Abstract
sfondo
Debridement e disinfezione del sistema dei canali radicolari è un passo fondamentale nelle procedure di endodonzia. L'efficacia di irrigazione si affida sia l'azione di lavaggio meccanica e la capacità di irriganti di sciogliere tessuti e uccidere i batteri. L'obiettivo di questo studio è quello di valutare e confrontare la citotossicità di QMix ™ canalare soluzione irrigazione sulle cellule staminali del midollo mesenchimali osseo umano immortalato (hTERT-MSC-C1) e di confrontarlo con quello di ipoclorito di sodio (NaOCl).
Metodi
immortalato (hTERT-MSC) sono stati esposti a QMix ™ e ipoclorito di sodio. La vitalità cellulare è stata valutata mediante 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-il) -2,5-bromuro diphenyltetrazolium (MTT) e alamarBlue saggi. La morfologia delle cellule è stato studiato dopo due ore di esposizione a QMix ™ e ipoclorito di sodio. microscopia elettronica a scansione (SEM) analisi sono state effettuate dopo periodi di incubazione a 2 e 4 ore. Infine, etidio bromuro /arancio di acridina (EB /AO) colorazione fluorescente è stato applicato alle celle nelle diapositive 8-camera dopo essere stati incubati con gli agenti di test per 2 ore per rilevare le cellule vive e morte. Le osservazioni sono state tabulati ed analizzati statisticamente.
Risultati
QMix ™ esposizione ha comportato una percentuale significativamente più alta di vitalità cellulare che NaOCl nel MTT e alamarBlue saggi a tre punti di tempo rispetto al controllo. L'analisi SEM mostrato alterazioni morfologiche minime associati alle celle che sono stati esposti alla soluzione QMix ™, con poco restringimento e frammentazione della parete cellulare. L'analisi Live /Dead mostrato che il numero di cellule vive dopo esposizione ai QMix ™ era simile a quella del controllo non trattato. Nessuna struttura delle cellule potrebbe essere osservata con il gruppo NaOCl, indicando la lisi cellulare.
Conclusione
soluzioni Sia il QMix ™ e NaOCl tossiche per MSC midollo osseo umano. Ogni soluzione potrebbe aver indotto la morte cellulare in modo diverso, come evidenziato nella vitalità cellulare, SEM e studi fluorescenti. La morte cellulare indotta da più lento QMix ™ potrebbe quindi essere meno aggressivo e più accettabile per i tessuti viventi.
Parole
citotossicità di ipoclorito di sodio cellule staminali mesenchimali QMix ™ Root irriganti canale materiale supplementare elettronica
La versione online di questo articolo (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-27) contiene materiale supplementare, che è disponibile per gli utenti autorizzati
Sfondo
il successo della terapia endodontica dipende l'eliminazione di microbi dal canale radicolare. sistema e la conseguente prevenzione della reinfezione. irrigazione canalare ha un ruolo chiave nel successo del trattamento endodontico. Durante e dopo la strumentazione, irriganti facilitare la rimozione dei microrganismi, residui di tessuto, e chip dentina del canale radicolare attraverso un meccanismo di risciacquo [1, 2].
Una radice soluzione ideale irrigante canale dovrebbe essere tossico, con un ampio spettro antimicrobico e la capacità di sciogliere tessuto pulpare necrotico, endotossine inattivanti, e sia prevenire la formazione di uno smear layer o dissolverlo [3, 4]. Attualmente, esiste un'unica soluzione è in grado di raggiungere questi obiettivi, e l'uso combinato, concomitante o sequenziale di due o più soluzioni irrigazione è quindi necessario [5]. L'ipoclorito di sodio (NaOCl) e clorexidina digluconato (CHX) sono due agenti antibatterici comuni usati come irriganti canalari [5-7].
Attualmente, ipoclorito di sodio (NaOCl) (0,5-6,15%) e EDTA (15-17% ) sono i due irriganti intracanalari più comunemente utilizzati [5, 8]. Anche se ipoclorito di sodio ha la maggior parte delle proprietà desiderabili, ma anche in grado di produrre la citotossicità e reazioni infiammatorie gravi [9, 10]. acido etilendiamminotetracetico (EDTA) è efficace per rimuovere il componente inorganica dello smear layer [11].
Tuttavia, a causa risultati indesiderabili, una combinazione di questi irriganti non è consigliabile [12-15]. Quindi, l'uso sequenziale di EDTA, CHX e ipoclorito di sodio è stato sostenuto da molti ricercatori per produrre risultati ottimali di irrigazione canalare [16-18]. E 'indispensabile che i irriganti canalari non devono ostacolare il processo di guarigione della regione apicale. La biocompatibilità di questi materiali è importante, in quanto vengono a contatto con i tessuti peri-radicolari.
QMix ™ è una soluzione 2-in-1 contenente un agente antimicrobico bisbiguanide (2% CHX) e un acido polyaminocarboxylic calcio-chelante agente (17% EDTA) [19]. QMix ™ è stato trovato per essere efficace nel rimuovere lo smear layer e ha anche notevoli proprietà antimicrobiche [19-22]. Tuttavia, i dati relativi alla citotossicità di questo agente non sono disponibili. Quindi, il presente studio è stato condotto per valutare e confrontare la citotossicità della soluzione irrigazione QMix ™ sulle cellule immortalizzate osseo umano staminali del midollo mesenchimali (MSC-hTERT-C1) con saggi di vitalità cellulare, la valutazione morfologia cellulare e microscopia a fluorescenza; 5,2% NaOCl è stato utilizzato per il confronto.
Metodi
Lo studio è stato approvato dal comitato di revisione del Dipartimento di College of Research Centre Odontoiatria, King Saud University, Riyadh.
Soluzioni di prova
QMix ™ 2-in -1 (Dentsply Tulsa Dental, OK, USA) e il 5,25% NaOCl (Clorox Co, Oakland, CA, USA) sono stati utilizzati in questo studio.
cellulare cultura
cellule staminali del midollo osseo umano mesenchimali immortalizzate (hTERT- MSC-C1), al 25
th passaggio, sono stati utilizzati per tutti gli esperimenti in questo studio. Il protocollo di Simbula et al. [23] è stato utilizzato in questo studio, con alcune modifiche. Le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo umano sono stati forniti dal Professor Moustapha Kassem presso l'Ospedale Odense University, Danimarca [24]. Le cellule crioconservati stavano rapidamente scongelati, trasferito in un T-75 pallone (BD Falcon ™, NJ, USA) e coltivate in modificata mezzo di Eagle Dulbecco (Gibco®), che è stato integrato con glutamina (Gibco®), 1% di penicillina-streptomicina (Gibco®), 10% di siero fetale bovino (FBS Gibco®), e aminoacidi non essenziali 1% (HyClone®), in atmosfera umidificata al 5% CO 2/95% O 2 37 ° C. Al 70% di confluenza, il mezzo è stato aspirato, e le cellule sono state lavate con soluzione salina tamponata con fosfato. Tre ml di pre-riscaldato 0,05% tripsina /EDTA (Gibco®) è stata aggiunta al pallone, e le cellule sono state incubate per 1 minuto. Dopo lievi colpetti, distacco cellulare è stato controllato sotto un microscopio ottico invertito (Observer A1, Zeiss®, Gottinga), e 12 ml di mezzo di coltura è stata quindi aggiunta al pallone per neutralizzare l'effetto enzimatica di tripsina. Per il conteggio delle cellule, due campioni (10 ml) sono stati prelevati dalla sospensione cellulare dopo opportuna miscelazione. I campioni sono stati collocati nelle camere superiore ed inferiore di una camera di conteggio emocitometro Neubauer (Paul Marienfeld GmbH & amp; Co. KG, Lauda-Königshofen, Germania), e le cellule sono state contate manualmente sotto un microscopio invertito (ingrandimento 10X). Le cellule sono state seminate su piastre diverse e scivoli, come discusso di seguito, per ciascuna parte dello studio. Tutte le procedure sono state eseguite in una classe II laminare cappa a flusso (LabGard ES 425 Cappa di sicurezza biologica, NuAire®)
. Saggio di vitalità cellulare MTT
Le cellule sono state seminate in piastre a 96 pozzetti (chiaro, fondo piatto, polistirolo TC Treated 96 pozzetti) ad una concentrazione di 1 × 10 4 cellule /pozzetto e sono state poi incubate per 24 ore per permettere l'adesione delle cellule al fondo dei pozzetti. terreni di coltura sono stati poi aspirati da ogni pozzetto e sostituiti con 150 ml di soluzione sterile (QMix ™ o NaOCl). Otto pozzi sono stati utilizzati come repliche per ogni gruppo
Ogni sottogruppo è stata incubata per i seguenti periodi:. 2, 4, o 24 ore. Poi, 10 ml di reagente MTT (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA) è stato aggiunto a ciascun pozzetto. Successivamente, piastre a 96 pozzetti sono stati ulteriormente incubati per 3 ore a 37 ° C. Infine, la soluzione da ogni pozzetto è stato aspirato, e 150 ml di agente di dissoluzione è stato aggiunto per sciogliere il precipitato formazan. L'assorbanza di ciascun campione è stata misurata con un lettore di micropiastre (Epoch Microplate Spectrophotometer, BioTek®) alla lunghezza d'onda di 570 nm. I dati sono stati raccolti utilizzando Gen5 Data Analysis Software (BioTek®, Stati Uniti d'America). L'esperimento è stato ripetuto due volte per ogni gruppo in ogni intervallo.
AlamarBlue (AB) vitalità cellulare saggio
Gli stessi gruppi che sono stati utilizzati per il test MTT (di cui sopra) sono stati utilizzati per il test AB con gli stessi intervalli. Gli agenti di test sono stati aggiunti a ciascun pozzetto. Dopo un periodo di incubazione a 2, 4, e 24 ore, il 10% di reagente AB (Serotec®, Oxford, UK) è stato aggiunto a ciascun pozzetto. Dopo che le piastre sono state ulteriormente incubate per 4 ore, la fluorescenza di ciascun pozzetto è stata misurata a lunghezze d'onda 530/25 e 590/35 nm di eccitazione /emissione utilizzando un lettore di fluorescenza (BioTek®). I dati sono stati raccolti utilizzando la Data Analysis Software Gen5 (BioTek®, Stati Uniti d'America). L'esperimento è stato ripetuto due volte per ciascun gruppo in ciascun intervallo.
Valutazione Morfologia cellulare
Morfologia cellulare è stata valutata con SEM dopo 2 e 4 ore di esposizione a soluzioni di prova. In breve, 8 × 10 4 cellule /pozzetto sono state seminate su vetrini copertura in vetro (1 × 1,5 cm) a 6-pozzetti (CellStar®, Carrollton, TX) durante la notte. Il giorno dopo, le cellule sono state esposte alle soluzioni di test. Due millilitri di ogni soluzione di irrigazione sterile è stato aggiunto alle diapositive in ogni pozzetto. cellule non trattate di controllo sono state mantenute in mezzo di coltura. Immediatamente dopo l'aggiunta delle soluzioni di prova, le cellule sono state esaminate sotto un LM invertita (10x). Al termine dei periodi di incubazione (2 e 4 ore) sono stati aspirati le soluzioni in ciascun pozzetto. I vetrini sono stati lavati con PBS e sono stati poi fissati con 2,5% glutaraldeide in 0,1 M Na tampone cacodilato (pH 7,2) a temperatura ambiente. Successivamente, i campioni sono stati lavati con tampone cacodilato 0.1 M di sodio (pH 7,2).
Dopo la fissazione, i campioni sono stati trattati con 1% tetrossido di osmio per 1 ora. Poi, sono stati lavati con acqua distillata e disidratati con alcool etilico graduata, in concentrazioni di 50%, 70%, 80%, 90% (5 minuti ciascuno), 95% (due volte, 15 minuti ciascuna), e, infine, 100% alcol assoluto (due volte, 30 minuti ciascuno). I campioni sono stati essiccati utilizzando un essiccatore punto critico con CO 2 (Sadri-PVT-3B). I vetrini sono stati montati su mozziconi di rame con doppio nastro adesivo e sono stati poi oro polverizzazione rivestito per uno spessore di 5-7 micron. I campioni sono stati poi osservati e fotografati con un microscopio a scansione elettronica LV JSM-6360.
Due valutatori valutato gli microfotografie. La morfologia cellulare è stata descritta secondo i seguenti criteri: la forma della cellula (normale o anormale rispetto al controllo), attaccamento al sottosuolo, attaccamento alle altre cellule, estensioni superficiali citoplasmatici (blebs o microvilli), e l'integrità della parete cellulare. Rotondità delle cellule, la presenza di blebs o distacco delle cellule indicata maggior danno cellulare [25, 26].
Analisi Live /dead
due soluzioni sono state selezionate per l'analisi diretta /morti. mezzo di una di Eagle modificato (MEM) senza rosso fenolo (Gibco®, Gaithersburg, MD) è stato utilizzato per questo esperimento. Brevemente, le cellule sono state seminate in tre slitte 8-camera (Lab-Tek®) ad una concentrazione di 1,5 × 10 4 cellule /pozzetto e sono state poi incubate per 24 ore per permettere l'adesione cellulare a verificarsi. Il mezzo di coltura in ciascun pozzetto è stato sostituito con 300 ml di ciascuna soluzione e poi incubata per 2 ore. Infine, 10 ml di colorante fluorescente EB /AO inserito in ciascuna camera, e la fluorescenza delle cellule è stato analizzato al microscopio a fluorescenza invertito (ECLIPSE Ti, Nikon, Tokyo, Giappone), con ingrandimento 10X. Le immagini sono state catturate con software di imaging (NIS-Elements, Nikon, Tokyo, Giappone). Il colorante fluorescente EB /AO è stato preparato miscelando 15 mg acridina arancio con 50 mg di bromuro di etidio in polvere che è stato sciolto in 1 ml di etanolo al 95% e poi diluito in 49 ml di acqua distillata (DH 2O).
Le immagini sono state valutate da due valutatori secondo criteri precedentemente descritti. Sotto il filtro verde, un nucleo verde intatto, che è paragonabile al controllo, indica una cellula vitale, considerando un nucleo frammentato verde indica apoptosi precoce. Un nucleo rosso indica una parete cellulare rotto, considerando un nucleo intatto rosso indica necrosi, e un nucleo rosso frammentato indica ritardo apoptosi sotto il filtro rosso [27, 28].
Dati ed analisi statistica
I risultati della MTT e dosaggi AlamarBlue stati calcolati come percentuali relative al controllo (100% = nessuna tossicità). I dati sono stati analizzati utilizzando SPSS Pc + 21,0 versione del software statistico. Statistiche descrittive (media e deviazione standard) sono stati usati per descrivere le variabili di risultato continue.
-test per campioni indipendenti t di Student è stato utilizzato per confrontare i valori medi dei due gruppi. Una analisi della varianza ad una via, seguito da un test di confronto multiplo di Tukey, è stato utilizzato per confrontare i valori medi dei tre gruppi. Un valore p & lt; = 0.05 è stato
considerato statisticamente significativo. Risultati
MTT test
Il saggio MTT è stato condotto su tre gruppi (il gruppo QMix ™, gruppo NaOCl, e gruppo di controllo) con colta hTERT-MSC in piastre da 96 pozzetti . Ogni gruppo è stato incubato per 2, 4 e 24 ore. La vitalità cellulare per ogni gruppo è presentato come percentuale del gruppo di controllo ad ogni tempo. La vitalità cellulare percentuale di ciascuna soluzione è illustrata nella figura 1. Quando le cellule sono state esposte a soluzioni per 2, 4 e 24 ore, la vitalità cellulare diminuisce con il tempo. La vitalità delle cellule esposte NaOCl era significativamente inferiore a quella delle cellule esposte a QMix ™ a tutti gli intervalli di tempo (P & lt; 0,05). Figura 1 La percentuale di vitalità cellulare per le soluzioni di NaOCl e QMix a 2, 4 e 24 ore dopo l'esposizione mediante saggio MTT.
AlamarBlue saggio
Il saggio AB è stato condotto per la QMix ™, NaOCl e Controllo gruppi utilizzando colta hTERT-MSC in piastre a 96 pozzetti. La vitalità cellulare per ogni gruppo viene presentata come la percentuale del gruppo di controllo. La percentuale vitalità cellulare di ciascuna soluzione è illustrata nella figura 2. Quando le cellule sono state incubate per 2 o 4 ore, la vitalità cellulare del gruppo NaOCl era significativamente inferiore a quella del gruppo QMix ™ (P & lt; 0,05). Figura 2 La vitalità delle cellule di soluzioni sia NaOCl e QMix ™ utilizzando test alamarBlue a 2, 4 e 24 ore di esposizione.
morfologia cellulare
cellule di controllo negativo non trattate hanno mostrato forme variabili, incluse romboidale, triangolare, forme ovali e mandrino, come illustrato dalla luce LM microscopio (Figura 3) cellule erano attaccati l'uno all'altro e al substrato. La parete cellulare è apparso liscio e intatto, con alcune estensioni microvilli e di superficie. Secondo l'indagine LM, l'effetto tossico delle soluzioni di prova era evidente immediatamente dopo la loro applicazione alle MSC midollo osseo umane coltivate, e la morfologia cellulare normale è stato modificato in modo diverso in ciascun gruppo (Figura 3). Un'elevata concentrazione (0,5 mg /ml) di NaOCl causato la vacuolizzazione del citoplasma (Figura 3B), considerando QMix ™ alla stessa concentrazione prodotta poche modifiche nella parete cellulare e nessun vacuolizzazione (Figura 3C). Figura 3 midollo osseo hTERT-MSC umane sotto LM invertita dopo aver aggiunto gli agenti di test (X10). A- Cellule non trattate, B - cellule esposte a (0,5) soluzione Qmix ™ (la forma delle cellule è stata mantenuta con alcune modifiche), Celle di C- esposti a (0,5) NaOCl; vacuolizzazione era evidente nel citoplasma.
Secondo l'analisi SEM, il numero di cellule è diminuito rispetto al controllo dopo un'esposizione 2 ore a 0,5 mg /ml NaOCl. Le cellule rimanenti erano più piccole, di forma filiforme o rotondo (figura 4). Le cellule vennero staccate dal sottosuolo, e gli allegati cellula-cellula sono stati persi. sono stati osservati secrezioni lisosomiali emergenti dalla cella, e il nucleo è stata estrusa attraverso la parete cellulare rotto. Figura 4 midollo osseo hTERT-MSC umani esposti per 2 ore a QMix e ipoclorito di sodio. A - QMix ™ (x100), B - QMix ™ (X1000), C - NaOCl (X100, di notare la forma rotonda o filiforme delle cellule residuo), D- NaOCl (X1000, la parete cellulare rotto e il nucleo estruso ).
dopo un'esposizione di 2 ore per QMix ™, il numero di cellule e la forma delle cellule erano simili a quelli del controllo, eccetto per la presenza di una struttura di cella mal definito. Tuttavia, le cellule sono state ancora attaccate alle celle adiacenti e al substrato (Figura 4). In alcuni settori, sono stati osservati residui di processi cellulari. Il principale cambiamento drammatico nella morfologia cellulare era nella parete cellulare, che aveva un aspetto maglia simile (Figura 4B), indicando disintegrazione. Dopo 4 ore, l'alterazione della morfologia cellulare era più significativo: l'aspetto maglia-come delle cellule divenne più intenso, con una forma non ben definito e un contorno fading, e sono stati osservati allegati rotti cellula-cellula. Tuttavia, l'allegato al substrato è stata mantenuta da alcune cellule (Figura 5). Figura 5 umane del midollo osseo hTERT-MSC esposti per 4 ore a QMix ™ e ipoclorito di sodio. A- QMix ™ (x100), B-QMix ™ (X1000), C - NaOCl (x100), D- NaOCl (x1000)
analisi Live /morto con EB /AO colorazione
Colta di midollo hTERT ossa umane. -MSCs sono stati esposti a 0,5 mg /ml di QMix ™ e NaOCl per 2 ore. La macchia EB /AO è stata applicata alle cellule, che sono stati poi esaminati al microscopio invertito a fluorescenza. Le immagini per ogni gruppo di visualizzazione cellule vive nelle cellule verdi e morti in rosso. Le cellule non trattate hanno intatte, nuclei ben definiti, che erano verde sotto il filtro verde, come mostrato nella Figura 6A. Sotto il filtro rosso, solo la superficie cellulare mostrato fluorescenza rossa, non il nucleo, che indicava una parete cellulare intatta (Figura 6B). Quando le cellule sono state esposte a QMix ™, il numero di cellule era simile a quella del gruppo di controllo, ed i nuclei erano verdi, che era simile all'aspetto delle cellule di controllo. L'unica differenza è che alcune di queste cellule avevano cromatina condensata, che era evidente sotto il filtro rosso (Figura 6C, D). Quando le cellule sono state esposte a NaOCl, senza strutture cellulari, come il nucleo o membrana cellulare, sono state osservate; lisi cellulare era evidente, e il materiale residuo è stato positivo sia per fluorescenza verde e rosso (Figura 6E, F). Figura 6 /analisi morto ossa umane osseo hTERT-MSC vivere sotto un microscopio a fluorescenza (X10). 6A, 6B - cellule non trattate con filtro verde, il nucleo appare integro, che indica una cellula vitale. 6B-con il filtro rosso, il nucleo apparsa scura, e solo la superficie esterna delle cellule era rosso, indicando che la parete cellulare è intatto. 6C, 6D- trattato con QMix ™ sotto un microscopio a fluorescenza (X10), 6E, 6F- trattato con ipoclorito di sodio sotto un microscopio a fluorescenza (X10).
Discussione
Questo in vitro
studio è stato condotto per valutare la citotossicità della soluzione irrigazione QMix ™ su cellule staminali mesenchimali del midollo osseo umano. MSC sono state proposte come un buon modello per i test tossicologici [29]. Le cellule staminali mesenchimali che sono stati utilizzati in questo studio sono stati immortalati dall'espressione ectopica della telomerasi umana trascrittasi (h-ter), che ha aumentato la durata della vita delle cellule [24] e mantenuto le loro proprietà staminali simili [30] inverso. Studi precedenti hanno riportato che le cellule immortalizzate possono essere utilizzati come un modello di prova per materiali dentali [31].
Le osservazioni dello studio hanno mostrato che entrambe le soluzioni (QMix ™ e NaOCl) sono tossici per MSC midollo osseo umano e causano danni cellulari . Ciò è coerente con i risultati di studi precedenti che hanno riportato sulla tossicità NaOCl [23, 32, 33]. Tossicità NaOCl può essere attribuito al suo alto pH (ossidrile azione ion), che interferisce con l'integrità della membrana citoplasmatica [34]. Inoltre, i nostri risultati sono in accordo con quelli di un vivo
precedente studio in, che ha trovato che QMix ™ è tossico e può indurre una risposta infiammatoria [35]. CHX è un agente tossico che si lega alla membrana plasmatica della cellula e ne aumenta la permeabilità, consentendo la fuoriuscita di enzimi lisosomiali [36]. EDTA, che è il secondo componente QMix ™, è noto anche per essere citotossici, forse per il suo effetto chelante e il calo accentuato nel pH che causa [11].
Vitalità cellulare diminuito significativamente quando le cellule sono state esposte a NaOCl per tutti i periodi di tempo esaminato. La vitalità cellulare è diminuita significativamente dopo essere stato esposto alla soluzione QMix ™ per 2 o 4 ore. Inoltre, dopo 24 ore, la vitalità delle cellule era significativamente diminuito rispetto a 2 e 4 ore di esposizione. Questi risultati mostrano che l'effetto tossico di un agente aumenta gradualmente con il tempo. Questa osservazione è in accordo con quelli di studi precedenti, confermando che la tossicità dipende dal tempo [37]. Al contrario, i risultati del saggio MTT hanno mostrato una significativa diminuzione della vitalità cellulare di cellule che sono stati esposti NaOCl a tutti i periodi esaminati. Rispetto QMix ™ cellule -exposed, NaOCl diminuita vitalità a 2 e 4 ore.
Precedenti studi hanno segnalato che il saggio AB è leggermente più sensibile del saggio MTT. Tuttavia, entrambi i saggi basano sul metabolismo enzimatico, che può essere inibita o indotto dall'agente test, producendo così un risultato falso positivo o falso negativo. Pertanto, un'attenta interpretazione dei risultati è sempre consigliato [38]. Le nostre osservazioni suggeriscono che il saggio AB è una scelta migliore per i test di vitalità cellulare perché è facile da eseguire, più consistente saggio MTT, e raccomandato da studi precedenti [38, 39]. Tuttavia, è sempre consigliabile utilizzare più di un test per valutare citotossicità. Pertanto, gli studi precedenti che si basavano esclusivamente sul test MTT devono essere rivalutati e interpretati con cautela.
Indagini morfologiche microscopiche sono necessari per confermare tossicità cellulare [40]. Questo perché una cellula può subire modifiche tossici quali distacco, pur continuando a metabolizzare MTT al formazano, conseguente sovrastima della vitalità cellulare nel saggio MTT rispetto al dosaggio AB [38]. Pertanto, le caratteristiche morfologiche cellulari sono stati studiati per entrambe le soluzioni.
Le cellule che sono stati esposti a QMix ™ visualizzare un minor numero di alterazioni morfologiche. Questa osservazione è in accordo con Faria et al., Il quale ha riferito che alte concentrazioni di CHX potrebbero mantenere la forma delle cellule L929 [41] per il suo effetto la fissazione delle cellule [42].
Le immagini SEM per il gruppo QMix ™ ha mostrato il restringimento citoplasmatica con pareti cellulari parzialmente frammentati ma intatte. Queste caratteristiche sono tipiche di apoptosi, come riportato in precedenza [40]. Inoltre, la colorazione EB /AO ha mostrato brillanti nuclei frammentati verde, che indica l'apoptosi precoce [27]. Le cellule esposte a NaOCl avevano restringimento citoplasmatica o rottura delle membrane, che sono caratteristiche tipiche di necrosi [43]. La colorazione EB /AO del gruppo NaOCl visualizzata rosso e verde, materiale riflettente residuo che può essere il risultato di lisi cellulare, e potrebbe essere osservata alcuna struttura cellulare. L'analisi complessiva di questi risultati suggeriscono che le cellule nei gruppi QMix ™ sono nelle prime fasi di apoptosi ma non sono ancora morti, in contrasto con il gruppo NaOCl. Sia NaOCl e QMix ™ sono citotossici; Tuttavia, sembra che il loro modo di uccisione delle cellule diversa a causa delle loro diverse composizioni. Secondo Galluzzi et al. [44], la morte delle cellule possono essere classificati in quattro tipi differenti in base alle caratteristiche morfologiche delle cellule morenti: apoptosi (tipo 1), autofagia (tipo 2), necrosi (oncosis, Tipo 3), e la catastrofe mitotico. Ogni modalità di morte cellulare ha la propria funzione; necrosi induce una risposta infiammatoria quando è necessario, mentre le cellule apoptotiche in vivo
stanno rapidamente fagocitati senza indurre una risposta infiammatoria, che è considerato un meccanismo per evitare l'attivazione immunitaria. Secondo i nostri risultati, questa modalità di morte cellulare potrebbe essere associato con un'esposizione elevata concentrazione di NaOCl.
Apoptosi è una forma attiva di morte cellulare noto come morte cellulare programmata, ed è caratterizzato dal restringimento delle cellule e la condensazione della cromatina nucleare seguita dalla frammentazione nucleare con il normale aspetto morfologico organelli citoplasmatici e la manutenzione di una membrana plasmatica intatto [44]. Secondo i nostri risultati, questa modalità di morte cellulare potrebbe essere associato con l'esposizione QMix ™. Tuttavia ulteriori indicatori quali il rilevamento delle caspasi, substrati spaccati, le autorità di regolamentazione e gli inibitori sono necessarie a sostegno di questa modalità di morte cellulare speculato con QMix ™ [45]. La morte cellulare attraverso apoptosi si verifica attraverso due vie principali: una via estrinseca che coinvolge recettori di morte, e un percorso intrinseco che viene modulato da membri della famiglia Bcl-2 [46], che consiste di componenti della membrana mitocondriale esterna [47] . Pertanto, i mitocondri sono considerati organelli chiave nei percorsi alla morte cellulare in aggiunta alla sua normale attività metabolica [48, 49]. Tuttavia, queste proteine possono anche funzionare in alcune vie metaboliche normali. Così, mitocondriali indagini attività metabolica, come ad esempio il test MTT, devono considerare questi potenziali sovrapposizioni tra l'attività delle cellule pre-apoptotica e il metabolismo delle cellule normali [40]. Questa sovrapposizione potrebbe spiegare i risultati contraddittori dei saggi AB e MTT.
In vitro
citotossicità indagini riferito che CHX ha avuto un maggiore tossicità in colture cellulari di ipoclorito di sodio [33, 41]. Tuttavia, in vivo
studi suggeriscono che CHX o QMix ™ è meno aggressivo di ipoclorito di sodio [35, 50]. Questa differenza può essere attribuita ad ospitare meccanismi di difesa che operano in un ambiente in vivo
nostro vitro
studio ha le seguenti limitazioni:. È stato condotto su cellule in coltura, ed i risultati rappresentano solo la risposta di queste cellule in isolamento, senza prendere in considerazione il meccanismo di difesa dell'ospite per la disintossicazione. Inoltre, in un ambiente clinico, le soluzioni sono sempre forniti a canali radicolari, che sono circondate da dentina, e sono quindi estrusa alla zona periapicale. Precedenti studi hanno segnalato che l'effetto citotossico di irriganti può essere neutralizzata da dentina [33, 51]. Abbiamo messo le soluzioni direttamente sulle celle, e non tentativi sono stati fatti per fornire queste soluzioni attraverso canali radicolari per simulare la situazione clinica.
Conclusioni
Entro i limiti di questo studio, si può concludere che sia il NaOCl e Le soluzioni QMix ™ sono tossici per MSC midollo osseo umano. La soluzione QMix ™, che induce la morte cellulare lenta, sembra essere più biocompatibile rispetto alla soluzione NaOCl. fascicoli presentati originali Quindi, sulla base di queste osservazioni, si può concludere che la QMix ™ è relativamente più sicuro radice canale irrigante rispetto al NaOCl.
Dichiarazioni
d'autore per le immagini
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Gli autori dichiarano di non avere interessi in gioco.
autori contributi
AK, SMA, AM e MAE ha effettuato lo studio, le procedure di laboratorio e valutazione dei risultati. SA, AK e AMA coinvolti nello sviluppo del concetto, disegno dello studio, la revisione del manoscritto e l'analisi statistica. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.
