% v /v) (A) e RSV (0.01, 0.05, 0.5% w /v) (B) per 30 minuti prima del lavaggio con PBS. La vitalità cellulare è stata valutata utilizzando il test Alamarblue® con assorbanza leggere a 570 nm e 600 nm. Seguendo questa concentrazioni scelte per il resto dello studio sono stati CHX 0,2% (v /v) e RSV 0,01% (w /v). Per studiare il ruolo di attivi in biofilm trattamento biofilm sono state coltivate su vetrini a 24 pozzetti per 6 giorni come descritto in precedenza. biofilm maturi sono stati trattati con 0,2% v /v CHX e 0,01% w /v RSV per 30 minuti prima del lavaggio con PBS. Biofilm vitalità è stata misurata usando Alamarblue® letta a 570 nm e 600 nm (C). Batterica DNA è stato estratto e ogni specie quantificato utilizzando basato SYBR® verdi ™ qPCR (D). I biofilm sono stati analizzati anche da SEM, sia a 2000x (E, G, I) e 5000 × (F, H, J). I campioni sono stati elaborati e visualizzati su un microscopio elettronico a scansione JEOL JSM-6400 e immagini assemblati utilizzando il software Photoshop. biofilm non trattati (E, F) sono stati confrontati con biofilm trattati con 0,2% (v /v) CHX (G, H) ee 0,01% (w /v) RSV (I, J). I campioni sono stati analizzati in triplicato in tre occasioni e dati separati sono media ± DS (** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001).
Successiva, abbiamo valutato gli effetti del trattato biofilm multispecie stimolata OKF6 cellule per garantire il biofilm indotta mediatori infiammatori. Utilizzando la RT 2 Profiler abbiamo confrontato le cellule biofilm stimolate a cellule di controllo dei media dopo 4 ore per determinare le caratteristiche infiammatorie del modello (Tabella 2). Aumenti significativi sono stati osservati per tutti i geni su RT 2 profiler selezionate in base alla espressione durante gengivite sperimentale indotta in soggetti umani, che vanno da 4,39 fold change (CCL1) a 249,8 fold change (IL-8), con una media piegare cambio di 60 rispetto al controllo dei media non stimolato. Questi dati sono stati verificati attraverso lo studio di IL-8 utilizzando primer specifici all'interno di una transcriptasi inversa saggio (RT) qPCR (Figura 4B). Un significativo aumento è stato osservato un cambiamento di 15.57 volte (p & lt; 0,001), dopo 4 ore e 312,88 fold change (p & lt; 0,001) dopo 24 ore rispetto al controllo dei media (Tabella 2). Infine, abbiamo valutato i supernatanti cellulari per il rilascio di IL-8 all'interno di questo sistema, in cui è stato dimostrato che dopo 4 h (535 ng) e 24 h (450 ng) che IL-8 rilascio era significativamente aumentato (p & lt; 0,001 ) rispetto ai controlli non trattati multimediali (Figura 4C). Sulla base di questi dati collettivi, abbiamo dimostrato che il biofilm a 4 specie ha proprietà infiammatorie riproducibili all'interno di un epiteliale co-coltura model.Table 2 risposta pro-infiammatoria a biofilm non trattati
Gene
Aumento medio volte
SD (±)
significato
IL-1
10.820
8,918
p & lt ; 0.05
IL-1B
12,662
1.161
p & lt; 0.05
IL-6
31,876
2.366
p & lt; 0.001
TNF
48,821
24,623
p & lt; 0.001
CSF-2
59,200
28,294
p & lt; 0.001
CSF-3
43.331
37.126
P & lt; 0.001
IL-8
249,805
189,93
p & lt; 0.001
CXCL1
121,892
56,676
p & lt; 0.001
CXCL3
63,843
26,213
p & lt; 0.001
CXCL5
14.435
14.474
n/s
CCL1
4.397
4.629
n/s
Figura 4 CHX e RSV immunomodulate risposte delle cellule epiteliali a multi-specie biofilm co-coltura in vitro. La linea di cellule epiteliali orali OKF6-TERT2 è stato seminato a 1 × 105 cellule /ml a 24 pozzetti per co-coltura con biofilm multi-specie. Biofilm sono stati pre trattati con 0,2% (v /v) CHX o cellule sono state trattate con 0,01% (w /v) RSV per 30 minuti prima del lavaggio con PBS e poi co-coltura con biofilm o cellule non trattate rispettivamente 4 e 24 ore. sono stati inclusi anche il controllo non trattato co-coltura. RNA è stato estratto dai lisati cellulari a 4 h, cDNA è stato sintetizzato e l'espressione genica pro-infiammatoria quantificata su una piastra profiler RT2 (A). campioni in doppio da tre esperimenti indipendenti sono stati utilizzati ed i dati sono media ± DS rispetto al controllo dei media. I campioni sono stati analizzati anche per IL-8 rispetto alle pulizie gene GAPDH a 4 e 24 ore utilizzando utilizzando SYBR® verdi ™ basato qPCR (B). I surnatanti sono stati anche analizzati per esogena IL-8, misurata mediante ELISA (C). I campioni sono stati analizzati in triplicato da tre esperimenti indipendenti, i dati sono SD media ± (** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001).
Abbiamo quindi determinato come il trattamento CHX del biofilm colpiti infiammazione. Il modello di co-coltura è stato utilizzato con biofilm trattati con 0,2% CHX per 30 min. A seguito di lisati e surnatanti di cellule epiteliali co-coltura sono stati rimossi per essere testato per una maggiore geni e proteine marker infiammatori. Un biofilm greggia e le cellule epiteliali non co-coltura con il biofilm multispecie stati usati come controlli. Dopo 4 ore di co-stimolazione con i biofilm CHX trattati abbiamo mostrato alcuna differenza significativa nella espressione genica utilizzando la RT 2 Profiler, anche se l'IL-8 e CXCL1 sono stati chiaramente diminuita (Figura 4A). Ulteriori analisi di IL-8 utilizzando qPCR ha mostrato ancora una volta alcuna differenza significativa nella espressione a 4 ore, mentre a 24 ore una significativa diminuzione di 5,65 volte è stato osservato nel CHX trattata cellule biofilm stimolate (p & gt; 0.001) (Figura 4B). espressione della proteina IL-8 è stata anche misurata a 4 e 24 ore di ELISA. Una riduzione significativa (p & lt; 0,001). È stata osservata di IL-8 proteine a 4 ore (10 volte) e a 24 ore (13 volte) rispetto al controllo non trattato (Figura 4C)
Infine, abbiamo valutato la effetto della RSV trattato cellule epiteliali nel modello di co-coltura. cells epiteliali sono state trattate per 30 minuti con RSV, lavate e co-incubate con biofilm non trattati per 4 e 24 ore. Il profiler RT 2 non ha mostrato differenze significative nell'espressione genica dopo 4 ore rispetto a biofilm non trattati (Figura 4A). Ulteriori analisi di IL-8 a 4 e 24 ore anche non ha mostrato differenze significative nei livelli di espressione (Figura 4B). Tuttavia, una significativa riduzione di IL-8 livelli di proteina a 4 ore (25 volte; p & lt; 0,001) e 24 ore (13 volte; p & lt; 0,01) sono stati osservati in confronto al modello non trattati biofilm co-coltura (Figura 4C )
. Discussione
Utilizzando sperimentale in vitro
modelli biofilm per studiare le interazioni tra biofilm e ospitare cellule epiteliali è essenziale per comprendere i meccanismi della patologia malattia e come principi attivi in grado di influenzare la risposta dell'ospite. Usando questo modello su misura biofilm multispecie abbiamo dimostrato che la risposta infiammatoria epiteliale di biofilm multi-specie può essere modificata in presenza di composti antimicrobici e anti-infiammatori.
I dati mostrano co-coltura di cellule epiteliali e non trattata a più -species biofilm producono un aumento significativo sia genica e proteica a 4 e 24 ore. i livelli di IL-8 proteina è risultata significativamente aumentata in entrambe le 4 e le 24 ore in co-coltura di cellule epiteliali e non trattate biofilm multi-specie rispetto alle cellule di controllo solo. Inoltre, aumenti di espressione genica di una varietà di chemochine pro-infiammatorie e citochine compresi IL-6, IL-8, TNF, CSF-2, CXCL1 e CXCL3 a 4 h rispetto le cellule sono stati osservati solo controllo. Questi cambiamenti dinamici mediatori proinfiammatori dimostrano che c'è interazione tra il complesso biofilm e le cellule epiteliali.
