Abstract
sfondo
Impianti in titanio nella cavità orale sono ricoperte da una pellicola di saliva di derivazione a cui i microrganismi che colonizzano presto quali oralis Streptococcus
può legare. I profili proteici di pellicole salivari in titanio non sono stati ben caratterizzati e le proteine importanti per vincolanti sono quindi sconosciuti. batteri biofilm mostrano diversi fenotipi dalle loro controparti planctonici e il contatto con le proteine salivari può essere un fattore che contribuisce alla induzione di cambiamenti nella fisiologia. Abbiamo caratterizzato pellicole salivari da superfici in titanio e studiato come il contatto con superfici in titanio non patinate e saliva rivestite colpisce l'attività metabolica in cellule aderenti di S
. oralis
.
Metodi
pellicole salivari su superfici lisce di titanio sono stati desorbito e questi, così come purificata saliva umana, sono stati sottoposti a elettroforesi su gel bidimensionale e la spettrometria di massa. Un modello di flusso delle cellule piastra parallela è stata utilizzata per studiare vincolante di un isolato fresco di S
. oralis
alle superfici in titanio non patinate e saliva rivestite. attività metabolica è stata valutata utilizzando il Bac
Luce CTC Kit vitalità e la scansione microscopia confocale laser. Gli esperimenti sono stati condotti in triplicato ei risultati analizzati utilizzando t di Student
-test o ANOVA.
Risultati
secretoria IgA, α-amilasi e cistatine sono stati identificati come le proteine dominanti nelle pellicole salivari. adsorbimento selettivo delle proteine è stato dimostrato dal arricchimento di proteine prolattina-inducibile e l'assenza di zinco-α
relativa alla saliva 2-glicoproteina. L'aderenza di S
. oralis
al titanio ha portato ad un up-regolazione dell'attività metabolica nella popolazione dopo 2 ore. In presenza di una pellicola salivare, questo effetto è stato potenziato e sostenuto per i successivi 22 ore
. Conclusioni
Abbiamo dimostrato che l'aderenza alle superfici lisce in titanio sotto flusso provoca un up-regolazione di attività metabolica nei primi anni orale colonizzatore S
. oralis
, molto probabilmente come parte di un adattamento al modo di biofilm della vita. L'effetto è stato arricchito da una pellicola salivare contenente slgA, α-amilasi, cistatine e proteine prolattina-inducibile che era, per la prima volta, identificato come una componente abbondante di pellicole salivari in titanio. Ulteriori studi sono necessari per chiarire i meccanismi alla base l'effetto della superficie di contatto sulla attività metabolica, nonché di identificare le proteine salivari responsabili per migliorare l'effetto.
Parole
batteri microbica del biofilm dentale impianto Streptococchi elettronico materiale supplementare
la versione online di questo articolo (doi:. 10 1186 /1472-6831-13-32) contiene materiale supplementare, che è disponibile per gli utenti autorizzati
Sfondo
la cavità orale umana ospita un gran numero di. diverse specie batteriche che si trovano in complessi, biofilm multi-specie. Su denti, questi biofilm sono comunemente noti come placca dentaria. Fondamentale per la formazione e lo sviluppo della placca è l'adesione di specie pioniere come Streptococcus oralis
, Streptococcus mitis
e Streptococcus
gordonii così come actinomyces naeslundii
alla pellicola salivare che ricopre la superficie del dente [1, 2]. Dopo la formazione di biofilm è stato inizializzato e la superficie del dente nascente è colonizzato, co-aderenza colonizzatori successive porta alla formazione di biofilm orali maturi [3]. Lo sviluppo precoce di biofilm su impianti dentali non è stata ben caratterizzata ma la sequenza di colonizzazione microbica è pensato per essere simile a quella per i denti nella stessa cavità orale [4, 5].
Denti e impianti dentali, nonché le superfici mucosali, sono coperti con una pellicola che è una pellicola sottile di proteine adsorbite derivano principalmente dalla saliva. proteine Pellicle fornire una serie di potenziali recettori per il fissaggio dei primi colonizzatori. Una combinazione di in vivo ed in vitro
studi utilizzando approcci basati su anticorpi e proteomica, ha dimostrato che la pellicola di smalto acquisito contiene una serie di differenti proteine salivari tra cui lisozima, istatine, statherins [6], α-amilasi , cistatine, IgA (sIgA), lattoferrina e proteine ricche di prolina (PRP) [7], così come la grande mucina salivare, MUC5B [8]. Per una sintesi completa di proteine rilevate in pellicole smalto vedere Siquiera et al
., 2012 [9]. La composizione di una pellicola aderente, nonché la densità e la conformazione delle proteine presenti in essa, è generalmente ritenuto essere influenzato dalle proprietà fisico-chimiche del substrato, ma, ancora, la composizione complessiva delle pellicole salivari formata sulla superfici in titanio diversamente modificati sono sconosciuti. Nonostante l'esistenza di solo pochi studi, alcune proteine salivari tra cistatine, slgA, α-amilasi e proteine ricche di prolina sono stati identificati la pellicola aderente costituita il titanio in vitro
usando Western blotting [10, 11]. Tuttavia in tutti questi studi, i metodi di preparazione saliva per l'uso come una pellicola possono avere un grande impatto sui risultati ottenuti. Per esempio, tecniche di filtraggio e di centrifugazione può rimuovere grandi popolazioni di proteine salivari che portano alla formazione di pellicole salivari non rappresentativi di quelli presenti in vivo
.
Il riconoscimento che biofilm microbici sono un fattore importante associato all'errore di impianti dentali [12] ha portato a molte indagini di adesione batterica alle superfici in titanio. In vivo
, dove l'aderenza dei batteri e la formazione salivare pellicola si verificano in parallelo, S
. oralis
e S
. mitis
sono stati tra i primi colonizzatori predominanti su superfici in vetro rivestito in titanio e non Actinomyces
specie sono stati trovati [13]. In vitro
, la presenza di saliva su entrambe le superfici lisce o moderatamente-grezzi è stato dimostrato che sia aumentare sia ridurre l'aderenza del colonizzatore precoce, S
. oralis
, [10, 14], mentre legame di A
. naeslundii
al titanio non è stata influenzata dalla presenza di una pellicola salivare [11]. Complessivamente, i risultati degli studi di aderenza batterica al titanio in presenza di saliva non hanno dato un'immagine chiara e mentre alcune delle differenze visti possono attribuibile alla saliva utilizzato, variazione dei ceppi batterici e tipi di superficie di titanio possono contribuire alla la mancanza di consenso.
Mentre lo sviluppo del biofilm è importante per lo sviluppo della malattia orale, un fattore che contribuisce cruciale è la fisiologia e livello di attività dei batteri aderito. adattamento batterica alla modalità biofilm della vita è nota per essere associata con i principali cambiamenti nella trascrizione e sintesi proteica [15]. Per esempio, in Porphyromonas gingivalis
comparativa analisi trascrittomica ha rivelato che un gran numero di geni differenzialmente espressi nelle cellule biofilm rispetto alle loro controparti free-floating [16]. In uno studio in Streptococcus mutans
, il tasso relativo di sintesi di almeno 25 diverse proteine è stato migliorato entro 2 ore di attaccamento a una superficie di vetro. Queste proteine sono stati per lo più associati con carboidrati catabolismo [17] suggerendo che i cambiamenti nell'attività metabolica possono verificarsi durante l'adesione alle superfici. Poco è attualmente conosciuta, tuttavia, circa lo stato metabolico delle cellule durante le interazioni con le proteine pellicle nelle prime fasi di formazione di biofilm. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di studiare come l'aderenza alle superfici in titanio colpisce l'attività metabolica dei primi colonizzatori S
. oralis Comprare e per determinare l'effetto di una pellicola salivare su questo processo. Per far luce su cui le proteine salivari possono influenzare l'aderenza e l'attività metabolica, sono state identificate le proteine predominanti presenti in una pellicola salivare formate su titanio.
Metodi
Batteri e condizioni di coltura
Un isolato clinico fresco di S
. oralis
(89C) è stato ottenuto da un paziente con un continuo infezione peri-impianto dopo l'approvazione etica era stato ottenuto presso la Facoltà di Odontoiatria [14]. I batteri sono stati coltivati overnight su agar sangue in atmosfera al 5% di CO 2 in aria a 37 ° C. Le colonie sono stati sospesi in 120 ml di tampone fosfato salino [0.15M NaCl, 10mM NaH 2PO 4, pH 7,4 (PBS)] per dare un OD 600 nm = 0,6. Per gli esperimenti di flusso di cellule, un volume uguale di PBS è stato aggiunto a dimezzare la concentrazione cellulare prima della formazione del biofilm, mentre per gli esperimenti planctonici sospensione batterica originale è stata miscelata con un volume uguale di una PBS, o il 50% dell'intero saliva umana dare una concentrazione finale del 25% saliva.
Raccolta e preparazione di saliva
saliva intero raccolte sul ghiaccio più di 1 ora da dieci individui sani è stato messo in comune e preparato come descritto in precedenza [18], dopo l'approvazione etica era stato ottenuto dalla Facoltà di Odontoiatria. Brevemente, il campione è stato miscelato con un volume uguale di PBS, agitata delicatamente notte a 4 ° C e centrifugato in una centrifuga Beckman Coulter Avanti JE (Beckman JA 20 rotante; Beckman Coulter, Brea, CA) (20 minuti, 30 000 g
, 4 ° C). Il surnatante è stato quindi sottoposto ad isopycnic centrifugazione in gradiente di densità in CsCl /0,1 M NaCl in un Beckman Coulter Optima LE-80K Ultracentrifuga (Beckman 50,2 Ti rotore, partendo densità 1,45 g ml -1) a 36000 rpm per 90 ore a 15 ° C. Le frazioni contenenti batteri sono stati scartati e quelli rimasti sono stati riuniti, dializzati contro PBS e conservati a -. 20 ° C
superfici in titanio
Le superfici in titanio utilizzati in questo studio erano di commercialmente puro di grado IV titanio, che era liscia, con una rugosità superficiale media (S a) di 0,1 micron [14]. Le piastre (99 × 25 × 0,8 mm) sono stati trasformati, pulito con detersivo, risciacquati con acqua distillata e sterilizzati con irraggiamento γ (ELOS Pinol A /S).
Caratterizzazione di saliva pellicole
Due piastre di titanio, separati da un distanziatore di gomma di spessore di 1,6 mm sono stati montati in una cella a flusso e le superfici rivestite con il 50% dell'intero pernottamento saliva umana. Trascorso questo tempo, la portata cellule sono state svuotate e le superfici lavate (2 × 2 minuti) con PBS su una piastra oscillante. Per rimuovere le pellicole di superficie associata, una miscela di Tween 80 (0,006 v /v%) e Triton X-100 (0,012 v /v%) è stato introdotto e l'intera cella a flusso posto in un bagno ad ultrasuoni per 1 ora. I contenuti sono poi stati svuotati e raccolte prima di ripetere questo passaggio per altri 15 minuti. desorbates proteine raccolti dopo ogni lavaggio sono stati raggruppati e la concentrazione di proteine determinato utilizzando un kit 2D Quant (GE Healthcare Life Sciences). Un volume corrispondente a 20 mg di proteine è stato sottoposto a 2DE. Brevemente, il desorbate è stato diluito con tampone di reidratazione e posta in una cassetta ri-gonfiamento 18 cm pH 4-7 strisce IPG lineari (GE Healthcare Life Sciences) sulla parte superiore. La reidratazione è stata effettuata a temperatura ambiente per 30 ore sotto olio di silicone. Isoelettrico è stata effettuata utilizzando un Multiphor II (GE Healthcare Life Sciences) con acqua di raffreddamento a 15 ° C fornito da Pharmacia Multitemp II. La focalizzazione è stato avviato a 150 V per 1 ora e continuò a 300 V per 3 ore, 600 V per 3 ore, 1200 V per 12 ore ed infine 3,500 V per 20 ore. Dopo focalizzazione, le strisce IPG sono stati conservati a -80 ° C. Prima di eseguire nella seconda dimensione, le strisce IPG sono stati equilibrati primo in 50 mM tampone Tris pH 6,8 contenente 2% SDS, 26% glicerolo e 16 mM DTT per 15 minuti e poi in 50 mM tampone Tris pH 6,8 contenente 2% SDS, 26 % glicerolo, 250 mm iodoacetamide e 0,005% blu di bromofenolo per altri 15 minuti. Le strisce IPG equilibrate stati incorporati in cima 14% gel di poliacrilammide (20 × 20 x 0,1 cm) usando 0.5% (w /v) agarosio fuso. SDS-PAGE è stata eseguita con una corrente costante di 15 mA gel -1, 10 ° C, durante la notte in una cella di PROTEAN II xi (Bio-Rad) con standard di massa molecolare arcobaleno-alta gamma (GE Healthcare Life Sciences) run sul lato acida delle strisce IPG. I gel sono stati colorati con Coomassie Brilliant Blue o argento secondo i protocolli di GE Healthcare Life Sciences.
Identificazione di proteine su gel 2D da LC-MS /MS
macchie di interesse sono stati asportati manualmente dal blu brillante Coomassie macchiati gel 2DE di tutta la saliva e sottoposto a LC-MS /MS come precedentemente descritto [19]. Brevemente, le proteine sono state ridotte con DTT (60 ° C, 20 minuti), alchilato con iodoacetamide (25 ° C, 10 minuti) e poi digerito con tripsina (37 ° C, 8 ore). peptidi triptici stati separati e sottoposti a MS. picchi peptide sono stati deconvoluto automaticamente e liste di massa sotto forma di Mascotte file generico utilizzato come input per Mascot MS /MS Ioni ricerche del database NCBInr utilizzando il server Web Matrix Science (http:.. //www matrixscience com) .
Determinazione della copertura della superficie e la vitalità
vitalità delle cellule sospese in PBS o il 25% dell'intero saliva è stato valutato dalla colorazione una goccia della sospensione con il live /Morto Bac
kit di colorazione della luce (Life Technologies, Stoccolma , Svezia) al basale (tempo 0), dopo 2 ore e 24 e la visualizzazione di un confocale a scansione laser microscopio invertito (CSLM) (Eclipse TE2000, Nikon Corp.). Il sistema a piastra cella a flusso verticale, parallelo utilizzato è stato descritto in precedenza (14). In breve, S
. cellule oralis
erano passati più di due superfici in titanio (99.25 × 25.25 × 0,8 mm) separati da un distanziatore in gomma 1,6 millimetri, che erano o non rivestito o era stato rivestito con la saliva durante la notte. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti a 37 ° C e un flusso laminare di 42 ml h -1 è stato utilizzato per modellare il flusso giornaliero di saliva sulle superfici orali. Tutte le soluzioni sono state introdotte attraverso l'ingresso inferiore e deflusso sono verificati attraverso la valvola superiore. Inizialmente, superfici sono state lavate con PBS per 30 minuti. La stessa sospensione batterica è stato poi introdotto in due portate cellule; uno contenente due superfici non rivestite e l'altro contenente due superfici saliva rivestite per 2 o 24 ore a 37 ° C. Dopo questo tempo, le portate cellule sono state lavate con PBS (come sopra) per 30 minuti per rimuovere batteri liberamente attaccati dalle superfici. copertura della superficie e la vitalità delle cellule superficiali associate sono stati valutati su una delle piastre di titanio in ogni flusso di celle che utilizzano Live /Morto Bac
colorazione della luce. Gli esperimenti sono stati condotti tre volte utilizzando colture batteriche indipendenti.
Determinazione dell'attività metabolica
Per studiare l'attività metabolica delle cellule planctoniche, una porzione è stata prelevata dal medesimo sospensione batterica utilizzata per le misure di vitalità e posta in una Ibidi flow camera di cellulare e le cellule incubate con la Bac
Kit Luce CTC Vitality (Life Technologies, Stoccolma, Svezia) in una camera umida a 37 ° C per 2 ore. I vetrini sono stati poi visualizzati con un CSLM. Per studiare l'attività metabolica delle cellule aderito, la seconda piastra di titanio in ciascuna cella a flusso, è stato incubato con il Kit vitalità Bac
luce CTC come sopra e le cellule poi di contrasto con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo ( DAPI, Life Technologies, Stoccolma, Svezia). cellule colorate sono state visualizzate utilizzando un CSLM. un'analisi Immagine Stock e Statistiche
Per i campioni colorati con il Live /Morto Bac
kit di colorazione della luce, dieci immagini casuali ciascuno con una superficie di 127,3 micron 2 sono stati presi per l'analisi delle immagini. Le immagini sono state analizzate utilizzando il BioImage
_L
pacchetto software per quantificare la copertura della superficie media, così come la percentuale di tensione (verde) e le cellule morte (rosso) [20]. Per i campioni colorati con la Bac
Kit vitalità luce CTC per valutare l'attività metabolica, analisi delle immagini è stata eseguita osservando almeno 1000 cellule e contando il numero di cellule metabolicamente attive (rosso /rosa) e le cellule non attive (non colorato nel campioni di sospensione o blu contrastate sulle superfici in titanio). I risultati ottenuti sono stati valutati utilizzando t di Student
-test per confrontare due gruppi o un one-way ANOVA con il post-test di Bonferroni per confrontare tre gruppi. Un intervallo di confidenza del 95% è stato scelto e valori di p inferiori a 0,05 sono stati considerati significativi.
Risultati
formazione di biofilm su titanio portate cellule
La capacità biofilm di formazione di S
. oralis
è stata studiata in un sistema di cella a flusso contenente due superfici di titanio non rivestite. Colonie batteriche dispersi in PBS sono state introdotte nel flusso di cellule e lasciate aderire per 2 o 24 ore. Dopo 24 ore, la copertura superficiale media è diminuita del 60% rispetto a quella dopo 2 ore, suggerendo che alcune delle cellule che hanno aderito inizialmente staccate nel tempo (Figura 1). Nella sospensione cellulare prima il livello di fattibilità è stato alto come rivelato dalla colorazione con l'/kit Morto Bac
luce diretta. Dopo 2 e 24 ore, la vitalità delle popolazioni aderenti non era significativamente diverso da quello della sospensione iniziale, indicando che il legame al titanio non ha influenzato negativamente le cellule. Poiché le superfici nella cavità orale sono coperti con una pellicola salivare, abbiamo studiato l'effetto della saliva aderenza e la vitalità di S
. oralis
. Su superfici rivestite con il 25% di saliva, la copertura della superficie media dopo 2 ore (178 ± 103 micron 2) non era significativamente differente a quello visto sulle superfici patinate (p = 0.67) (dati non riportati). Per quanto riguarda le superfici non rivestite, dopo 24 ore la copertura della superficie media sul manto saliva era diminuita (24,6 ± 7,4 micron 2), dimostrando che le cellule batteriche anche indipendente da queste superfici nel tempo. Il livello di vitalità delle cellule sulla superficie saliva rivestita non era significativamente differente da quella sulla superficie non rivestita nello stesso punto temporale. Figura 1 Immagini che mostrano la formazione di biofilm da S. oralis su superfici in titanio rivestiti. Batteri sospese in PBS è stato permesso di formare biofilm su superfici di titanio in un sistema di cella a flusso piastre parallele per 2 e 24 ore. La vitalità delle cellule è stata valutata mediante Live /Morto Bac
colorazione della luce e la visualizzazione con CSLM. la copertura di superficie sulle piastre di titanio è stata valutata da dieci immagini casuali utilizzando il BioImage
_L
pacchetto software. Le barre di scala rappresentano 10 micron e gli inserti mostrano cellule in duplice allargamento.
Attività metabolica in relazione al contatto con superfici non verniciate e saliva rivestite
attività metabolica S
. cellule oralis
è stata valutata utilizzando il Bac
Kit Vitalità Luce CTC, dove le cellule metabolicamente attivi riducono il sale tetrazolio incolore a un prodotto formazano insolubile facendoli apparire rosso (o rosa, in presenza del colorante di contrasto DAPI blu). Cellule rimossi da agar sangue al tempo 0 e dispersi in PBS mostrato un basso livello di attività metabolica endogena (6 ± 1,5%) (Figura 2). Continua incubazione delle cellule in PBS avuto alcun effetto significativo sul livello di attività metabolica dopo 2 ore (4 ± 0,5%) o 24 ore (2 ± 0,1%). Tuttavia, dopo 2 ore nel modello di flusso delle cellule, la popolazione aderenti conteneva una proporzione significativamente maggiore di globuli rossi che indicano che l'attività metabolica è stata stimolata dal contatto con una superficie. Dopo 24 ore, il livello di attività metabolica nella popolazione aderente era diminuita ma era ancora significativamente maggiore nella sospensione PBS originale (p & lt; 0.01). Figura 2 Immagini che mostrano l'attività metabolica di S. oralis in sospensione e aderito a superfici in titanio rivestiti. Batteri sospese in PBS è stato permesso di formare biofilm su superfici di titanio in un sistema di cella a flusso piastre parallele per 2 e 24 ore. L'attività metabolica delle cellule è stata valutata utilizzando il Bac
Kit Vitalità Luce CTC. Per le cellule aderito, DAPI è stato utilizzato come di contrasto. Le cellule sono state osservate con CSLM e la percentuale di metabolicamente attiva (rosso /rosa), le cellule valutati contando manualmente almeno 1000 cellule. Le barre di scala rappresentano 10 micron e gli inserti mostrano cellule in duplice allargamento.
Gli effetti di rivestimento saliva sull'attività metabolica di batteri aderenti sono stati poi esaminati. Ciò ha rivelato che i livelli erano significativamente più alto per cellule associate con la superficie rivestita saliva dopo 2 ore e 24 ore rispetto a quelli nella sospensione originale PBS (p & lt; 0,001) (Figura 3). L'incubazione di batteri con 25% saliva in sospensione causato alcun cambiamento significativo dell'attività metabolica oltre 2 ore (4 ± 0,5%) o 24 ore (3 ± 0,6%), suggerendo che l'effetto era specifico a proteine salivari aderito ad una superficie. Questi dati mostrano che così assorbiti proteine salivari hanno la capacità di provocare una risposta metabolica che non si vede quando le proteine sono presenti in soluzione. Figura 3 Immagini che mostrano l'attività metabolica di S. oralis aderito a superfici in titanio saliva rivestite. Batteri sospese in PBS è stato permesso di formare biofilm su superfici di titanio saliva rivestite in un sistema di cella a flusso piastre parallele per 2 e 24 ore. L'attività metabolica delle cellule è stata valutata utilizzando il Bac
Kit Vitalità Luce CTC con DAPI come di contrasto. Le cellule sono state osservate con CSLM e la percentuale di metabolicamente attiva (rosso /rosa), le cellule valutati contando manualmente almeno 1000 cellule. Le barre di scala rappresentano 10 micron e gli inserti mostrano cellule in duplice allargamento.
Dato che le cellule non vitali sulle superfici non dovrebbero mostrare l'attività metabolica, per indagare il livello di attività metabolica in funzione del numero di cellule vitali , un parametro è stato calcolato per ciascun punto di tempo (Tabella 1). Questo ha rivelato che per le cellule sospese in PBS o saliva, mentre la redditività è stata mantenuta, non ci sono stati cambiamenti significativi nella attività metabolica nel corso del tempo. L'adesione ad una superficie patinata causato la proporzione delle cellule vitali che erano metabolicamente attiva salire al 50% dopo 2 ore, che legandosi a una pellicola saliva significativamente aumentato questo livello al 98% delle cellule vitali (p & lt; 0,001). Così, mentre il contatto iniziale con una superficie causato un aumento dell'attività metabolica nella popolazione, questo è stato notevolmente migliorata dalla presenza di una pellicola salivare. Dopo 24 ore, la proporzione di cellule metabolicamente attive sulla superficie di titanio non rivestita era scesa al 25%, mentre sulla superficie saliva rivestita livello rimasta al 96%. Questo suggerisce che, oltre a migliorare la risposta iniziale alla superficie di contatto, la presenza di proteine salivari sostenuto l'aumento dell'attività metabolica oltre 24 hours.Table 1 Percentuale di batteri vitali nella popolazione che mostra attività metabolica in diverse condizioni
ambiente
% cellule vive con attività metabolica
0 h
2 h
24 ore
Le cellule sospese in PBS
6 ± 1,5
4 ± 0,5
2 ± 0,03
cellule aderito superfici non verniciate in PBS
-
50 ± 4,5
25 ± 2.6
e cellule sospese nel 25% saliva sull'oggetto -
4 ± 0.8
3 ± 0.6
e cellule aderito alle superfici rivestite con il 25% di saliva sull'oggetto -
98 ± 4.3
96 ± 6.3
Caratterizzazione del rivestimento saliva su superfici in titanio
per identificare i principali componenti proteiche nella preparazione saliva priva di batteri, il materiale è stato sottoposto a 2DE e proteine visibili con la colorazione Coomassie blu brillante (Figura 4a). Questo ha rivelato la presenza di più di 100 punti, di cui sono stati raccolti la maggior parte (70), e 68 di questi potrebbe essere identificato tramite LC-MS /MS (Tabella 2). Quasi tutte le proteine presenti hanno dimostrato di essere di origine salivare, con secrezione di IgA, zinco-α 2-glicoproteina, i membri della famiglia cistatina, α-amilasi e proteine prolattina indotta (PIP) come la specie dominante nel preparazione. Inoltre, sono stati identificati kallikrein, proteine acidi grassi e proteine di legame di von Ebner. Figura 4 2DE gel di tutto saliva e la pellicola salivare desorbita dal superfici in titanio. Pool intera saliva umana (A) e pellicole salivari desorbiti dalla superfici di titanio e con detersivo (B) sono stati sottoposti a isoelettrico incentrata sulle strisce pH 4-7 IPG seguito da SDS-PAGE 14% gel. I gel sono stati colorati con Coomassie Blu (A) o argento (B). Macchie di interesse sono state raccolte dal gel Coomassie, identificati utilizzando LC-MS /MS e spot identità trasferiti al gel d'argento. Una spiegazione delle etichette è riportata nella tabella 2. Tabella 2
Identità di proteine da tutta la saliva o pellicole salivari desorbita dal superfici in titanio con detergente ottenuti utilizzando LC-MS /MS di spot da gel 2DE. Identità
proteine
nome Spot
% di copertura Sequenza
rilevata sulla superficie
amilasi
amy
45- 55
Sì
Calgranulin
cal
49
No
cistatina
S
cysS
77
Yes
SA
cysSA
37–73
Yes
D
cysD
31
Yes
acido grasso legame con le proteine
fab
51
Sì
Immunoglobulina A
catena J
IgA /J
37-63
Sì
catena pesante
IgA /h
18- 36
Sì
catena pesante C regione
IgA /c
21
No
secretoria component
sec
32–36
Yes
Bur
Bur
11–15
No
Immunoglobuline
Catena leggera (kappa)
Ig /κ
38-59
Sì
Kallikrein
kal
10
No
proteina prolattina-inducibile
pip
63-67 proteine ghiandola
Sì
Von Ebners s '(lipocalin)
VEB
27
No
zinco-α 2-glicoproteina
ZnGP
23-45
No
Per identificare le proteine presenti nel pellicola salivare formata sul titanio, superfici sono stati incubati durante la notte con la saliva e, dopo il lavaggio, le proteine aderito were desorbito con detergente e sottoposti a 2DE (Figura 4b). Argento colorazione dei gel rivelati circa 50 punti di cui tutti sono stati visti nel Coomassie macchiati gel di saliva. Secretoria IgA, proteine di cistatina, α-amilasi e PIP erano presenti, ma di zinco-α 2-glicoproteina era assente indicando che questa proteina non aderire alla superficie del titanio. L'intensità relativa dei punti PIP nella pellicola era superiore nella preparazione saliva originale suggerendo che questa proteina potrebbe essere arricchito sulla superficie di titanio.
Discussione
colonizzatori iniziali come S
. oralis
avviare la formazione di biofilm interagendo direttamente con la pellicola salivare che è presente sulle superfici orali. In questo studio, abbiamo usato pellicole di saliva predisposto dal gradiente di densità centrifugazione in condizioni non denaturanti. Il vantaggio di questa tecnica è che i batteri salivari, che sono pellettato, possono essere separati dai grandi macromolecole che consentono la preparazione di priva di batteri, saliva 'nativo' in cui anche grandi proteine salivari sono presenti. Abbiamo già identificato i due grandi mucine salivari (MUC5B e MUC7), così come GP340, lisozima, lattoferrina, α-amilasi, IgA e staterina in questa preparazione utilizzando ELISA [21]. In questo studio, abbiamo effettuato 2DE in combinazione con LC-MS /MS per identificare i minori peso molecolare delle proteine salivari (figura 4a). Secretoria IgA è la proteina più abbondante come rivelato dalla presenza di numerosi frammenti (componente secretoria, catena pesante, κ-catena e J-catena). In accordo con le analisi di saliva umana da parte di altri gruppi che utilizzano la proteomica approcci [7, 22] siamo stati anche in grado di identificare α-amilasi, proteine della famiglia cistatina, zinco-α 2-glicoproteina e PIP. acido grasso legame con le proteine, callicreina e von Ebners proteine della ghiandola (lipocalin) erano presenti in quantità minori. In questo studio abbiamo applicato la metodologia per esaminare le pellicole salivari formate su titanio. Questo ha dimostrato che sIgA e α-amilasi sono le proteine più abbondanti nel pellicle oltre ai membri della famiglia di proteine cistatina e PIP (Figura 4b). Studi precedenti utilizzando SDS-PAGE in combinazione con l'analisi Western blot con anticorpi specifici contro le proteine salivari, hanno dimostrato che l'α-amilasi, slgA e Prps legano al titanio [10, 11]. Zinco-α 2-glicoproteina è assente dalla desorbate pellicle suggerendo che questa proteina non aderisce al titanio mentre la maggiore abbondanza relativa di PIP nella desorbate che nella preparazione saliva originale indica che la proteina è arricchita sulla superficie. batteri orali come S
. salivarius
, S
. parasanguinis
e S
. oralis
può interagire con PIP [23, 24], suggerendo che questa proteina potrebbe svolgere un ruolo importante nella modulazione colonizzazione batterica superfici orali. A nostra conoscenza, questa è la prima volta che PIP è stato identificato come una proteina abbondante in pellicole di titanio. A 20 kDa proteina corrispondente al PIP [25] ha già dimostrato di legarsi a idrossiapatite, ma non è stato arricchito allo stesso modo trovato qui [26]. Un limite di questo studio, tuttavia, è che attualmente è noto se i risultati sono applicabili ad altre superfici in titanio con differenti topografie superficiali o modifiche di superficie.
Nel modello di flusso delle cellule, S
. oralis
aderito bene alle superfici rivestite saliva dopo 2 ore - in linea con altri studi su colonizzatori primari come Streptococcus anginosus
, Streptococcus
gordonii e Streptococcus sanguinis
[10] e actinomyces naeslundii
[11]. Come gruppo, streptococchi orali sono noti per esprimere adesine che hanno affinità per una serie di proteine presenti nella saliva [27]. In uno studio precedente, abbiamo identificato un 1.060 aminoacidi contenenti, proteine LPXTG-linked espresso in ceppi di S
. oralis
che legava bene a pellicole salivari e in silico
analisi del S
. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.
