Abstract
sfondo
comunità microbiche che abitano bocca umana sono associati con la salute orale e le malattie. Precedenti studi hanno indicato la prevalenza generale di gengivite adulti in Cina ad essere elevato. Lo scopo di questo studio è stato quello di caratterizzare in profondità il microbiota orale degli adulti cinesi, con o senza gengiviti, definendo la diversità filogenetica e la comunità-struttura utilizzando pirosequenziamento altamente in parallelo microbica.
Metodi
sei non fumatori cinese, tre con e tre senza gengiviti (fascia di età 21-39 anni, 4 femmine e 2 maschi) sono stati arruolati nello studio attuale trasversale. parametri gengivali di infiammazione e sanguinamento al sondaggio sono stati caratterizzati da un medico utilizzando il gengivale Index Mazza (MGI). Placca (campionamento separato da quattro diversi siti orali) e salivari campioni sono stati ottenuti da ciascun soggetto. Successioni e abbondanza relativa dei batteri 16 S rDNA PCR amplificati sono stati determinati tramite pyrosequencing che ha prodotto 400 bp legge a lungo. I dati di sequenza sono stati analizzati tramite una pipeline di calcolo personalizzato per le analisi microbiome orale umano. Inoltre, le abbondanze relative di gruppi microbici selezionati sono stati convalidati usando PCR quantitativa.
Risultati
I microbiomes orali da soggetti gengiviti e sani potrebbero essere distinti in base alle diverse strutture comunitarie di microbiomes placca, ma non i microbiomes salivari. I contributi dei membri della comunità per la struttura della comunità divergenza sono stati statisticamente accedere al phylum, genere e livelli di specie simili. Otto taxa predominante sono stati trovati associati con gengiviti: TM7, Leptotrichia
, Selenomonas
, Streptococcus
, Veillonella
, Prevotella
, Lautropia
, e Haemophilus
. Inoltre, 98 specie a livello OTU sono stati identificati per essere gengiviti-associati, che ha fornito le caratteristiche microbiche di gengivite ad una risoluzione specie. Infine, per i due generi selezionato Streptococcus
e Fusobacterium
, Real-Time PCR quantificazione basata dell'abbondanza batterica relativa ha convalidato i risultati Pyrosequencing-based.
Conclusioni
Questo studio suggerisce che i metodi campioni orali di questa popolazione di pazienti di gengivite può essere caratterizzato tramite la placca microbiome da pirosequenziamento i 16 geni S rDNA. Ulteriori studi che caratterizzano i campioni di serie da soggetti (design studio longitudinale) con una dimensione della popolazione più grande può fornire una conoscenza delle caratteristiche temporali ed ecologiche delle comunità microbiche orali in stati clinicamente definiti di gengiviti.
Parole
microbiota orale gengivite saliva placca pyrosequencing elettronico materiale supplementare
La versione online di questo articolo (doi:. 10 1186 /1472-6831-11-33) contiene materiale supplementare, che è disponibile per gli utenti autorizzati
Shi Huang, Fang Yang. contribuito in maniera uguale a questo lavoro.
Sfondo
tecniche metagenomiche ha recentemente rivoluzionato la nostra comprensione della pletora di microbi che co-abitano il corpo umano, noti collettivamente come microbioma umano. I vari siti del corpo (ad esempio la pelle, il tratto gastrointestinale e vaginale e la cavità orale) ospitano comunità distinte di microbi che variano tra gli individui di accoglienza, così come tra le nicchie ecologiche all'interno di ogni parte del corpo [1]. Le interazioni tra i microbiota residente e tra il microbiota e l'ospite umano alla base della salute umana e della malattia. All'interno della cavità orale, della lingua, palato molle e dura, mucosa buccale, superfici sopragengivali e subgengivali dei denti e la saliva può rappresentare differenti nicchie ecologiche o habitat [2]. La composizione e la diversità di microbiota in questi habitat possono contribuire alla salute orale [3-6] e le malattie orali come carie, parodontite, gengiviti e [7, 8]
. La gengivite è l'infiammazione dei tessuti molli della gomma circonda i denti. Si ritiene che il risultato di l'accumulo di placca [9] e le interazioni tra conseguenti microbiota placca e tessuti dell'ospite [10, 11]. Questi tessuti diventano eritematose e sanguinano al sondaggio, ma nessuna migrazione apicale dell'epitelio giunzionale si verifica. Precedenti studi di placca gengivale hanno dimostrato che, come la gengivite si sviluppa, i costituenti microbici di spostamento della placca sottogengivale da una popolazione dominata da batteri Gram-positivi streptococchi a uno con livelli elevati di anaerobi Gram-negativi come Actinobacillus
, Capnocytophaga, Campylobacter, eichenella, Fusobactrium
e Prevotella
[2, 12, 13]. Tuttavia, questi studi sono stati basati su metodi di coltura-based e molecolari che colpiscono solo un numero limitato e parziale di microbi coltivabili, un pregiudizio che può essere superata da approcci metagenomiche. Durante l'ultimo decennio, high-throughput approcci sequenziamento basato su 16 ampliconi S rDNA sono stati utilizzati per rilevare la diversità di microbiota orale umana nella salute e nella malattia. In particolare, queste tecniche hanno rivelato la diversità microbica all'interno della fessura sano subgengivale supera di gran lunga al di là che è stato caratterizzato in precedenza. Kroes et al.
Notare che meno di un quarto (24%) di filotipi identificati con tecniche metagenomiche potrebbe essere recuperato dalla coltivazione e che quasi la metà dei filotipi sottogengivali identificati con una combinazione di tecniche molecolari e cultura-based non era stata caratterizzato precedenza [14]. In realtà, un altro studio ha stimato che nel cavo orale umana circa il 68% di tutti i taxa batterica erano ancora incolto [6].
Sebbene le tecniche molecolari sono stati utilizzati per confrontare le placche subgengivali in ospiti sani e quelli con patologie del cavo orale come la parodontite [ ,,,0],15], pochi studi hanno esaminato in profondità il microbiota orale associata a gengiviti. Ci sono diverse ragioni. In primo luogo
, la profondità e l'ampiezza di campionamento per microbiota orale sono stati insufficienti, in generale, ed i parametri ottimali non determinato per quella dei pazienti, in particolare, gengivite. In secondo luogo
, per quanto riguarda la scelta dei siti di campionamento gengivali la placca, non era ancora chiaro se o quale dei diversi siti sono clinicamente rilevanti (ad esempio, i denti denti anteriori e posteriori? Placca sopragengivale o placca subgengivale?). Tale ambiguità limita gravemente l'analisi dei dati significativi e confronti tra gli studi, e ritarda la traduzione dei risultati clinicamente. artefatti Terzo
, la maggior parte dei sondaggi microbici orali che elencati 16 sequenze S di PCR-amplificati hanno ignorato i potenziali PCR [16-19]; come risultato, un paesaggio completa e precisa organismal della maggior parte microbiomes orali, in particolare quelli relativi alle malattie, rimane sostanzialmente sfuggente. Tutti questi fattori hanno confuso la valutazione dei fattori microbici associati alla gengivite.
Impiegando pyrosequencing di 16 ampliconi S rDNA, questo articolo chiarito la struttura diversità e la popolazione del microbiota orale, campionato rispettivamente da cinque nicchie ecologiche orali da ciascuno dei tre adulti cinesi con gengiviti e tre senza la malattia. Microbiota della placca sopragengivale, la placca sotto-gengivale, e la saliva sono stati caratterizzati per verificare se e in che modo i microbiomes delle varie nicchie ecologiche orali distinguono host sani e quelli con gengiviti. Il nostro studio ha individuato una serie di organismi come potenziali biomarcatori di gengivite, e fornito spunti importanti per le strategie di campionamento e di analisi per svelare i fattori di rischio microbici gengivite associata a popolazioni umane.
Risultati
design Studio
I sei soggetti erano, gli adulti non fumatori sani in età che vanno da 21 a 39 anni (Tabella 1). assegnazione di gruppo è basata sulla frequenza di sanguinamento al sondaggio (BOP). Tre soggetti sono stati assegnati al gruppo in buona salute (H) sulla base di una frequenza BOP ≤5 e tre soggetti al gruppo malsano (gengiviti) (U) sulla base di una frequenza di BOP ≥ 20. Gruppo H composto da tre donne e del Gruppo U incluso due uomini e una donna. Bleeding indici dei singoli soggetti sono stati riportati nella Tabella 1 1.Table metadati per i sei soggetti campionati in questo studio.
Group
sano (H)
malsano (U)
Soggetto ID
1
2
3
4
5
6
Gender
F
F
F
F
M
M
Age
22
23
21
39
25
25
Smoking
N
N
N
N
N
N
Chronic disease
N
N
N
N
N
N
BOP
5
1
1
24
37
25
MGI
1.1250
1.0357
1.0179
2.1346
2.6071
1.9286
Abbreviazioni: BOP - sanguinamento al sondaggio; MGI - Mazza gengivali dataset indici
sequenza
Cinque campioni (ognuno da un sito diverso per via orale, vedi Metodi) da ciascun individuo sono stati raccolti e analizzati. Con codice a barre 16 S-rDNA ampliconi sequenziamento utilizzando 454 Titanium (durata media di lettura di 400 bp) produrre un totale di 494.988 cruda legge, risultando in un set di dati di 258.385 legge (dopo rigorose misure di valutazione e di controllo della qualità; Metodi). Il numero di letture per campione variava da 4.405 a quasi 13.562, con una media di 8.612 (Tabella 2) .table 2 Le stime di diversità di specie per i campioni.
Host ID
campione sito-specifica
ID campione
raw legge
letture analizzato
sequenza unica
Il buono di copertura
OTU al 3% la differenza
Ace
Chao 1
1
S
H1
18805
11580
3120
98.13%
687
902.15
944.54
A-sup
H2
18448
9764
2307
98.56%
464
603.62
634.17
|
A-sub
H3
15895
8035
2748
97.98%
597
740.87
775.64
|
P-sup
H4
13974
7467
2142
96.69%
684
966.39
925.12
|
P-sub
H5
14224
7730
2528
97.12%
702
932.10
923.01
2
S
H6
20982
11907
3264
98.35%
685
877.19
884.03
|
A-sup
H7
19416
10935
2415
98.99%
379
491.50
490.02
|
A-sub
H8
17295
9539
2060
98.66%
390
533.27
523.25
|
P-sup
H9
22178
10085
2653
97.98%
631
846.61
842.29
|
P-sub
H10
23105
10809
3160
98.06%
736
928.09
937.33
3
S
H11
19146
10970
3229
98.11%
612
847.56
878.51
|
A-sup
H12
12515
5476
1933
97.11%
515
672.34
680.37
|
A-sub
H13
13289
6581
1829
97.80%
466
608.60
631.71
|
P-sup
H14
13105
6615
1896
97.57%
494
657.40
661.27
|
P-sub
H15
12673
6456
1943
97.23%
539
728.34
757.23
4
S
U1
24258
13562
3929
98.50%
671
880.91
876.01
|
A-sup
U2
18719
9591
2190
98.20%
495
700.72
713.79
|
A-sub
U3
16282
7651
2636
97.56%
638
819.36
805.22
|
P-sup
U4
20539
10035
3045
98.33%
617
766.07
749.34
|
P-sub
U5
11515
5272
1963
96.47%
597
776.19
772.56
5
S
U6
20527
12890
3150
98.02%
722
1012.09
1001.18
|
A-sup
U7
14307
7813
2436
97.82%
589
746.85
748.61
|
A-sub
U8
14763
8078
2793
97.83%
621
785.67
781.26
|
P-sup
U9
14787
7268
2213
97.14%
589
818.53
828.20
|
P-sub
U10
16246
8916
2902
97.73%
656
858.40
934.10
6
S
U11
15739
8819
2569
97.74%
606
806.46
824.90
|
A-sup
U12
12849
5407
2013
96.10%
570
819.64
810.82
|
A-sub
U13
17990
8484
2844
97.15%
737
996.50
984.13
|
P-sup
U14
9112
4405
1330
95.87%
475
678.74
671.08
|
P-sub
U15
12305
6249
2189
96.13%
698
959.80
960.71
La ricchezza e la diversità di analisi sulla base di unità tassonomiche Operative
Clustering le sequenze uniche in unità tassonomiche operative (Otus) ad una distanza genetica 3% portato a 464 ~ 737 differenti "livelli specie" filotipi per microbiome (Tabella 2). Per tutte le comunità microbiche orali analizzati, il numero di OTU rilevata era molto vicino al numero totale di OTU stimato da Chao1 e ACE indicatori ricchezza. Il livello medio della copertura di Good era oltre il 97% in tutti i campioni, che indica che circa tre nuove filotipi ci si aspetterebbe per ogni 100 sequenza aggiuntiva legge. Questo livello di copertura ha suggerito che le 16 sequenze S rDNA identificati rappresentano la maggioranza dei membri batteriche presenti nei campioni di saliva e placca in questo studio. Le singole curve di rarefazione mostrato un modello simile di diversità crescente che non ha ancora raggiunto la saturazione (Figura 1). Il confronto tra le curve di rarefazione della salute (H) e gengiviti popolazioni (U) per i siti campionati di saliva e placca hanno mostrato che i due host-gruppi visualizzati simile ricchezza di batterica OTU a livello identità del 97%. Figura 1 Curve di rarefazione per H e U gruppi nei siti campionati di saliva e placca. Per entrambi microbiomes placca saliva, H e U Gruppi visualizzata simile diversità filogenetica a livello di identità il 97% (sulla base di un massimo di 4.000 sequenze per campione).
Confronti di strutture comunitarie
Per determinare se il microbiota dalla saliva e placca host sani distinti e quelli con gengiviti, analisi multivariata sono stati applicati per confrontare la struttura complessiva della microflora da ciascuna nicchia ecologica orale basato su FastUnifrac-derivato e matrici distanza thetaYC-based. FastUniFrac [20] permette di confronti a coppie delle distanze evolutive tra due comunità microbiche e misure somiglianze tra comunità-strutture microbiche. Nell'analisi PCOA, nell'ambito di un regime UniFrac ponderata, la segregazione tra H e U gruppi è stata osservata (p
& lt; 0,001) quando tutti i campioni o quando solo campioni di placca sono stati considerati, ma non quando solo campioni di saliva sono stati considerati (Figura 2A ). Inoltre, a prescindere dalla loro appartenenza host-gruppo, saliva microbiota formò un gruppo distinto dal microbiota placca (p = 0,034
) (Figura 2B, C). L'analisi PCOA thetaYC basata mostrato risultati coerenti (Figura 3A, B). Quando solo campioni di placca erano considerati, la separazione strutturale tra "H" e gruppi "U" era più discriminante (p = 0,001
) (Figura 3C) rispetto a quando tutti i campioni sono stati inclusi (p
= 0,005) (Figura 3A). Pertanto, gingivitis- e sani-gengivali-microbiomes possono essere distinte in base alle diverse strutture comunitarie di microbiomes placca, ma non i microbiomes salivari. Figura 2 confronti di strutture comunitarie batteriche come misurato da FastUniFrac. strutture comunitarie da H e U Gruppi (A) o dai diversi siti (B) sono stati interrogati utilizzando delle coordinate principali analisi (PCOA) e l'analisi di clustering della matrice ponderata distanza UniFrac. Ogni punto corrisponde ad una comunità microbica, con il colore che indica la sua categoria. Le percentuali di variazione spiegata dalle coordinate principali tracciati sono stati indicati sugli assi.
Figura 3 Analisi ThetaYC a base di strutture comunitarie batteriche. strutture comunitarie da H e U Gruppi (A) o dai diversi siti (B) sono stati interrogati utilizzando delle coordinate principali analisi (PCOA) della matrice delle distanze thetaYC. Ogni punto corrisponde ad una comunità microbica, con il colore che indica la sua categoria. Le percentuali di variazione spiegata dalle coordinate principali tracciati sono stati indicati sugli assi.
Caratterizzazione tassonomia basata su microbiota orale
phyla batterica e generi sono stati identificati e quantificati attraverso l'assegnazione tassonomica contro database di riferimento utilizzando MOTHUR, che rivelano la loro abbondanza relativa in tutta la placca e saliva microbiota (figura 4; solo phyla sono stati mostrati). Tutte le sequenze sono state trovate distribuito in 11 phyla batterica che includono sei phyla predominante comunemente incontrati nella cavità orale: Firmicutes, Proteobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria, Fusobatteri e TM7 [6, 21]. L'abbondanza relativa di tutti i phyla placca rilevata in ciascuno dei due gruppi host suggerito che le differenze significative per la maggior parte del phyla sono state trovate tra host con o senza gengiviti, tranne Firmicutes, Proteobacteria e spirochete (Figura 5). Tra coloro gengivite associata phyla, Actinobacteria e Bacteroidetes erano gengiviti-impoverito mentre i restanti cinque phyla erano gengivite arricchito (Figura 5). Figura 4 predominante filotipi in ciascun campione. Oltre il 90% della diversità in ogni campione è stato fornito dai sei phyla. Tuttavia, le variazioni sono stati trovati in loro abbondanza relativa. per le abbreviazioni vedere Metodi.
Figura 5 Il confronto dei profili tassonomici batteriche di H e U gruppi a livello di phylum sulla base di dati per via orale "core". L'abbondanza relativa di ogni taxon tra i gruppi H e U sono stati confrontati con Metastats (*: 0,01 & lt; p & lt;
0.05; **: p & lt;
0,01; media ± SEM)
A. totale di 70 generi sono stati identificati nel microbiota orali svolte dalle cinque siti campione (file aggiuntivo 1). Il più frequentemente rilevata taxa a livello di genere (i 12 più abbondanti generi che ciascuno rappresenta almeno il 2% del microbioma orale) erano Streptococcus, Neisseria
, Leptotrichia, Actinomyces, Prevotella
, Veillonella, Rothia, Fusobacterium
, Lautropia
, Selenomonas, Haemophilus, Granulicatella
.
Statisticamente, 26 generi sono stati trovati differenziale distribuito tra placche gengivite (Gruppo U) e placche sano-gum (Gruppo H) (Tabella 3). Cinque generi (Streptococcus, Veillonella, Prevotella
, Lautropia
e Haemophilus
) erano significativamente più abbondanti nel sano-gum microbiota placca rispetto a quelli di gengivite placca, mentre i restanti 21 sono stati trovati generi statisticamente meno abbondante .table 3 generi batterici differenziale distribuite tra H e U gruppi basati sul database orale "core".
Genera
H
U
Metastats p-value
Metastats q-valore
|
significare abbondanza (%)
std.err
significare abbondanza (%)
std.err
|
|
Streptococcus
22,47%
1,91%
14.32%
1,98%
0,010,989 mila
0,0043
Veillonella
8,62%
1,90%
2,33%
0,77%
0,002,997 mila
0,0016
Prevotella
6,07%
1,75%
1,27%
0,44%
0.004995
0,0023
Lautropia
5,67%
2,00%
1,33%
0.31 %
0.013986
0,0051
Haemophilus
4,15%
1,39%
0,58%
0,21%
0,000,999 mila
0,0008
Leptotrichia
4.12%
0.91%
12.48%
2.44%
0.002997
0.001644
Selenomonas
1.73%
0.36%
6.71%
1.70%
0.002997
0.001644
Uncultured_Lachnospiraceae*
1.00%
0.27%
1.97%
0.25%
0.015984
0.0056366
Eubacterium
0.34%
0.08%
1.89%
0.34%
0.000999
0.000822
Cardiobacterium
0.60%
0.17%
1.19%
0.22%
0.038961
0.011658
Peptostreptococcus
0.19%
0.10%
1.42%
0.46%
0.002997
0.001644
Tannerella
0.20%
0.05%
1.36%
0.49%
0.000999
0.000822
Catonella
0.36%
0.10%
1.06%
0.25%
0.006993
0.003139
Synergistes
0.07%
0.03%
1.22%
0.49%
0.001998
0.001409
Filifactor
0.05%
0.04%
0.96%
0.28%
0.000999
0.000822
Peptococcus
0.12%
0.04%
0.49%
0.11%
0.004995
0.002349
Solobacterium
0.11%
0.03%
0.46%
0.22%
0.048951
0.01381
SR1
0.11%
0.04%
0.42%
0.08%
0.000999
0.000822
Syntrophomonas
0.00%
0.00%
0.17%
0.07%
0.000999
0.000822
Johnsonella
0.01%
0.01%
0.14%
0.05%
0.000999
0.000822
Choroflexus
0.01%
0.01%
0.12%
0.07%
0.030969
0.010172
Olsenella
0.01%
0.00%
0.05%
0.02%
0.041958
0.012185
Propionivibrio
0.00%
0.00%
0.05%
0.02%
0.032967
0.010172
Peptoniphilus
0.00%
0.00%
0.04%
0.02%
0.000999
0.000822
Desulfomicrobium
0.00%
0.00%
0.02%
0.01%
0.000999
0.000822
Pseudoramibacter
0.00%
0.00%
0.02%
0.01%
0.000999
0.000822
A livello di genere, abbiamo identificato 26 taxa gengivite associata nella placca microbiota, che comprendeva cinque taxa gengivite-impoverito (grassetto) e 21 taxa gengiviti arricchito (senza grassetto); *, Non un genere ben definito.
OTU livello confronti della microflora orale
Come suddetti confronti sulla relativa abbondanza dei taxa microbica sono stati ottenuti da solo chi legge con valore di fiducia sopra 0.8 (Metodi), essenzialmente tutto chi legge senza alcuna assegnazione filogenetici affidabili (0,33 ~ 27.86% del totale si legge in ogni campione) erano stati mascherati. Pertanto, abbiamo ulteriormente confrontato, tra i due host-gruppi, la relativa abbondanza di tutte le specie a livello OTU in microbiota targa, indipendentemente dai loro incarichi di identità filogenetici. In totale, 98 OTU (rappresentato il 5,38% di tutti i otus) sono stati trovati differenziale distribuito alla soglia di significatività di 0,05 (entrambi p
-value e q
-value di Metastats) non solo ciascuno dei quattro placca siti, ma in tutti i siti placca. È interessante notare che, tra i 98 OTU, 36 di loro erano gengiviti-impoverito e il restante 62 erano gengivite arricchito (file supplementare 2). Consenso tassonomia del OTU è stato interrogato da MOTHUR sulla base orale "core" 16 S rDNA Gene Database (Metodi). Ventiquattro dei 36 gengiviti-esauriscono OTU mentre 57 fuori dalla OTU 62 gengiviti arricchito sono stati sostenuti dai risultati basati tassonomia-assegnazione. Così risultati dei due metodi sono ampiamente coerenti. Questi gengiviti-impoverito o gengiviti arricchita OTU rappresentare una nuova serie di potenziali marcatori organismal per la valutazione e la prognosi di gengivite, anche se la loro validità e importanza ancora essere ulteriormente testato in popolazioni umane più grandi.
Correlazione di quantificazioni microbiche tra pyrosequencing e quantitativa PCR (qPCR)
le abbondanze, in copie del gene per ng di DNA, di due generi (Streptococcus
e Fusobacterium
) in tutti i campioni di placca e di saliva sono stati determinati con qPCR. L'abbondanza relativa di questi due generi come determinato dalla pyrosequencing ha mostrato una correlazione positiva per le copie del gene qPCR basati per ng di DNA (Streptococcus
: r
= 0.554; p
& lt; 0,002; Fusobacterium
:. r
= 0,813; p
& lt; 0,001) (file aggiuntivo 3)
Discussione
Questo studio impiegato pyrosequencing altamente in parallelo di 16 S rDNA per valutare e confrontare la struttura diversità e la popolazione di microbiota associato con gengiviti negli adulti cinesi. La diversità microbica in placca e saliva stimato nel nostro studio, 464 ~ 737 OTU (97% di identità cutoff) in ciascun campione, era simile a quello riportato da Zaura et al (saliva, [5]). Lo studio Zaura impiegato una strategia rigorosa e conservatrice lettura rifilatura, dove solo chi legge presenti almeno cinque volte in un campione sono state prese in analisi. Nella nostra analisi, basata qualità rigorosi lettura-trimming suggerito da MOTHUR è stata eseguita, richiedendo il punteggio di qualità media di oltre il 35 in una finestra mobile di 50 bp lungo tutta la lettura (Metodi). Questo criterio di selezione conservatrice. Http: //www. Mothur org /wiki /ha ridotto significativamente il numero di OTU dalle stime sulla base di criteri di lettura-trimming alternativi come la richiesta media punteggio di qualità di base & gt; 25 (dati non mostrati). Così potenziali artefatti di sequenziamento potrebbero gonfiare la diversità batterica osservato. Inoltre, la copertura stimata di Good ha mostrato che la maggior parte delle filotipi batteriche (& gt; 97%) nella saliva e la placca di questi host sana e gengivite era già stata rilevata in questo studio. Lo stimatore ricchezza di ACE e Chao1 anche suggerito che la maggior parte dei filotipi (& gt; 97%) erano già rappresentati dalle sequenze nel nostro studio
Il nostro studio in primo luogo lo scopo di valutare se le comunità di popolazioni ospitanti sana e gengivite associata differiscono. in qualsiasi sito specifico (s) della cavità orale. Sia l'analisi FastUnifrac-based e basata su thetaYC ha dimostrato che campioni di saliva e placca rappresentati microbiomes distinti nella cavità orale. Indipendentemente dallo stato di malattia, microbioti salivari cluster distintamente dal microbiota placca, in ciascuna delle due matrici distanza testati. Questo probabilmente riflette le diverse condizioni ambientali che caratterizzano le due habitat. microbiota placca risiedono nel biofilm sulla superficie del dente smalto e sono influenzati da composizione della dieta, pratiche di igiene orale [22], le interazioni microbiche all'interno del biofilm [8] e le interazioni tra i microbi e ospitare cellule epiteliali [10, 11, 23]. Al contrario, l'habitat salivare stato plasmato da flusso di cibo, microflora transitoria, mucine, essudato sieroso, sloughed cellule epiteliali, ecc [3, 4, 24, 25]. È interessante notare che un sondaggio di diversità globale del microbioma salivare umana in dieci persone provenienti da ciascuno dei dodici posizioni geografiche in tutto il mondo (compresa la Cina) ha riportato una elevata diversità all'interno e tra gli individui di accoglienza ma poca struttura geografica delle microbiomes saliva [26].
In secondo luogo, sono stati identificati i membri delle comunità batteriche. Inoltre, sono stati valutati i loro contributi alla separazione strutturale della placca microbiota tra le due popolazioni ospitanti. Quando microbiota placca sono stati considerati a livello di phylum, Fusobatteri e TM7, due dei phyla predominante, sono stati più abbondanti in microbiota associato con gengiviti, mentre Actinobacteria e Bacteroidetes erano meno abbondanti in microbiomes gengivite associata. A livello di genere, diversi generi quali Leptotrichia
e Selenomonas
erano più abbondanti nella gengivite placca (21 tali generi in totale; tabella 3), mentre solo cinque generi, Streptococcus
, Veillonella
, Prevotella
, Lautropia
e Haemophilus
, erano meno abbondanti. A livello di specie, filogenesi assegnazione paragone indipendente di abbondanze relative di OTU tra i sani e gengiviti padroni di casa è stata effettuata non solo per ciascuno dei quattro siti di placca, ma anche tutti i depositi di placca. In linea con le conclusioni di cui sopra, 98 gengiviti-associato (sia gengiviti-arricchito e gengiviti-impoverito) OTU sono stati individuato e trovato distribuito in tutti i siti campionati di placca. Inoltre, 58 OTU affiliati ai generi di Leptotrichia
(16), Selenomonas
(12), Streptococcus
(7), Veillonella
(6), Prevotella
(6), Lautropia
(2), Haemophilus
(3) e la divisione candidato TM7 (6) sono stati trovati per essere associato con gengiviti.
in particolare, diversi membri di questi taxa gengivite associata erano noti per svolgere un ruolo nella sia per la salute orale e le malattie. Il genere Leptotrichia
gengiviti arricchita, del phylum Fusobatteri e la famiglia Fusobacteriaceae, erano Gram-negativi non sporigeni di formazione, anaerobico, aste saccarolitici. Erano tra il microbiota normale nella cavità orale sana [27] e l'intestino [28]. Leptotrichia buccalis
è stato trovato in alta prevalenza in uno studio del gengivale di pazienti cinesi con gengiviti e gengivite necrotizzante ulcerativa [29]. In un modello di gengivite indotta sperimentalmente, i bambini ospitavano tre volte maggiore proporzione di Leptotrichia
specie e 2,3 volte maggiore proporzione di Selenomonas
specie nella placca subgengivale rispetto agli adulti trattati allo stesso modo [30]. Allo stesso modo, Selenomonas
specie sono Gram-negativi anaerobi normalmente presenti nella flora buccale e associati gengiviti [31, 32] e parodontite [33, 34]. TM7 è un phylum batterica importante di oltre 200 filotipi senza rappresentanti coltivati [35-37] e si trovano in diversi habitat ambientali (come il suolo, di acqua dolce, mare profondo e bocche idrotermali). I membri della divisione TM7 candidato sono stati recentemente rilevati in vari siti del corpo umano [6, 38-40], e associato alla patogenesi di diverse malattie infiammatorie (parodontite [41], vaginosi [42] e le malattie infiammatorie croniche intestinali [43]) . Il I025 sottogruppo è stato trovato nella placca sotto-gengivale in primo luogo a siti malati in ospiti parodontite, suggerendo il loro possibile ruolo nel processo multifattoriale che porta alla parodontite [41, 44].
D'altra parte, solo cinque generi gengiviti impoverito sono stati rilevati nel l'attuale studio. Streptococcus
è uno dei generi più predominante nella cavità orale umana. Tuttavia, il "streptococchi orali" sono un gruppo fortemente eterogeneo geneticamente [45]. Anche se la maggior parte sono patogeni opportunisti e sono stati collegati con una varietà di malattie orali [46-48], essi sono anche considerati commensali. Simile ai nostri risultati, Streptococcus sanguinis
, così come Lautropia mirabilis
e Haemophilus Parainfluenzae
, sono stati recentemente associati con la salute orale [34, 47]. Il genere Veillonella
rappresenta un gruppo di piccoli, di solito non-fermentativa, rigorosa anaerobica, cocchi Gram-negativi. Si trovano nella cavità orale umana, il tratto respiratorio superiore, intestino tenue e vagina. In un sondaggio di placca sottogengivale da 22 soggetti, la maggior parte del sottogengivale Veillonella
isolati sono stati identificati come veillonella parvula
[49]. Prevotella
specie sono parte del normale microbiota orale umana e sono spesso isolati da infezioni orali come la parodontite, carie dentale e ascessi [15, 50, 51]. Black-pigmentazione membri del Prevotella
sono stati associati con malattie orali. Coerentemente, in questo studio, la maggior parte Prevotella
OTU rilevato negli ospiti sani apparteneva a non-pigmentazione le specie ad eccezione Prevotella tannerae
. Al termine della convalida nelle indagini più grandi, questi generi gengiviti-associati, inclusi sia quelli gengiviti-arricchito e impoverito, possono rappresentare biomarcatori preziosi per la gengivite.
Tecniche Pyrosequencing, come quello impiegato in questo studio, ha rivelato grande diversità filogenetica e la variabilità di comunità batteriche dell'ecosistema orale umana [20, 52]. Caratterizzazione e quantificazione dei componenti della comunità permesso distinzioni nella struttura della comunità tra gli stati sani e malati da esplorare per i biomarcatori di malattia e terapia specifica-microbo-mirato. A nostra conoscenza, questa è la prima indagine organismal del microbiota gengivite associata con tecniche di sequenziamento profondo. I nostri risultati preliminari formulano le basi per ulteriori studi che presentano un design longitudinale e comprendono un maggior numero di soggetti. miglioramenti tecnici in corso sulla amplificazione filogenetico-marcatore (come quelli mira pregiudizi DNA-estrazione, la sequenza chimerismo causati da PCR, di distorsione della PCR, errori di sequenziamento, disuguale amplificazione dei membri della comunità e le variazioni in genere sconosciuti nei numeri rDNA-gene copia tra diversi residenti [16-19, 53]) e la crescente copertura delle 16 banche dati di riferimento S rDNA orali [54] dovrebbero consentire la dissezione di fattori microbici gengivite associata a ancora più elevata sensibilità e risoluzione.
Conclusioni
Questo studio ha rivelato che, in primo luogo, microbiota dai quattro punti di campionamento per la placca (placca sopragengivale e placca sottogengivale da denti anteriori; placca sopragengivale e placca sottogengivale da denti posteriori; Metodi) erano simili tra loro, ma erano distinguibili da microbiota salivare. In secondo luogo, strutture comunitarie di placca microbiota, ma non saliva microbiota, possono essere utilizzati per distinguere la gengivite. Così placca dovrebbe servire come sito di campionamento di scelta nel fornire una prospettiva microbica per la malattia. In terzo luogo, un certo numero di organismi sono stati identificati come la gengivite associata (con diverse bassa abbondanza generi specifici gengivite rilevati; Tabella 3), che possono servire come potenziali biomarcatori. Questi risultati hanno importanti implicazioni nelle strategie di campionamento e di analisi per il rilievo dei fattori di rischio microbico gengivite associata. I nostri risultati ora consentono ulteriori studi che esaminano lo sviluppo temporale e l'epidemiologia dei fattori di rischio microbici dietro gengiviti. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.
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