Abstract
sfondo
superfici delle mucose sono rivestite con strati di gel di muco che proteggono i tessuti sottostanti e favoriscono la colonizzazione da parte dei membri della microflora commensale. Lactobacillus fermentum
è un abitante comune del cavo orale, gastrointestinale e tratti riproduttiva ed è uno dei più importanti batteri lattici che contribuiscono alla formazione di una sana microflora intestinale. Abbiamo studiato l'attività proteolitica in L. fermentum
in risposta alle interazioni con il MUC5B mucina, che è una componente importante di gel di muco nei siti colonizzati da questo microrganismo
. Metodi
biofilm di Lactobacillus fermentum
sono stati istituiti nelle cellule mini-flusso in presenza o assenza di salivare umana MUC5B. L'attività proteolitica delle cellule biofilm è stato esaminato in un microscopio confocale a scansione laser con un substrato proteasi fluorescente. La degradazione di MUC5B di L. fermentum
è stato analizzato utilizzando SDS-PAGE seguita da Western blotting con antisieri sollevate contro il peptide MUC5B. proteine della superficie cellulare differentialy espresse in un ambiente MUC5B-ricchi sono stati identificati con l'ausilio di confronto elettroforesi bidimensionale seguita da LC-MS /MS.
Risultati
Lactobacillus fermentum
aderito bene alle superfici rivestite con MUC5B mucina e in biofilm di L. fermentum
formati in un ambiente MUC5B, la proporzione di cellule proteolytically attivi (47 ± 0,6% della popolazione), come mostrato dalla scissione di un substrato di caseina fluorescente, era significativamente maggiore (p & lt; 0.01 ) rispetto a quella biofilm formati in brodo nutriente (0,4 ± 0,04% della popolazione). Pertanto, la presenza di mucine MUC5B migliorata attività della proteasi batterica. Tale effetto è principalmente imputabile al contatto con mucine superficie associata piuttosto che quelli presenti in fase fluida. I biofilm di L. fermentum
erano in grado di degradare mucine MUC5B suggerendo che questa glicoproteina complesso può essere sfruttata come fonte di nutrienti per i batteri.
Confronto dei proteomi superficie delle cellule biofilm di L. fermentum
in un ambiente MUC5B con quelli in brodo nutriente mediante elettroforesi bidimensionale e spettrometria di massa, ha mostrato che l'attività proteolitica maggiore è stato associato ad aumentata espressione di un glicoproteasi; O-
sialoglicoproteina endopeptidasi, così come le proteine chaperone quali DnaK e fattore scatenante.
Conclusioni
Adesione alla mucina rivestite superfici porta ad uno spostamento verso una proteasi attiva fenotipo più all'interno di L. fermentum
biofilm e proteasi prodotte entro i biofilm può degradare mucine MUC5B. L'attività proteolitica maggiore era associato ad un aumento del O-
endopeptidasi sialoglicoproteina sulla superficie cellulare. Proponiamo che l'up-regolazione delle proteine chaperone nell'ambiente mucina può contribuire al fenotipo proteasi attiva attraverso l'attivazione del glycopeptidase. Ciò rappresenterebbe un modo per commensale lattobacilli es L. fermentum
di sfruttare substrati complessi nel loro ambiente locale al fine di sopravvivere sulle superfici mucose
Parole
lattobacilli proteolitici attività proteolisi muco glicoproteina elettronico materiale supplementare
La versione online di questo articolo (doi.: 10. 1186 /1472-6831-13-43) contiene materiale supplementare, che è disponibile per gli utenti autorizzati.
Sfondo
superfici mucose del corpo sono colonizzati da un gran numero di specie batteriche commensali che coesistono in un rapporto mutualistico con il loro ospite umano. Queste comunità microbiche, o biofilm, si ritiene che costituiscono la prima linea di difesa contro le infezioni, inibendo competitivamente organismi non autoctoni che possono causare la malattia. Nell'intestino, la flora commensale è stato proposto di avere un'influenza importante sullo sviluppo, l'immunità e la nutrizione (per recensioni vedi [1-3]). Nonostante la loro importanza, sorprendentemente poco si sa su come i membri di queste comunità sopravvivono nell'ambiente mucosale e interagiscono tra loro, e l'host, per formare un ecosistema dinamico. Lactobacillus
rappresenta il gruppo più numeroso e diversificato tra i batteri lattici che abitano superfici mucose negli esseri umani, tra cui il tratto gastrointestinale [4], tratto riproduttivo femminile [5] e la cavità orale [6]. I lattobacilli sono generalmente visto come il conferimento di effetti biologici benefici per l'host. Ad esempio, nel tratto gastrointestinale, lattobacilli promuovere stimolazione immunitaria e rinforzo della mucosa difesa [7]. Tra i lattobacilli, Lactobacillus fermentum
è un abitante comune del tratto gastrointestinale [8], compresi la cavità orale [9, 10]. In contrasto con il ruolo benefico nell'intestino, Lactobacilli nella cavità orale sono spesso associati con la malattia cariosa [6] e Lactobacillus fermentum
frequentemente isolato da carie dentinale lesioni nei bambini, implicando un ruolo nel processo di carie [11]
. superfici mucose sono protette da uno strato di muco-gel derivato da cellule mucina producono nei epiteli sottostanti. gel muco sono composti da grandi glicoproteine gelificanti polimeriche appartenenti alla famiglia di proteine mucina e le specie mucina comprendenti questi gel su diverse superfici mucosali possono variare. Per esempio, MUC5B è una mucina predominante nella cavità orale, tratto riproduttivo femminile e le vie aeree [12] mentre MUC5AC, MUC6 e MUC2 si trovano in siti diversi in tutto il tratto gastrointestinale [13]. Le grandi mucine polimerici sono costituiti da subunità legate da ponti disolfuro, e all'interno di ogni tratti subunità di nudo si alternano proteine spina dorsale con le regioni altamente glicosilate che contengono un gran numero di catene laterali oligosaccaridi [14]. bind Lattobacilli ad entrambi mucine gastrico o intestinale [15] e una proteina mucina poroso (32 Mmubp), che è un componente del sistema di teletrasporto ABC, è stato identificato in L. fermentum
[16]. Interazioni con mucine più probabile consentono lattobacilli da conservare all'interno dello strato di muco dove contribuiscono alla formazione di biofilm multispecie.
Attualmente, i meccanismi che regolano la sopravvivenza e la crescita dei lattobacilli su superfici mucosali sono ampiamente irrisolto. Tuttavia, dal momento che i batteri lattici sono in grado di assumere peptidi brevi tramite sistemi di trasporto, che sono specifici per oligopeptidi (OPP) e di-tripeptidi (DTPT) [17], la crescita e la sopravvivenza in biofilm in ambienti muco solo molto probabilmente dipenderà la capacità dei batteri di degradare substrati complessi come mucine. La capacità dei batteri di utilizzare mucine come loro unica fonte di nutrienti è stata dimostrata per akkermansia muciniphilia
che è stato isolato da un campione di feci da un adulto sano [18]. studi di bioinformatica rivelano che il genoma di L. fermentum
ceppo 28-3-CHN codifica almeno 10 proteasi. Di questi, alcuni sono previsti per essere extracellulare e quindi hanno le potenzialità per svolgere un ruolo nella generazione di sostanze nutritive da mucine su superfici mucose. Nel presente studio indaghiamo attività come proteolitica in biofilm di L. fermentum
è legato all'ambiente circostante i batteri; un ambiente ricco di mucina o liquido di brodo nutriente ricco di proteine, come pure se grandi mucine gelificanti possono essere degradati da L. fermentum
come potenziale fonte di nutrienti. Inoltre, sono stati esaminati i cambiamenti nell'espressione delle proteine sulla superficie cellulare associata con l'aumento di attività proteolitica.
Metodi
batterica ceppo
Al fine di studiare le interazioni naturali tra MUC5B e Lactobacillus fermentum, impara una clinica ceppo noto per essere in grado di sopravvivere e crescere in un ambiente ricco di muco è stato isolato da placca dentale. Il ceppo, che ha avuto origine da approssimali placca sopragengivale da un sano 30 anni, maschio,
è stato identificato da una crescita selettiva in ROGOSA test di media e di fermentazione che utilizzano il sistema API-50 CHL (BioMerieux, Marcy l'Etoile, Francia ). Identificazione come L. fermentum
è stata confermata dal sequenziamento dei geni PHE
[19]. I batteri sono stati conservati a -80 ° Cand sub-coltivate due volte su agar sangue in atmosfera al 5% di CO
2 in aria a 37 ° C per 48 ore prima dell'uso.
Isolamento di salivare umana MUC5B
umano salivare mucina MUC5B stato isolato come precedentemente descritto [20]. Tutta la saliva è stata raccolta in ghiaccio da otto volontari, riunito e poi mescolato con un volume uguale di 0,2 M NaCl e agitata per una notte a 4 ° C. Dopo centrifugazione delicata (4400 g per 30 minuti a 4 ° C), il supernatante è stato sottoposto a centrifugazione in gradiente di densità isopycnic in CsCl /0,1 M NaCl (Beckman Optima LE-80 K, rotore 50.2Ti, 36.000 rpm, 96 h, 15 ° C, inizia la densità 1,45 g /ml; Beckman, Fullerton, CA, USA) e 22 frazioni sono stati raccolti. Le frazioni contenenti MUC5B-state riunite, dializzata contro PBS (0,15 M NaCl, 5 mM NaH 2PO 4, pH 7) e conservati a -20 ° C fino al momento dell'uso. Per determinare la concentrazione di MUC5B, sono stati riuniti aliquote delle frazioni MUC5B contenenti, dializzato contro acqua, liofilizzato, e pesati (0,3 mg ml -1). Il pool di MUC5B è stato sottoposto a dodecil solfato di sodio-poli-acrilammide elettroforesi su gel (SDS-PAGE), esaminare se le proteine a basso peso molecolare associati con la rete di gel contaminato la preparazione.
Formazione di biofilm
L. fermentum
colonie di agar sangue sono stati sospesi in brodo nutriente [brodo Todd-Hewitt (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)] o in una soluzione MUC5B in PBS per dare OD 600 valori di 0,4 ± 0,01 (corrispondente a circa 1 × 10 6 celle ml -1). I biofilm sono stati stabiliti in cellule mini-flow Ibidi μ-slide (Integrated Bio Diagnostics, Martinsried, Germania) inoculando 120 ml di sospensione nei canali e incubando in umidificata al 5% di CO 2 in aria a 37 ° C per 24 ore. I canali furono lavate con PBS per rimuovere le cellule non aderenti. In alcuni casi, i vetrini sono stati pre-condizionata con 100 ml di MUC5B + 10 microlitri 10 mM CaCl 2 notte in umidificata al 5% CO 2 in aria a 37 ° C per ottenere un rivestimento MUC5B. I vetrini sono stati lavati con PBS prima della formazione del biofilm. la formazione di biofilm è stata confermata dalla colorazione con la BacLight ™ LIVE /Kit DEAD (Molecular Probes Inc., OR, USA) e la visualizzazione utilizzando una Nikon Eclipse TE2000 invertito microscopio confocale a scansione laser (CSLM).
Attività proteolitica
Per indagare l'attività proteolitica delle cellule planctoniche, le cellule L. fermentum
sono stati esaminati con il kit di analisi a fluorescenza della proteasi QuantiCleave ™ (Pierce, Rockford, iL, USA), come descritto in precedenza [21]. Brevemente, le cellule sono state incubate per 1 ora a 37 ° C con il FITC etichettato substrato di caseina ad una concentrazione di 10 ug ml -1 in 25 mM Tris con 150 mM NaCl e regolato a pH 7,2. Aliquote sono state poi introdotte in mini-flow-cellule Ibidi μ-diapositive e di contrasto con la fluorescenza SYTO62® rosso colorante DNA-colorazione (Molecular Probes Inc., OR, USA) per 10 minuti a temperatura ambiente. Per le cellule biofilm, il substrato fluorescente e di contrasto sono stati introdotti direttamente nelle cellule mini-flusso in cui i biofilm sono stati in crescita. Le cellule sono state poi visualizzati utilizzando CSLM e 20 immagini casuali da ciascuna slitta biofilm sono state acquisite utilizzando una stazione motorizzata collegata al software Nikon del microscopio. Ogni immagine conteneva più di 1000 cellule batteriche e la proporzione di cellule rosse e verdi per ogni diapositiva biofilm, corrispondente a circa 20.000 cellule, è stato analizzato usando il pacchetto software bio
Image_L [22]. Gli esperimenti sono stati ripetuti tre volte e il valore percentuale medio per le cellule proteolytically attivi è stata calcolata. I risultati sono stati poi ulteriormente analizzati utilizzando il Mann-Whitney U
valori di test e p inferiori al 5% sono stati considerati come significativi.
Analisi del degrado di MUC5B di L. fermentum
biofilm
Mini flow le camere sono state pre-condizionati con cellule MUC5B e L. fermentum
quindi inoculati in brodo nutriente. Dopo 24 ore, il terreno è stato rimosso e mucine MUC5B sospese in PBS sono stati aggiunti al biofilm per altre 24 ore. Trascorso questo tempo, il fluido nella cella a flusso è stato raccolto con una pipetta e centrifugato per rimuovere le cellule batteriche (10000 g, 5 min, 4 ° C). Il surnatante mucina contenenti, così come un controllo (mucine MUC5B incubate per 24 ore a 37 ° C ma non esposti a L. fermentum
) sono stati analizzati mediante SDS-PAGE in condizioni seguita da Western blotting denaturazione. I campioni (15 microlitri della surnatante) sono stati miscelati con 5 ml tampone campione NuPAGE LDS (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) e funzionano su NuPAGE 4-12% gel BisTris (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) a 180 V per 1 ora. I gel sono stati elettro-cancellati su membrane PVDF (Millipore, Immobilon-P, 0.45 mm, Bedford, MA, USA) durante la notte utilizzando una Mini Trans-Blot elettroforetico trasferimento cellulare (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) e delle membrane poi bloccato con 5% (w /v) di latte secco in TBST (20 mM Tris, 137 mM NaCl, 0,05% Tween 20) per 1 ora. mucine MUC5B sono stati rilevati utilizzando un antisiero (LUM5B-14), contro un peptide sintetico con l'CRAENYPEVSIDQVGQVL sequenza presente nel terzo dominio Cys del peptide MUC5B, diluito 1: 1000 in 5% BSA /TBST. Le membrane sono state incubate (1 ora) con un anticorpo di capra anti-coniglio coniugato con perossidasi di rafano (Dako, p0448, Glostrup, Danimarca) diluito 1: 2500 in 5% latte scremato /TBST, e le bande sono state visualizzate usando il rilevamento ECL occidentale kit (Pierce, Rockford, IL, USA).
2DE, LC-MS /MS e Western blotting di proteine di superficie cellulare
La fase di massa che circonda le cellule biofilm che crescono in un MUC5B- o in un ambiente fratel- nutrienti, era rimosso con una pipetta dal flusso cellule e sostituito con 50 ml di tampone di estrazione comprendente 5 M urea, 2 M tiourea, 2% CHAPS, 2% caprylyl sulfobetaine, 2 mM tributil fosfina, 0,5-2% IPG e 40 mM Tris Base regolata a pH 9,5. Al fine di solubilizzare le proteine di superficie delle cellule biofilm rimanenti, le portate cellule sono state incubate con agitazione per 1 ora a temperatura ambiente e il tampone di estrazione poi rimosso e centrifugato per 10 minuti (6000g
). Le concentrazioni di proteine nei sovranatanti risultanti sono stati determinati utilizzando un kit 2D Quant (GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, Regno Unito). I surnatanti sono stati poi diluiti con tampone di reidratazione contenente 8 M urea, 2% CHAPS, 10 mM DTT, 2% Immobiline (IPG) di buffer (GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, Regno Unito) per dare una concentrazione proteica finale di 20 mg a 200 ul. Questi campioni sono stati posti in cassette ri-gonfiamento con 11 cm strisce IPG, range pH 4-7, sopra e reidratazione è stata eseguita in olio a temperatura ambiente per 30 ore. focalizzazione isoelettrica è stata effettuata essenzialmente come descritto da Davies et al.
[23], utilizzando il Multiphor II (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK), per 85 ore, 500 volt. Le strisce sono state equilibrate e poi incorporati in cima 14% gel di poliacrilammide. SDS-PAGE è stata eseguita con una corrente costante di 15 mA /gel, 10 ° C, durante la notte in una PROTEAN II cellule xi (Bio-Rad, Hercules, CA) con alta gamma dell'arcobaleno standard peso molecolare (GE life Sanità Sciences, Little Chalfont, UK) sul lato acida delle strisce IPG. I gel sono stati colorati con argento in base alle istruzioni del produttore o colloidale Coomassie Brilliant Blue G per l'identificazione delle proteine. I gel sono stati analizzati utilizzando il software Delta2D (Decodon GmbH, Greifswald, Germania). Dopo l'identificazione dei confini piatte, i valori integrati densità ottica (IOD) sono stati determinati ed espressi come percentuale dell'intensità totale per gel. Macchie che mostrano più di una differenza di tre volte sono stati tagliati dal gel Coomassie-macchiati, sottoposto a in-gel digestione trittico e analizzati mediante LC-MS /MS come descritto [23]. Per il rilevamento di O-
endopeptidasi sialoglicoproteina, gel 2DE erano elettro-cancellato su membrane PVDF (Millipore, Immobilon-P, 0.45 mm, Bedford, MA, USA) durante la notte con un trasferimento di cellule Mini Trans-Blot elettroforetico (Bio-Rad , Hercules, CA, USA) e le membrane poi bloccato con il 5% (w /v) latte in polvere in TBST (20 mM Tris, 137 mM NaCl, 0,05% di Tween 20) per 1 ora. La proteina è stata rilevata usando un antisiero policlonale MOB-LFGE-2 contro un peptide sintetico con la sequenza (CDAAGEAYDKVGRV) (Innovagen AB, Lund, Svezia), diluito 1: 1000 in 5% BSA /TBST. Le membrane sono state incubate (1 ora) con anticorpi di capra anti-coniglio coniugato con perossidasi di rafano e bande sono state visualizzate utilizzando il kit di rilevazione ECL occidentale come descritto sopra
. Risultati
Confronto di attività proteolitica in cellule planctoniche e biofilm di L. fermentum
per studiare l'effetto di MUC5B sull'attività proteolitica nelle cellule planctoniche di L. fermentum
, le cellule sono state esposte a MUC5B in fase fluida. brodo nutriente è stato utilizzato come controllo. La proporzione di cellule proteolytically attivi è stata valutata utilizzando CLSM dopo incubazione con FITC-caseina. Questo rivelato alcuna differenza tra la proporzione di cellule proteolytically attivi in brodo nutriente a quelle mucine MUC5B sospese in PBS, e in entrambi i casi l'attività nel popolazione era inferiore al 4% (Figura 1). Nessuna differenza nel livello di attività della popolazione di cellule sospese in mucine MUC5B in PBS e sospese in PBS solo (Controllo) è stato visto (dati non mostrati). Per confrontare l'attività proteolitica delle cellule planctoniche con quello delle cellule biofilm di L. fermentum,
batteri sono stati autorizzati a formare biofilm in condizioni statiche in un sistema di camera di mini-flow per 24 ore in un ambiente MUC5B (su superfici rivestite con MUC5B e MUC5B in fase fluida) o un ambiente brodo nutriente. La proporzione di cellule proteolytically-attive nel biofilm nell'ambiente MUC5B era dieci volte maggiore (47 ± 0,6%) rispetto a quella per i loro omologhi planctonici (Figura 1B) mentre tale aumento è stato visto in biofilm formati in presenza di brodo nutriente. Imaging dei biofilm ha mostrato che le cellule L. fermentum
rispettate sia la non rivestito e le superfici MUC5B rivestite e biofilm formati (Figura 2). Nell'ambiente MUC5B, cellule proteolytically attivi sono stati distribuiti uniformemente in tutto il biofilm (Figura 2a) mentre l'attività in ambiente brodo nutriente era basso (Figura 2b). Questi dati indicano che l'attività proteolitica è aumentata nelle cellule biofilm di L. fermentum
in un ambiente ricco di mucina. L'effetto non si vede quando le cellule planctoniche L. fermentum
sono esposti agli stessi mucine in fase fluida o in presenza di brodo nutriente. Figura 1 Percentuale di cellule Lactobacillus fermentum proteolytically attivi in planctonici e biofilm cultura. Grafici che mostrano la percentuale di cellule proteolytically attivi nelle popolazioni di (a) planctonico o (b) le cellule biofilm di L. fermentum
in un MUC5B- o di una sostanza nutritiva brodo-ambiente, come rivelato utilizzando un substrato fluorescente in combinazione con CSLM. Le barre rappresentano il valore medio di tre esperimenti indipendenti ± SE (** p & lt; 0.01).
Figura 2 attività proteolitica popolazioni biofilm Lactobacillus fermentum in presenza o assenza di mucine MUC5B. immagini CSLM mostrano cellule biofilm cresce in (a) la presenza di un ambiente MUC5B o (b) un ambiente brodo nutriente. attività proteolitica è stata visualizzata mediante incubazione con un substrato di caseina FITC-coniugato (verde) per 1 ora. Le cellule sono state poi contrastate usando Syto 24 (rosso). La barra rappresenta 20 micron e gli inserti mostrano ingrandimenti quattro-fold dei principali micrografie.
Attività proteolitica nelle cellule biofilm di L. fermentum
è influenzato dalla superficie associata MUC5B
Per determinare se la valorizzazione del proteolitici attività nella L. fermentum
popolazione biofilm nell'ambiente MUC5B è principalmente attribuibile alle mucine superficie associati o quelli in fase di massa, gli effetti di questi sono stati esaminati separatamente. I biofilm di L. fermentum
sono stati quindi stabiliti sia su superfici MUC5B rivestite con brodo nutriente in fase fluida, o su superfici non patinate con MUC5B in fase fluida. In presenza di MUC5B superficie associata, analisi delle immagini ha rivelato che il 13 ± 3% della popolazione era proteoliticamente attiva (figura 3), mentre nelle cellule esposte al MUC5B nella fase fluida unica, l'attività è stata molto bassa (0,3 ± 0,02%). Quindi, questi dati dimostrano che la presenza di mucine sulla superficie era importante per il miglioramento della attività proteolitica. Tuttavia, la proporzione di cellule attive sui mucine superficie associata solo era significativamente inferiore a quella osservata in ambiente MUC5B, dove mucine erano presenti nella fase bulk anche. Questo suggerisce che l'adesione a MUC5B superficie associato può essere 'innescato' le cellule consentendo loro di rispondere alla presenza di MUC5B in fase fluida. Figura 3 attività proteolitica popolazioni biofilm Lactobacillus fermentum in presenza di (a) di superficie associato o (b) in fase fluida mucine MUC5B. immagini CSLM mostrano cellule biofilm cresce in (a) la presenza di una superficie di strato di mucine MUC5B o (b) in presenza di mucine MUC5B in fase fluida. attività proteolitica è stata visualizzata mediante incubazione con un substrato di caseina FITC-coniugato (verde) per 1 ora. Le cellule sono state poi contrastate usando Syto 24 (rosso). La barra rappresenta 20 micron e gli inserti mostrano ingrandimenti quattro-fold dei principali micrografie.
Degradazione di MUC5B di L. fermentum
Per determinare se mucine per l'ambiente ricco di mucina sono degradati dalle proteasi prodotte all'interno della L. fermentum
biofilm, mucine MUC5B che erano in contatto con biofilm per 24 ore sono stati sottoposti a SDS-PAGE seguita da Western blotting con un antisiero anti-MUC5B (Figura 4). mucine di controllo, che non erano state in contatto con i batteri, sono stati visualizzati come una singola banda sulla superficie del gel dimostrando che erano di alto peso molecolare (superiore a 300 kDa). Tuttavia quando mucine erano state incubate con L. fermentum
biofilm, una banda aggiuntiva apparso nella regione superiore del gel gradiente 4-12% indica che una parte delle mucine aveva subito un degrado che ha permesso MUC5B migrare nel gel. Così questi dati confermano che le popolazioni biofilm proteolytically-attivi di L. fermentum
può degradare MUC5B. Figura 4 Degrado del polipeptide spina dorsale MUC5B da proteasi da biofilm di L. fermentum. Un campione di controllo di MUC5B (a) e MUC5B che era in contatto con cellule biofilm per 24 ore (b) sono stati sottoposti a SDS-PAGE su gel 4-12%. Dopo elettro-blotting su membrane PVDF, MUC5B è stato rilevato utilizzando il LUM5B-14 antisiero. Il fondo del pozzo è indicato
. L'espressione di proteine di superficie in L. fermentum
Dal mucine MUC5B sono stati degradati dalle cellule biofilm di L. fermentum
, la banca dati del genoma è stato analizzato per proteasi in grado di glicoproteine degradante. Usando questo approccio, una proteasi, O-
sialoglicoproteina endopeptidasi, con un peso molecolare di circa 35 kDa, è stato selezionato come possibile candidato. Western Blotting di 2DE gel di proteine di superficie da L. fermentum
cellule biofilm con un antisiero policlonale contro un peptide nella sequenza del glycopeptidase individuato un punto a 32 kDa, corrispondente ad O-
endopeptidase sialoglicoproteina (vedere Figura 5a). Per studiare se questa proteina era differenzialmente espresso sulla superficie di L. fermentum
cellule biofilm nei diversi ambienti, proteine di superficie di cellule biofilm in un ambiente MUC5B sono stati confrontati con quelli di cellule in un nutriente-brodo ambiente utilizzando 2D- elettroforesi su gel. L'analisi delle immagini di gel d'argento macchiato ha rivelato che l'espressione del O-
endopeptidasi sialoglicoproteina è stato migliorato di 2,7 volte in presenza di MUC5B, rispetto al brodo di coltura. Inoltre, un certo numero di punti nell'intervallo 52-76 kDa mostrato livelli elevati di espressione nel MUC5B- rispetto nutrienti brodo-ambiente (vedi figura 6 e Tabella 1). Questi sono stati tagliati da un corrispondente gel Coomassie macchiati (vedere Figura 5b), sottoposto a LC-MS /MS e le proteine poi identificate confrontando i frammenti triptici con il database Mascot. Questo ha rivelato quattro proteine con più di tre volte up-regulation in MUC5B- rispetto ai nutrienti brodo-ambienti, corrispondente alle proteine chaperone; fattore scatenante (aumento di 25 volte), DnaK (aumento di 9 volte), Ef-G (aumento di 6 volte) e GroEL (aumento di 3 volte). Così questi dati mostrano che oltre up-regolazione del glicoproteasi, maggiore attività proteolitica nella popolazione è associato ad un aumento della superficie-espressione delle proteine chaperone DnaK, GroEL e fattore scatenante. Figura proteine 5 Superficie identificate nelle cellule biofilm di L. fermentum. (A) Western blotting di elettroforesi bidimensionale (2DE) di proteine di superficie. I campioni sono stati sottoposti ad IEF in un gradiente di pH 4-7 seguito da SDS-PAGE in 14% gel. Dopo elettroblotting su membrane PVDF, GPR,
endopeptidasi O-sialoglicoproteina è stato rilevato usando l'antisiero policlonale MOB-LFGE-2. (B) gel colorato con Coomassie Brilliant Blue dopo 2DE di proteine di superficie. Spot sono stati asportati dal gel colorato, sottoposto a in-gel digestione trittico e le proteine identificate mediante analisi LC-MS /MS. Le proteine identificate sono state: arg
, arginina deiminase; ATPasi
, ATP sintasi piruvato deidrogenasi; DnaK
; Ef-G
, fattore di allungamento G; Ef-Tu
, fattore di allungamento Tu; FUM
, fumarato hydratase; Groel
; LDH
, lattato deidrogenasi; KET
, phosphoketolase; orn
, carbamiltrasferasi ornitina; PDH
, piruvato deidrogenasi e PPH
, idratasi phophopyruvate.
Figura 6 bidimensionale gel elettroforesi delle proteine di superficie da Lactobacillus fermentum. Le proteine isolate da batteri in un MUC5B-ambiente (sinistra) o un ambiente brodo nutriente (destra) sono stati sottoposti ad IEF in un gradiente di pH 4-7 seguito da SDS-PAGE in 14% gel. Gel sono stati silver-macchiati e l'analisi delle immagini delle proteine espresse in modo diverso eseguiti utilizzando il software Delta 2D.
Tabella 1 Identificazione delle proteine di superficie in L. fermentum biofilm migliorate più di 2,0 volte in ambiente MUC5B rispetto ad un ambiente di brodo di coltura di un
proteine
IOD%
Piegare changeb
MUC5B
brodo nutriente
trigger factor
3.53
0.14
25.2
DnaK
2.57
0.29
8.9
Elongation fattore G
2.91
0.46
6.3
GroEL
5.66
1.84
3.1
O-sialoglycoprotein endopeptidasi
3.31
1.24
2.7
piruvato deidrogenasi
3.04
1.22
2,5
ADATA ottenuto dall'analisi dei gel d'argento macchiato 2DE mostrate in Figura 6.
cambiamento bFold calcolata come valore percentuale della densità integrata ottica (IOD) di proteine in il MUC5B contro l'ambiente brodo nutriente.
Discussione
nei loro ambienti naturali nella cavità orale, del tratto gastro-intestinale e delle vie riproduttivi femminili, lattobacilli si trovano in biofilm multi-specie all'interno degli strati di muco aderenti sull'host superfici mucose. Sopravvivenza e la crescita in tali siti dipende dalla capacità dei batteri di legarsi agli strati muco e di degradare substrati complessi come glicoproteine muco per generare piccoli peptidi e saccaridi come fonte di nutrizione. In questo studio, L. fermentum
era in grado di legare e biofilm forma nell'ambiente MUC5B, secondo l'espressione della proteina mucina vincolante 32 Mmubp da questa specie [16]. Il MUC5B mucina è una componente importante di strati di muco aderente nella cavità orale e il tratto riproduttivo femminile, entrambi i siti in cui L. fermentum
è noto per colonizzare [10, 24].
La proporzione di proteolytically-attiva cellule entro popolazioni biofilm di L. fermentum
era significativamente più elevata in un ambiente ricco di mucina che in presenza di brodo nutriente suggerendo che la presenza di mucine promuove l'attività proteolitica in L. fermentum
. La capacità di mucine MUC5B per indurre attività proteolitica è stato precedentemente dimostrato nel batterio commensale orale, Streptococcus mitis
[25] e di up-regolazione dell'attività proteolitica è stato anche mostrato in patogeno fungino Aspergillus fumigatus
crescita in gastrica mucine [26]. Per determinare i ruoli relativi delle mucine superficie associata e in fase fluida nel mediare questa attività maggiore, le cellule L. fermentum
è stato permesso di aderire alle superfici rivestite con mucine o per formare biofilm su superfici non mucina rivestite in cui erano esposto ai soli mucine fase fluida. Questo ha rivelato che l'esposizione al sole mucine in fase fluida non ha avuto effetto up-regolamentazione su attività proteolitica nei biofilm. Analogamente, l'attività proteolitica non è stata superata in cellule planctoniche esposte a mucine in soluzione, indicando che la presenza di mucine nella fase fluida non up-regolare l'attività proteolitica in L. fermentum
. Al contrario, il contatto delle cellule con mucine superficie associata causato un significativo aumento dell'attività proteolitica all'interno della popolazione suggerendo che mucine giocano un ruolo centrale nel regolare l'effetto e che le molecole di superficie associati sono di particolare importanza. I meccanismi alla base di questa osservazione sono attualmente noti, ma è possibile che epitopi all'interno delle mucine, rivelati come risultato del legame ad una superficie, sono necessari per up-regolazione dell'attività proteolitica. È interessante notare, il livello di attività proteolitica in cellule biofilm su mucine superficie associata (13 ± 0,4%) era inferiore a quello osservato quando mucine erano presenti sia sulla superficie che in fase fluida (47 ± 0,6%), suggerendo che le cellule Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.
