Abstract
sfondo
papillomavirus umano (HPV) sono oncogeni e soprattutto associata a cancro cervicale. Recenti evidenze hanno dimostrato l'infezione da HPV in altri tessuti, tra cui epitelio orale e della mucosa. Anche se un recente studio pilota ha fornito nuove informazioni sullo stato di HPV per via orale in adulti sani da Nevada, nessuna informazione è stata ottenuta sulla prevalenza di HPV per via orale nei bambini o adolescenti, quindi, l'obiettivo di questo studio è quello di fornire informazioni più dettagliate sulla prevalenza orale di alta HPV rischio tra i bambini e gli adolescenti in Nevada
Metodi
Questo studio retrospettivo utilizzato campioni di saliva raccolti in precedenza, ottenuti da pazienti clinica dentale pediatrici (età 2-11). e gli adolescenti distretto scolastico locale (di età compresa tra 12-17) per l'alta -risk lo screening HPV (n = 118) utilizzando qPCR per la quantificazione e la conferma della sensibilità analitica e specificità.
Risultati
un piccolo sottoinsieme di campioni di saliva sono stati trovati al porto HPV16 ad alto rischio (n = 2) e HPV18 ( n = 1), che rappresenta un 2,5% del totale. Tutti e tre sono stati ottenuti da adolescenti maschi, e due di questi tre campioni provenivano da partecipanti bianchi.
Conclusioni
Anche se questo studio retrospettivo non ha potuto fornire correlazioni con i dati comportamentali o socio-economici, questo progetto proiettato con successo più di cento campioni di saliva per l'HPV ad alto rischio, che conferma sia HPV16 e HPV18 ceppi erano presenti in un piccolo sottoinsieme. Con crescente evidenza di infezione da HPV per via orale nei bambini, questo studio fornisce informazioni critiche di valore significativo per gli altri professionisti della salute dentale, medico, orale e pubblico che cercano di approfondire la comprensione della salute orale e rischio di malattia nella popolazione pediatrica.
Parole chiave
papillomavirus umano saliva orale di screening elettronico materiale supplementare
La versione online di questo articolo (doi:. 10 1186 /1472-6831-12-43). contiene materiale supplementare, che è disponibile per gli utenti autorizzati
sfondo
I papillomavirus umano (HPV) comprendono una famiglia strettamente correlata di virus a DNA, che sono in grado di integrarsi nel genoma umano per guidare la trasformazione degli epiteli infetto [1-4]. Gran parte delle prove epidemiologiche per la cancerogenesi HPV-driven, così come i meccanismi biologici, sono stati ricavati da studi su tumori della cervice [5-7] che isolato HPV ad alto rischio da entrambi i carcinomi a cellule squamose e adenocarcinomi [6-9] . Anche se HPV ad alto rischio guida il processo di trasformazione e malignità di quasi tutti i tumori della cervice, l'infezione da HPV è ormai noto per modulare la trasformazione epiteliale in mammella, del polmone, del pene, anale, e anche i tessuti orali [10-20].
Il primario fattori di rischio per la carcinogenesi orale sono il tabacco e l'uso di alcol, anche se nuove linee di prove ora suggeriscono HPV può anche essere un fattore di rischio indipendente [17-23]. La più alta prevalenza di ceppi di HPV ad alto rischio di tumori orofaringei pre-cancerose e cancerose suggerisce che l'HPV può infettare preferenzialmente in via di sviluppo o stabilito tumori, modulando in tal modo la progressione cancerogeno e, in definitiva influenzare i risultati di salute [24-26]. In realtà, alcune prove ha suggerito che l'infezione da HPV ad alto rischio può essere associata con una migliore risposta al trattamento e tassi di sopravvivenza più elevati [27-29], mentre notizie contrastanti hanno dimostrato notevolmente diminuito la sopravvivenza del paziente [30-32] o hanno osservato alcun distinguibile e gli effetti statisticamente significativi [33].
Nonostante la natura conflittuale di questi risultati, è chiaro che l'HPV può essere coinvolto nella modulazione della risposta tumorale e la progressione cancerogene, quindi molti di questi studi hanno fornito preziose informazioni epidemiologiche su quali ad alto rischio ceppi HPV sono più spesso implicati in questi casi [34-36]. Questi studi hanno rivelato HPV16, HPV18 e in misura minore, rappresentato per la stragrande maggioranza (71-94,7%) di alto rischio HPV orale rilevato [17, 18, 21-23, 34-36]. Inoltre, nuove prove suggeriscono ora che questi specifici ceppi di HPV ad alto rischio (HPV16 e HPV18), può avviare la carcinogenesi orale tra la frazione più piccola di pazienti affetti da cancro orale che non consumano alcool o uso di tabacco [37, 38].
Based sui risultati di HPV per via orale a non tabacco e non alcol associato tumori del cavo orale, altri recenti sforzi si sono concentrati più specificamente per valutare la prevalenza di HPV per via orale e la trasmissione all'interno di popolazioni sane, che ha anche confermato che HPV16 e HPV18 erano l'elevata orale più comunemente rilevato ceppi di HPV -risk [39-41] tra gli adulti in buona salute.
a tal fine, un recente studio pilota valutare HPV orale tra adulti sani è stata eseguita in Nevada [42], uno stato recentemente documentato con l'aumento dei tassi di tumori orofaringei, in netto contrasto con i tassi di declino osservato negli stati vicini e negli stati Uniti, più in generale [43, 44]. Questo studio ha rivelato la presenza di alto rischio ceppo HPV16, ma non HPV18, tra le donne e le minoranze, gli unici sottogruppi di popolazione hanno dimostrato di avere l'aumento dei tassi di cancro orpharyngeal - nonostante i tassi in calo globale osservata nella popolazione generale [45-47]. Questo studio ha utilizzato una procedura di screening della saliva a base, parte di una tendenza crescente verso metodologie meno invasive, come lavage- orale e proiezioni saliva a base, per analizzare lo stato di HPV orale tra i pazienti adulti sani [48-51]. Anche se
tassi di prevalenza variano ampiamente, questi studi hanno suggerito che l'infezione da HPV orale può essere sempre più, non solo tra gli adulti, ma più specificamente tra giovani adulti, adolescenti e bambini [52-54] .A tal fine, alcuni studi hanno esaminato l'HPV per via orale in bambini o adolescenti, anche se molti di questi si è concentrata principalmente sui bambini con condizioni mediche di base, come la co-infezione con il virus dell'immunodeficienza umana (HIV) [55-57]. La maggior parte di altre ricerche, tuttavia, si è concentrata più specificamente chiarire il ruolo di trasmissione di HPV verticali nei neonati, dimostrando il potenziale per acquisire HPV ad alto rischio durante il processo di consegna e di parto, anche se queste infezioni in genere si risolvono [58-63].
Tuttavia, nuove prove emergenti che ha dimostrato ad alto rischio di infezione da HPV per via orale nei normali, bambini sani, con i più alti tassi osservati tra i bambini sotto i 7 anni (7,9% -8,7%), e in calo i tassi osservati tra gli adolescenti sani (13- 20 anni, 5,1% -5,2%) e adulti sani (3,5%) [64, 65]. Queste osservazioni possono suggerire che l'infezione da HPV orale può avvenire attraverso uno stretto contatto personale con i membri della famiglia o attraverso il contatto con fomiti e da altri vettori in asili nido, scuola materna o in contesti di educazione primaria, con la maggior parte dei bambini immunologicamente competenti per risolvere queste infezioni [66]. Tuttavia, alcune infezioni possono persistere e il loro contributo allo sviluppo di tumori orali e altre patologie rimane poco chiaro
Anche se uno studio pilota è stato recentemente condotto per valutare lo stato di HPV per via orale, questo ha coinvolto pazienti adulti solo sano -. Senza informazioni ottenute su orale la prevalenza di HPV tra i bambini o adolescenti. Sulla base delle prove precedenti che dimostrano un certo livello di infezione da HPV per via orale nei bambini sani e negli adolescenti, in combinazione con la mancanza di dati su questa popolazione più in particolare, l'obiettivo di questo studio è quello di fornire informazioni più dettagliate sulla prevalenza dei ceppi di HPV ad alto rischio HPV16 e HPV18 nel cavo orale dei bambini e degli adolescenti in Nevada.
Risultati
la percentuale di esemplari femminili e maschili dal campione di studio non era statisticamente differente dalle proporzioni complessive all'interno della comunità locale della Contea di Clark, Nevada ( Tabella 1). Più in particolare, la percentuale di femmine e maschi nel campione era approssimativamente uguale (51,7% e 48,3%, rispettivamente), che non era significativamente differente rispetto alla popolazione locale (p = 0,7051
). La percentuale di campioni di minoranza (non bianco) è stato molto maggiore nel campione di studio (70,3%) rispetto alla popolazione locale (39,1%), che era statisticamente significativa (p
& lt; 0,0001). Anche se i dati della popolazione locale non erano disponibili per i confronti specifici per età, il campione di studio è stato compresa di più da bambini più piccoli (età 2-11: 59,3%) che da adolescenti e gli adolescenti (12-17: 40,7%) Tabella 1 analisi demografica. di studio partecipanti
CCSD (n = 48)
UNLV-SDM (n = 70)
campione totale (n = 118)
Clark County popolazione
analisi statistica
genere
femminile
n = 30 (62,5%)
n = 31 (44,3%)
n = 61 (51,7%)
n = 969.781 (49,7%)
χ2 = 0,17,849 mila df = 1
Maschio
n = 18 (37,5%)
n = 39 (55,7%)
n = 57 (48,3% )
n = 981.488 (50,3%)
p = 0,7051
Race
Bianco
n = 12 (25%)
n = 23 (32,9%)
n = 35 (29,7%)
n = 1.188.323 (60,9% )
χ2 = 28,3634 df = 1
non-White
n = 36 (75%)
n = 47 (67,1%)
n = 83 ( 70,3%)
n = 762.946 (39,1%)
p
& lt; 0.0001
Età
2-11
n = 0 (0%)
n = 70 (100 %)
n = 70 (59,3%)
n /A
12-17
n = 48 (100 %)
n = 0 (0%)
n = 48 (40,7%)
n /A
dettagliata analisi dei campioni di saliva ha rivelato una certa variabilità tra conteggi delle cellule, la concentrazione di DNA e la purezza del DNA tra i campioni (Figura 1). conta delle cellule variavano tra 0,8 - 2,3 x 10
a 6 celle /ml, che sono stati ulteriormente classificati in basso (0,8 - 1,4 x 10 6) e alta (1,6 - 2,3 x 10 6) conta delle cellule . DNA è stato isolato con successo da tutti i campioni di saliva, con la concentrazione media di DNA per i campioni osservati a 842,7 ng /mL. I campioni di ciascuna coorte (CCSD, UNLV) con conta di cellule nella categoria bassa sono stati trovati ad avere minori concentrazioni medie di DNA rispetto ai campioni appartenenti alla stessa coorte con conta di cellule nella categoria elevata. La misura dell'assorbanza e A260 /A280 analisi del rapporto confermato la purezza del DNA isolati, che era approssimativamente uguale tra coorti, nonché tra i campioni in basso e categorie alto numero di celle. Figura 1 Saliva analisi del campione: il conteggio delle cellule, isolamento del DNA e la purezza. A) Dopo la centrifugazione e la risospensione delle cellule in soluzione salina, il numero di cellule per ogni campione è stata determinata rivelando tre quarti dei campioni UNLV sono stati osservati per avere il conteggio delle cellule inferiori (0,8-1,4 x 106 cellule /ml), mentre solo un terzo del campione CCSD sono stati stimati * avere la conta delle cellule inferiori. B) concentrazioni di DNA sono stati trovati ad essere più elevato dai campioni alto numero di cellule all'interno di ciascuna coorte (CCSD: 859,4 e 707,1 ng /mL, rispettivamente; UNLV: 886,3 e 910,2 ng /mL, rispettivamente). la purezza del DNA media tra 1,71 e 1,82. C) uguale concentrazioni di DNA estratto (1 ml) è stato proiettato con GAPDH, che ha rivelato alcuna notevole variazione di intensità di banda tra le coorti di campioni di alta e bassa di cellule categorie di conteggio.
Campioni di DNA estratto sono stati successivamente sottoposti a screening per la presenza di HPV16 e HPV18 mediante PCR (Figura 2). Questo screening ha prodotto tre campioni HPV-positivi (n = 3/118), che rappresentano il 2,5% del totale schermato. Due di questi campioni (S5, S38) nutriva DNA HPV16 e uno è stato trovato al porto HPV18 DNA (S7). Trattamento dei campioni di DNA utilizzando qPCR disponibile valutazioni quantitative, nonché misure di sensibilità e specificità. Analisi di numero di copie per genoma per il gene housekeeping (β-actina) per l'HPV-positivi (range: 25 - 40 copie /genoma) e campioni HPV-negativi (4 - 93 copie /genoma) ha rivelato valori che erano ben al di sopra della valore di cut-off (& gt; 0,1 copie /genoma). I risultati di analisi qPCR ha rivelato il numero di copie di campioni HPV-positivi (range: 150 - 880 copie /genoma) che erano significativamente più alti rispetto ai campioni HPV-negative (range: 0.00148 - 0.0000016 copie /genoma), che potrebbero essere distinti in base al valore di cutoff (& gt; 0.001 copie /genoma). Queste analisi hanno rivelato senza falsi positivi o falsi negativi, dimostrando sensibilità e specificità sufficienti per accertare la percentuale di veri campioni HPV-positive (3/118 o 2,5%; 3/3 o 100%) e veri campioni HPV-negative (115/118 o 97,5%; 115/115 o 100%). Figura di screening campione 2 Saliva: analisi dei risultati qPCR HPV. A) Tre campioni sono stati trovati al porto di DNA di HPV: i campioni HPV16-positivi (S5, S38); Un campione è stato HPV-positivi (S7). B) analisi qPCR rivelato campioni HPV-positivi avevano valori ben al di sopra del valore soglia stabilita (& gt; 0.001 copie /genoma). C) Tutti i campioni di tre HPV-positivi erano di sesso maschile, che rappresentano il 2,5% del totale (n = 118). Due dei tre campioni HPV-positivi sono stati dai partecipanti bianchi. Tutti i campioni di tre HPV-positivi sono stati dalla coorte CCSD (età: 12-17); Entrambi i campioni HPV16-positivi sono stati ottenuti da vecchi partecipanti 14 anni, mentre il campione HPV18-positivo è stato ottenuto da una di 15 anni.
Anche se relativamente piccola percentuale di campioni HPV-positive non consente più ampie deduzioni, un'analisi descrittiva delle informazioni demografiche per quanto riguarda questi campioni ha rivelato che tutti e tre sono stati ottenuti da maschi (n = 3/57 o 5,3%) e nessuno sono stati ottenuti da femmine. I campioni di due HPV16-positivi sono stati raccolti dai partecipanti bianco invecchiato 14 (n = 2/35 o 5,7%), mentre il campione HPV18-positivo è stato raccolto da un partecipante non-bianco di 15 anni (n = 1/83 o 1,2%) . Tutti i campioni di tre HPV-positivi erano di coorte CCSD (adolescente) (n = 3/48 o 6,25%), mentre nessuno sono stati osservati nel UNLV-SDM (pediatrico) coorte (n = 70)
. Discussione
l'obiettivo principale di questo studio è stato quello di schermo normale bambini sani e gli adolescenti in Nevada per la presenza di HPV ad alto rischio per via orale. Questa analisi retrospettiva utilizzato campioni di saliva esistenti, raccolti da pazienti odontoiatrici pediatrici e adolescenti distretto scolastico locale, per ottenere dati nuovi da questa popolazione giovanile precedentemente testati completando in tal modo il corpo sempre crescente di prove riguardanti la prevalenza di HPV per via orale nei bambini. Ancora più importante, questi dati hanno suggerito una prevalenza orale di macchie di HPV ad alto rischio di circa il 2,5%.
Recenti studi su adulti sani hanno trovato tassi di prevalenza simili, compresi tra il 3,1 e il 5% [40, 41]. Infatti, il recente studio pilota di adulti sani in Nevada ha riferito l'HPV per via orale nel 2,6% dei 151 pazienti privi di tumore [42]. I risultati di questo studio erano nettamente diverse, però, perché due dei campioni di tre HPV-positivi sono stati ottenuti dai bianchi e tutti erano dai maschi -, mentre lo studio preliminare di adulti trovato HPV orale tra le donne e le minoranze solo. Altre prove ha suggerito che anche se i campioni provenienti da femmine e maschi avevano tassi simili di HPV per via orale (56 e 44%, rispettivamente), i campioni HPV-negativo da quello studio erano prevalentemente di sesso femminile (82%) - che fornisce alcune prove di una possibile maschile, di genere fenomeno simile ai risultati dello studio in corso [67]. Anche se ci sono molte spiegazioni possibili, come ad esempio la natura transitoria della popolazione locale, molti altri fattori come lo stress, la dieta, il reddito, la povertà, status socio-economico, e l'esposizione di HPV per via orale possono influenzare diversi gruppi razziali e di entrambi i sessi in modo simile.
Questo studio rappresenta un importante punto di svolta nella salute pubblica sforzi per chiarire la rilevazione di HPV per via orale in una zona geografica conosciuta per la superiore alla media (e in precedenza a più basso) i tassi di tumori orofaringei [43, 44]. Tuttavia, questo studio ha diversi limiti che devono essere riconosciuti. In primo luogo, la natura retrospettiva dello studio limitato le deduzioni che potrebbero essere fatti, a differenza di altri recenti studi prospettici di HPV per via orale nei bambini e negli adolescenti [64-68]. Inoltre, non ci sono dati comportamentali o socioeconomici dettagliate sono disponibili, come il reddito o il fumo comportamenti dei genitori, a causa della natura di questo studio pilota retrospettiva. Si spera che le indagini future che interessano l'HPV per via orale forniranno ulteriori approfondimenti con informazioni comportamentali più dettagliate, nonché i dati per quanto riguarda l'alloggio, l'istruzione, il reddito e altri indicatori socio-economici [67-71]
. Conclusioni
Questo progetto proiettato con successo campioni di saliva per HPV ad alto rischio, confermando entrambi i ceppi HPV16 e HPV18 erano presenti in un piccolo sottoinsieme. Anche se il lavoro precedente si è concentrato sulla trasmissione di HPV per via orale da madre a neonato durante il parto e in caso di allattamento [58-63, 68], vi è una crescente evidenza che suggeriscono che dopo il periodo perinatale, trasmissione di HPV per via orale attraverso uno stretto contatto personale, come mangiare condiviso utensili, giocattoli, baci e bagni possono rappresentare per la trasmissione di HPV per via orale (principalmente HPV16) nei bambini e negli adolescenti [72-75]. Questo studio, quindi, fornisce informazioni critiche di valore significativo per gli altri professionisti della salute dentale, medico, orale e pubblico che cercano di favorire una comprensione di HPV ad alto rischio la prevalenza tra i bambini come parte di una più ampia comprensione del rischio per la salute e la malattia orale in età pediatrica . popolazioni
Metodi
la dimensione del campione
data la prevalenza nota di HPV ad alto rischio per via orale nello studio precedente che proiettato adulti sani all'interno di questa area geografica, la dimensione del campione adeguato è stato calcolato utilizzando la seguente formula: n = Z
2
P
(1 - P
) /d
2, dove n = dimensione del campione, Z = Z
statistica per un livello di fiducia, P =
prevalenza attesa, e
d = precisione [76, 77]. Utilizzando il livello del 95% di fiducia, il valore Z
è stato determinato per essere 1.96; Utilizzando la precedente percentuale /prevalenza di HPV ad alto rischio del 2,6%, il valore P
è stato impostato come P
= 0.026; Il valore di d
deve essere calcolato a 0,5 (P
), con un conseguente valore d
= 0.013. Utilizzando questi ingressi, la dimensione minima del campione di questo studio è stato calcolato per essere n = 75.
soggetti umani
Il protocollo per questo studio dal titolo "Valutazione della retrospettiva microbica Presenza in esistente Repository saliva: una PCR-Based Survey molecolare di Oral microbiche popolazioni dagli attuali campioni di saliva "è stato archiviato, modificato, e approvato dall'Ufficio UNLV di Research Integrity - soggetti umani (OPRS # 1104-3801M) il 10 maggio 2011. I campioni di saliva esistenti sono stati raccolti nel corso di due studi precedenti all'interno la Scuola UNLV of Dental Medicine (SDM) nel corso del 2009-2010. campioni di saliva raccolti da uno studio preliminare di adolescenti (14-15 anni) sono stati ottenuti da un campione di convenienza di scuole selezionate all'interno della contea di Clark, Nevada School District (CCSD; n = 48); originariamente ottenuto ai fini della rilevazione livelli di batteri cariogeni orali. campioni di saliva raccolti da bambini (2-11 anni) sono stati ottenuti da un campione di convenienza all'interno della clinica odontoiatrica pediatrica UNLV-SDM (n = 70); originariamente ottenuto allo scopo di screening per metalli pesanti (piombo o Pb) fardello. In breve, per le collezioni di campioni di saliva originali a CCSD e UNLV-SDM, i genitori ei soggetti sono stati reclutati sul posto. Criteri di inclusione: informato permesso Consenso /Parent era tenuto e condotto in loco, così come un assenso a partecipare alla ricerca per tutti i bambini di età superiore ai sette anni che erano in grado di leggere. I criteri di esclusione: i soggetti di età inferiore ai sette anni di età, i soggetti che ha rifiutato di partecipare, e soggetti con i genitori che ha rifiutato di partecipare. Ogni campione è stato assegnato un unico, il numero generato in modo casuale per evitare distorsioni di ricerca, con le uniche informazioni demografiche per quanto riguarda i campioni di saliva: sesso, età, etnia e del partecipante studio originale. Questo progetto corrente era un'analisi retrospettiva di queste due raccolte di campioni di saliva; la dimensione totale del campione combinato per questo studio è stato n = 118.
saliva protocollo di raccolta
In breve, i soggetti che hanno accettato di partecipare hanno dato un piccolo, contenitore di raccolta della saliva sterili, Tubo da 50 ml polipropilene sterile (Fisher Scientific: Fiera prato, New Jersey, USA). I partecipanti sono stati poi chiesto di masticare su un piccolo pezzo di cera di paraffina per un minuto e poi a espettorare, in conformità con il precedente protocollo di studio pilota [42]; volumi di campione variavano da circa 50 ml a 2,5 ml. I campioni sono stati conservati in ghiaccio fino trasporto al laboratorio biomedico per l'analisi. Ogni campione di saliva è stato assegnato un unico, il numero generato in modo casuale per evitare distorsioni di ricerca. Le informazioni demografiche per quanto riguarda il campione è stato raccolto in concomitanza, che consisteva di età, sesso ed etnia solo. conteggio
cellulare e l'isolamento del DNA
Tutti i campioni sono stati centrifugati per 10 minuti a 2.100 g (RCF) e il pellet cellulare lavato con salina 1X tampone fosfato (PBS) (HyClone: Logan, Utah, USA) e risospeso in 5 ml di PBS 1X. il numero delle cellule è stato determinato utilizzando Trypan Blue (Fisher Scientific: Fair Lawn, New Jersey, USA) con una Zeiss Axiovert 40 microscopio invertito (Carl Ziess, Inc: Thornwood, New York, USA) e un emocitometro (Fisher Scientific: Fair Lawn, New Jersey, USA). Per determinare se i campioni ospitavano il virus HPV, il DNA è stato isolato dal campione di saliva con un minimo di 3,5 x 10 5 celle utilizzando il kit di isolamento GenomicPrep DNA (Amersham Biosciences: Buckinghamshire, Regno Unito), utilizzando la procedura raccomandata dal fabbricante come precedentemente descritto [12, 42, 78, 79]. purezza DNA è stato calcolato usando misurazioni del rapporto di assorbanza a 260 e 280 nm (rapporto A260 /A280 tra 1,7 e 2,0). reazione
catena della polimerasi (PCR)
DNA da ciascun campione è stato poi utilizzato per eseguire la PCR con la Fisher exACTGene completo kit per la PCR (Fisher Scientific: fair Lawn, New Jersey, USA) e un gradiente termociclatore Mastercycler (Eppendorf: Amburgo, Germania) utilizzando i seguenti primer per HPV16 [12, 78], HPV18 [12, 78, 79], e glyceraldehyde- 3- fosfato deidrogenasi (GAPDH) [80] (SeqWright: Houston, Texas, USA).
HPV16 primer forward, ATGTTTCAGGACCCACAGGA;
HPV16 primer reverse, CCTCACGTCGCAGTAACTGT
HPV18 primer forward, ATGGCGCGCTTTGAGGATCC;
HPV18 invertire fondo, GCATGCGGTATACTGTCTCT;
GAPDH primer forward, ATCTTCCAGGAGCGAGATCC;
GAPDH invertire fondo, ACCACTGACACGTTGGCAGT;
Uno mg di DNA modello è stato utilizzato per ogni reazione. La fase iniziale di denaturazione ha funzionato per tre minuti a 94 ° C. Un totale di 30 cicli di amplificazione sono stati eseguiti, costituito da 30 secondi di denaturazione a 94 ° C, 60 secondi di ricottura a 58 ° C e 30 secondi di estensione a 72 ° C. estensione finale è stato eseguito per cinque minuti a 72 ° C. I prodotti di reazione della PCR sono stati separati mediante elettroforesi su gel utilizzando Reliant 4% NuSieve® 3: 1 gel Inoltre agarosio (Lonza: Rockland, Maine, Stati Uniti d'America). Bands sono stati visualizzati con illuminazione UV di etidio-bromuro-macchiato gel e acquisite utilizzando una 100 Imaging Image Analysis Software Kodak Gel logica di sistema e 1D (Eastman Kodak: Rochester, New York, Stati Uniti d'America)
PCR quantitativa (qPCR) campioni di DNA sono stati elaborati utilizzando qPCR di fornire una quantificazione più specifico e sensibile. I primer e le sonde sono stati progettati utilizzando il software libreria di Roche universale Probe (UPL) disegno saggio per amplificare la regione di sovrapposizione E6 e E7 sequenza genica di HPV16 (GenBank adesione n. K02718) e il gene housekeeping β-actina umana (GenBank adesione n. M10277) . Questi primer sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) e le sonde da Roche Applied Science (Indianapolis, Indiana, USA).
HPV16 E6 /E7 primer forward 5'-CAACTGATCTCTACTGTTATGAGCAA-3 ', HPV16 E6 /E7 primer reverse 5'-CCAGCTGGACCATCTATTTCA-3 ', HPV16 E6 /E7 idrolisi "Taqman" sonda 5' - (fam) -AGGAGGAG- (scuro quencher dye) -3 '(UPL sonda # 63) è stato utilizzato per amplificare il 73 coppia di basi (bp) regione tra la posizione 535 nucelotide (nt) e 607 posizione nt. HPV18 E7 primer forward 5'-GACTCAGAGGAAGGAAAACGATGAAA, HPV18 E7 inversione di primer 5'-GTGACGTTGTGGTTCGGCT; HPV18 E7 Sonda 5'-TGGAGTTAATCATCAACATTTACCA è stato utilizzato per amplificare la regione di 25 bp tra la posizione 715 e 739 nt. Umana β-actina primer forward 5'-GTGGGGTCCTGTGGTGTG-3 ', umano β-actina 5'-GAAGGGGACAGGCAGTGA-3', β-actina idrolisi "Taqman" umano sonda 5 '- (fam) -GGGAGCTG- (scuro quencher dye) - 3 '(UPL sonda # 24) amplificato regione 61 bp tra 2.642 posizione NT e 2702 la posizione nt.
il tempo reale miscela di reazione è stata preparata in un LightCycler® 480 Piastra pozzetti 96 contenente 1x LightCycler® 480 Sonde master (Roche Applied Sciences: Indianapolis, Indiana, USA), 1 um di ogni rispettivo set di primer (avanti e indietro), 0,2 micron di rispettiva sonda, e 2 l di modello del DNA; in un volume finale di reazione di 20 microlitri. Il mix sonde maestro contenute tampone di reazione, miscela dNTP (compresi dUTP al posto di dTTP), 3,2 mm MgCl 2, e Taq polimerasi
DNA. La PCR in tempo reale è stata eseguita su un sistema LightCycler 480 (Roche Applied Sciences: Indianapolis, Indiana, USA) con i seguenti parametri ciclo: pre-incubazione per l'attivazione dell'enzima iniziale a 95 ° C per 10 minuti, seguiti da 45 cicli di 95 ° C per 10 secondi (velocità di rampa 4.4 ° C /secondo), 60 ° C per 30 secondi (velocità di rampa 2.2 ° C /secondo) e 72 ° C per 1 secondo (rampa 4.4 ° C /secondo). Dopo fase di amplificazione, una fase di raffreddamento è stata effettuata a 40 ° C per 30 secondi (velocità di rampa di 2,2 ° C /secondo). Acquisizione del segnale di fluorescenza è stato eseguito utilizzando l'impostazione (465-510 nm) in seguito alla 72 ° C fase di estensione di ciascun ciclo Mono Idrolisi sonda. Tutti i campioni sono stati eseguiti in triplicato
Il CaSki (American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA). Linea di cellule di adenocarcinoma cervicale è stato utilizzato per sviluppare curve standard sia per la HPV16 (600 copie /genoma) e GAPDH (2 copie /genoma) geni. Il GH354 (American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA) linea di cellule di adenocarcinoma cervicale è stato utilizzato per sviluppare le curve standard per HPV18 (200 copie /genoma). DNA estratto dalle cellule CaSki e GH354 sono stati diluiti dieci volte a partire da 50 ng di 0,0005 ng [81] La quantificazione è stata ottenuta utilizzando ciclo soglia (C T) misurata con il secondo metodo massima derivata (LightCycler 480 Software versione 1.5.0.39; Roche Applied Sciences: Indianapolis, Indiana, USA). La saliva campioni & gt; 0.001 copie /genoma sono stati considerati HPV positivo. Analisi La specificità è stata eseguita su test qPCR contro HPV18 e risultato essere 100% specifico (dati non riportati)
valutazione statistica
sensibilità e la specificità sono stati calcolati come la percentuale di veri positivi e veri negativi (valore di taglio & gt;. 0,001 copie /genoma), rispettivamente. A seguito dell'acquisizione di campioni di saliva e dei risultati di screening HPV, informazioni demografiche dai campioni sono stati confrontati con il profilo demografico generale della popolazione locale utilizzando un test chi-quadrato (χ2), per determinare se qualsiasi caratteristica (genere, razza, età) è stato diverso da quello previsto tra i soggetti valutati in questo studio (n = 118). Un livello di probabilità di alfa (α) = 0,05 stata utilizzata per determinare la significatività statistica
Abbreviazioni
HPV:.
Papillomavirus umano
DNA:
L'acido desossiribonucleico
Stati Uniti: in United States
PCR:
reazione a catena della polimerasi
OPRS: Ufficio per la Protezione della ricerca umana Soggetti
CCSD:
Clark County Nevada - Distretto scolastico
< DFN> UNLV-SDM:
University of Nevada Las Vegas - School of Dental Medicine
RCF:
forza centrifuga relativa
PBS:
tampone fosfato salina
GAPDH:
Glyceraldehyde-3- fosfato deidrogenasi
qPCR:
reazione a catena della polimerasi quantitativa
BP:
coppia di basi
nt:
Nucleotide
dNTP:
deoxyribonucleotide trifosfato
dUTP:
2-desossiuridina trifosfato
dTTP:
deossitimidina trifosfato .
Dichiarazioni
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare la Scuola UNLV di Comunità Scienze della Salute e UNLV-SDM Dipartimento di Scienze Biomediche, Ufficio per la ricerca, e Education Program avanzata in Pediatric Odontoiatria per la fornitura dei materiali di consumo e reagenti per questo studio pilota iniziale.
autori fascicoli presentati originali per
di seguito sono riportati i link ai degli autori fascicoli presentati originali per immagini. 'file originale per la figura 1 12903_2012_246_MOESM2_ESM.pdf Autori 12903_2012_246_MOESM1_ESM.pdf autori file originale per la figura 2 interessi in competizione
Gli autori dichiarano di non avere interessi in competizione.
contributi degli autori
KK e CF concepiti, monitorati, e coordinato il disegno sperimentale. KH, EE, JA e AH erano responsabili per i soggetti di reclutamento, consenso informato, campioni di raccolta, e un po 'di analisi biomediche. CF, EE, JA, e AH effettuata l'estrazione del DNA, analisi PCR e qPCR. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.
