Abstract
sfondo
West Virginia ha il peggior salute orale negli Stati Uniti, ma le ragioni di questo non sono chiare . Questo studio pilota ha esplorato l'eziologia di questa disparità con analisi di coltura-indipendente per identificare le specie batteriche associate alla malattia per via orale.
Metodi
batteri in campioni di placca subgengivale da dodici partecipanti in due West Virginia studi dentistici legati indipendenti sono stati caratterizzati mediante 16S rRNA gene sequenziamento e l'analisi umana orale Microbe Identificazione microarray (HOMIM). analisi Unifrac è stato utilizzato per caratterizzare le differenze filogenetiche tra le comunità batteriche ottenuti dalla targa dei partecipanti con malattia orale bassa o alta, che è stato ulteriormente valutate clustering e Principal coordinate analisi.
Risultati
statisticamente differente firme batteriche (P
& lt; 0,001) sono stati identificati nella placca sottogengivale di individui con malattia orale bassa o alta in West Virginia a base di 16S rRNA sequenziamento del gene. Basso malattia conteneva un'elevata frequenza di Veillonella
e Streptococcus
, con un numero moderato di Capnocytophaga
. Alta malattia esibivano sostanzialmente aumentato diversità batterica e comprendeva una grande percentuale di batteri Clostridiales a grappolo (Selenomonas
, Eubacterium, dialister
). alberi filogenetici costruiti utilizzando 16S rRNA gene sequenziamento ha rivelato che sono state ripetute Clostridiales colonizzatori della placca associata ad alta malattie orali, fornire la prova che l'ambiente orale è in qualche modo influenza la firma batterica legata alla malattia.
Conclusioni
analisi Cultura-indipendenti identificati una firma batterica atipica associata ad alta patologie orali a West Virginia e dimostrato che l'ambiente orale ha influenzato questa firma. Entrambi i risultati forniscono informazioni l'eziologia della disparità orale in West Virginia
materiale supplementare elettronica
La versione online di questo articolo. (Doi:. 10 1186 /1472-6831-11-7) contiene materiale supplementare , che è disponibile per gli utenti autorizzati.
Sfondo
West Virginia ha la peggiore salute orale nella nazione, con quasi il doppio della media nazionale (48,2%) degli adulti di età compresa tra 65 o più aver estratto tutti i loro denti naturali [1 ]. Queste statistiche diventano più allarmante sapere che le infezioni del cavo orale sono stati associati con malattie croniche, come il diabete, malattie cardiovascolari e aterosclerosi [2-4]. Né l'origine della cattiva salute orale in West Virginia, né il suo rapporto con la malattia sistemica è capito. Al centro di questo problema è la determinazione delle popolazioni microbiche responsabili di infezioni orali. Storicamente questo è stato difficile a causa della complessità del microbiome entro biofilm orali, e le difficoltà di coltivare batteri ottenuti dall'ambiente orale.
Biofilm possono svolgere sia un ruolo protettivo (probiotico) o patogeno in salute orale a seconda della loro composizione microbica . biofilm orali sono iniziati dalla colonizzazione dei probiotici cocchi Gram-positivi, soprattutto streptococchi, aderente alla superficie del dente, insieme a coaggregating Actinomyces
e Veillonella
[5]. Coaggregation è una proprietà comune nello sviluppo della placca e batteri che colonizzano precoce sono colmato attraverso batteri, come fusobatteri, al fine colonizzatori. La successione ecologica delle popolazioni microbiche di colonizzare primi cocchi Gram-positivi al fine di colonizzazione anaerobi Gram-negativi di diversi morfotipi porta ad un cambiamento nella composizione di biofilm che si correla con la comparsa di gengivite e parodontite [6]. organismi specifici sono stati collegati con le malattie orali. La carie dentale si verifica a causa di un cambiamento nella comunità biofilm verso batteri acidogeni e acido-tolleranti, in particolare Streptococcus mutans
e lactobacilli [7]. In placca sotto-gengivale, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsizia
e actinomycetemcomitans Aggregatibacter
sono stati fortemente associati con la malattia parodontale [8, 9]. Fino a poco tempo, le associazioni di microbi con malattie orali sono state basate sulla coltivazione in vitro. Come è ormai riconosciuto che solo circa il 60% delle specie di biofilm orali sono coltivabili [10], l'uso di analisi della cultura indipendente ha portato a un nuovo livello di comprensione dei microbi associati orali [11].
Analisi molecolare della microflora parodontale non era stato utilizzato in precedenza per esaminare il profilo di batteri della placca sottogengivale conto di West Virginia. L'obiettivo di questo studio è stato quello di usare 16S rRNA gene analisi al fine di conoscere l'eziologia della disparità salute orale osservato in questa popolazione. In questo studio preliminare siamo stati in grado di identificare in modo significativo diverse 16S rRNA firme filogenetici batteri nella placca da individui che hanno patologie orali alta o bassa, e la firma di alta malattia è stata evidente in due popolazioni indipendenti, che si estendono su una vasta gamma di gruppi di età. Nel complesso abbiamo trovato che le comunità ricche di Veillonella
e streptococchi spostato alle comunità ricche di Selenomonas
e altri Clostridiales in associazione con un declino della salute orale, potenzialmente collegando una firma batterica atipica con la malattia per via orale a West Virginia. La constatazione che una firma batterica atipico può essere collegato a disparità di salute orale osservati in West Virginia mette in evidenza la necessità di ulteriori analisi di specie batteriche associate alla malattia per via orale ad alta e bassa in questa popolazione, al fine di capire l'origine di questa disparità.
metodi
Oggetto popolazioni
campioni di placca sottogengivale utilizzati in questo studio sono stati ottenuti in collaborazione con due progetti di ricerca condotti in West Virginia. La placca da un'età 23-48 popolazione è stata ottenuta attraverso il Centro per la ricerca di salute orale in Appalachia (studio COHRA), una partnership tra West Virginia University e Università di Pittsburgh l'esame genetico, epidemiologiche, microbiologiche e fattori comportamentali che contribuiscono alla salute orale. La placca da una popolazione più anziana è stata ottenuta attraverso gli orali disparità di salute tra gli anziani con e senza Cognitive Impairment (studio Cognitive), eseguito in collaborazione con la West Virginia University School of Dentistry e il Centro on Aging. Abbiamo scelto di includere soggetti da due vasche indipendenti West Virginia popolazione (età media 23-48 o età & gt; 70) nel nostro studio per contribuire a prolungare una comprensione della rilevanza dei nostri risultati di un ampio campione della popolazione occidentale Virginian. Finanziato come progetto pilota, relativamente pochi soggetti di ciascun gruppo sono stati in grado di analizzare. Tutte le procedure sono state eseguite utilizzando Institutional Review Board ha approvato i protocolli.
Oggetto valutazioni
criteri per la valutazione della salute orale, i metodi di raccolta placca da parte dei partecipanti, e la calibrazione dei ricercatori del progetto COHRA sono stati precedentemente descritti [12]. Il nostro studio ha esaminato la placca subgengivale da sette partecipanti COHRA, che è stato ottenuto da quattro primi molari (# 3, 14, 19 e 30). Questi stessi siti sono stati valutati per la profondità di sondaggio (PD), recessione e sanguinamento al sondaggio (BOP), come riassunto nella tabella 1. valutazione della carie si è basata sulle superfici dei denti coronali, ed i denti sono stati classificati come suono, decaduto, pieno o mancante. Percentuale denti sani per ogni partecipante è riportato nella Tabella 1. Lo status orale di soggetti di studio COHRA è stato determinato sulla base di esami parodontali (delimitata da linee tratteggiate in tabella 1): malattia a basso definita come & lt; 3,5 millimetri PD, 0-25% BOP siti; alta malattia definita come & gt; PD 4.5 mm, 100% siti BOP. placca sottogengivale stato campionato utilizzando una curette, sospesa in 100-500 microlitri TE (10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA) contenente 20% glicerolo e conservato a -70 ° C fino al trattamento. campioni multipli da singoli partecipanti sono stati raggruppati per valutazioni cliniche di studio analyses.Table 1 COHRA
codice paziente
DB
DC
DF
DL
DG
DI
DA
Età
30 y
23 y
32 y
32 y
48 y
40 y
35 y
Sex
F
F
M
F
M
M
F
Race
White
Afr/Am
White
White
Mixed
White
White
Smoker
No
No
Sometimes
No
Yes
Yes
Sometimes
Parodontale 1
|
|
|
|
|
|
(misurato 4 siti: 3,14,19,30)
|
|
|
|
|
|
|
profondità di sondaggio (media mm /sito)
& lt; 3.5
& lt; 3.5
4,5
4,5
5.2
5.2
5.2
recessione (% positive/site)
0
0
0
25
0
75
100
Bleeding al sondaggio (% di sites)
25
0
100
100
100
100
100
Gingivitis - localized
0
0
0
0
0
0
0
generalized
0
Yes
Yes
0
0
0
0
hyperplasia
0
0
0
Yes
Yes
Yes
Yes
Carie
|
|
|
|
|
|
| <
br> Protesi (inferiore /superiore)
0
0
0
0
0
0
0
suono denti (% di 28 denti)
64,3
78,6
92,9
53,6
78,6
67,9
50
1 le linee tratteggiate delimitano parametri clinici utilizzati per determinare lo stato orale dei partecipanti allo studio COHRA.
partecipanti allo studio cognitivi sono stati selezionati sulla base di: 1) età di 70 anni e più, 2) residente in West Virginia, 3) comunità di vita, e 4) dentato (che abbia almeno quattro denti naturali). valutazioni orali sono stati eseguiti dai ricercatori calibrato utilizzando linee guida e protocolli del National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES IV) [13]. campioni di placca subgengivali sono stati raccolti utilizzando curettes parodontali sterili da sei siti nel modo seguente: la superficie vestibolare del molare più anteriore in ogni quadrante, e la superficie vestibolare della # 11 e # 31. campioni di placca sono stati conservati e sommati per le analisi di cui sopra. Criteri di valutazione parodontale nello studio Cognitive inclusi PD, gengiviti e tartaro. valutazione carie incluso tipo di protesi e suono per cento, mancanti, denti cariati, riempiti o coronati. Entrambe le valutazioni sono riportati nella Tabella 2. La condizione orale di soggetti di studio cognitive è stato determinato sulla base di carie esami (delimitata da linee tratteggiate nella Tabella 2): bassa malattie definite come & gt;% suono 60 /denti pieni presente; alta malattia definita come & gt; il 40% dei denti mancanti o decayed.Table 2 studio cognitivo valutazioni cliniche
Paziente code
DT
DQ
DV
DAA
DZ
Age
74
93
77
91 y
77 y
Sex
F
F
M
F
F
Race
Afr/Am
White
White
White
White
Smoker
No
No
No
Yes
No
Parodontale
|
|
|
|
|
(numero di denti sondato)
22
26
22
ND1
10
profondità di sondaggio (media
|
|
|
|
|
mm /sito)
3.01 ± 0.53
1.98 ± 0.71
2.45 ± 0.55
ND
1,66 ± 0,41
gengivite (% siti positivi)
68,2
4,5
9.1
ND
80
Calcolo (% siti positivi)
0
0
4,5
ND
30
carie
|
|
|
|
|
Protesi (inferiore)
0
parziale
0
0
0
Protesi (superiore)
0
0
parziale
parziale
completa
indice Tooth (% di 32 denti)
|
|
|
|
|
Sound
59.4
31.3
40.6
37.2
21.9
Missing
31.3
15.6
31.3
40.6
65.6
Filled
6.25
40.6
18.8
15.6
9.4
Decayed
3.1
0
0
6.3
3.1
Crown
0
12.5
9.4
0
0
1no dati degli esami parodontali è stata acquisita per DAA.
Linee 2Dashed confine parametri clinici utilizzati per determinare lo stato orale dei partecipanti allo studio cognitive.
Estrazione del DNA e 16S rRNA analisi della sequenza del gene
DNA è stato estratto e purificato dalla placca subgengivale utilizzando il kit di isolamento del DNA del suolo UltraClean (MO Bio Labs, Carlsbad, CA). Il gene 16S rRNA PCR è stato amplificato utilizzando i primer 16S batteriche universali rRNA (in avanti, 5'-GAGTTTGATYMTGGCTCAG, invertire, 5'-GAAGGAGGTGWTCCADCC [14]). Ogni reazione di PCR conteneva 1 ml DNA purificato, 0,4 micron universali in avanti e reverse primer, 5 ml 10 volte platino tampone PCR, 1,5 mm MgSO 4, 0,2 mm dNTP e 0,5 ml Platinum Taq DNA polimerasi High Fidelity (Invitrogen, Life Technologies Corp , Carlsbad, CA). Le condizioni di PCR erano: 94 ° C per 4 minuti, seguito da 30 cicli di 94 ° C per 45 secondi, 60 ° C per 45 secondi e 72 ° C per 90 secondi, con una estensione finale a 72 ° C per 15 minuti. I prodotti di PCR sono stati analizzati dello 0,8% elettroforesi su gel di agarosio, e reazioni ottenendo prodotti di ~ 1500 bp sono stati clonati utilizzando la clonazione Kit TOPO TA per il sequenziamento (Invitrogen). prodotti legatura sono stati elettroporate in Escherichia coli
(TOP10 cellule chimicamente competenti, Invitrogen), e trasformanti sono stati incubati in media 250 microlitri SOC (2% triptone, 0,5% estratto di lievito, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl < sub> 2, 10 mM MgSO 4, 20 mM glucosio) per 1 ora a 37 ° C, prima placcatura su LB agar contenente 50 ug /ml kanamicina e una sovrapposizione di 25 ml di 2% X-gal. Dopo incubazione per una notte, ~ 100 colonie contenenti inserti (colonie bianche) sono stati isolati da ciascun campione e coltivate a 37 ° C per una notte in piastre da 96 pozzetti contenenti brodo LB con 50 ug /ml kanamicina. Un volume 2 ml di coltura batterica da ogni pozzetto è stato amplificato mediante PCR usando primer M13 (in avanti, 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT, reverse 5'-CAGGAAACAGCTATGAC). Reazioni contenevano 0,2 micron di ciascun primer, 5 ml 10X Qiagen PCR tampone (Qiagen, Valencia, CA), 0,2 mm e 0,2 ml dNTP Taq DNA polimerasi (Qiagen). Le condizioni di PCR erano: 94 ° C per 4 minuti, seguito da 30 cicli di 94 ° C per 45 secondi, 52 ° C per 45 secondi e 72 ° C per 90 secondi, con una estensione finale a 72 ° C per 15 minuti. I prodotti di PCR da ogni pozzetto sono stati esaminati mediante elettroforesi, e prodotti di dimensioni adeguate sono stati sequenziati da una struttura commerciale (SeqWright, Houston, TX). Analisi 16S rRNA sequenza del gene
Ogni sequenza di DNA è stato sottoposto a scansione per un singolo segmento della sequenza di innesco originale (ATCAAACT) tra BP 440 e 520 per identificare il gene 16S rRNA e per aiutare escludere chimere. La parte iniziale di ogni sequenza contenente basi non richiamati (N) è stato rimosso, la parte distale (sequenza vettoriale) è stato tagliato al fondo, e la sequenza è stata invertita all'orientamento standard. sequenze nucleotidiche ottenuti da questo studio sono stati depositati in GenBank, numeri di accesso HQ894465 -. HQ895588
sequenze sono stati classificati per analisi BLASTN sia contro un database locale e il (n) del database GenBank non ridondante. Il database locale è stato assemblato in un processo interative: se una nuova sequenza sperimentale non corrisponde con & gt; 98% di identità, un nuovo database è stato assemblato l'aggiunta di sequenze tipo di corrispondenza ottenuti dalla GenBank e il progetto ribosomiale Database (RDP) [15]. L'attuale database locale contiene 375 sequenze organizzati in 122 "gruppi". Ogni gruppo contiene sequenze strettamente correlate ed è stato convalidato per essere non sovrapposte mediante analisi BLAST dei singoli gruppi contro l'intero database. Questo approccio ha fornito un livello di dettaglio che è stata istruttiva per classificare le sequenze batteriche. Software utilizzato in sequenza analisi: 1) BLAST, utilizzando il server NCBI [16], con risultati formattati come XML; 2) UniFrac, utilizzando il suo server [17, 18]; 3) la costruzione dell'albero filogenetico, utilizzando il server RDP; 4) BLAST locale, utilizzando il 'patrimonio' blastall eseguibile dal NCBI [19]. Altro corsa software incluso a livello locale: il pacchetto per la costruzione e tramando alberi filogenetici e tracciando il Principal coordinate Analysis (PCOA) R [20] e l'analisi di Phylogenetics ed Evoluzione (APE); ClustalW2 [21] e muscolare [22] per l'allineamento di sequenze multiple; e Python [23] per automatizzare passi in analisi e produrre le mappe di calore (generato utilizzando matplotlib).
umana orale Microbe Identificazione microarray (HOMIM) analisi
Per l'analisi HOMIM 16S rRNA gene microarray, DNA purificato da campioni di placca subgengivale è stata inviato al Fondo HOMIM Nucleo presso il Forsyth Institute (Boston, MA). Questa funzione offre un'elevata analisi throughput ~ 300 della specie batterica orale più diffusi e fornisce un rapporto completo di profili batteriche all'interno dei campioni di DNA [24]
. Risultati e discussione
Identificazione di popolazioni batteriche in placca sottogengivale che differenziano gli individui con la malattia per via orale alto o basso in West Virginia
precedenti studi trovato specie batteriche nel 'complesso rosso' essere fortemente legata alla malattia parodontale [25]. Per esaminare se questi stessi batteri sono stati associati con la malattia orale in West Virginia, abbiamo usato 16S rRNA sequenziamento del gene per caratterizzare batteri della placca sottogengivale dei partecipanti COHRA diagnosticati come aventi malattia orale basso o alto in base a esami parodontali (Tabella 1, delimitata da linee tratteggiate ). Le analisi sono state eseguite in formato piastra a 96 pozzetti, e causa del costo relativamente elevato di sequenziamento del DNA, il nostro obiettivo pratico è stato quello di sequenziare 96 cloni per campione, rendendosi conto che non saremmo in grado di rilevare i tipi di batteri presenti a bassa frequenza. In realtà il numero di cloni sequenziati per campione variava da 55 a 133, con numeri bassi relativi alla difficoltà di ottenimento di sequenze ad alta qualità alcuni campioni. Le sequenze ottenute sono state analizzate dal BLAST nel database GenBank, che include tutte le note batteriche 16S rRNA sequenze geniche, e contro un database locale che ha facilitato la classificazione di 'tipi' di batteri sulla base di ≥95% di identità di sequenza. successiva valutazione dei dati di sequenza utilizzando il database umano Microbiome orale (HOMD) del server BLAST [26] ha dato risultati quasi identici, tranne che per un paio di cambiamenti causati dalla riclassificazione di tipo ceppi Clostridiales, che hanno interessato alcune assegnazioni di Eubacterium
e Lachnospiraceae.
La fase iniziale del sequenziamento ha esaminato 2 basso (DB e DC) e 5 alti (DF, DL, DG, dI, DA) malattia COHRA partecipanti. Un altro campione a bassa malattia (DM), valutata sulla base di criteri parodontali, è stato ottenuto attraverso la West Virginia University Dental Clinic e servito come controllo a bassa malattia non COHRA. La percentuale di un tipo batterico in ciascun campione rispetto al numero totale di cloni sequenziati (indicate nella parte inferiore di ogni colonna) è mostrata nella heatmap nella figura 1. Come precedentemente riportato [6], aumentato diversità batterica era evidente in placca individui con diagnosi di alta malattia orale. Tuttavia, inaspettatamente un gran numero di alta malattia tipi di batteri sono stati classificati nel cluster Clostridiales (Selenomonas
, Eubacterium
, dialister
), che sono stati completamente assenti dal basso placca malattia. Notevole anche in alta malattia è stata la bassa frequenza di tipi di batteri tradizionalmente legati alla parodontite (Porphyromonas
, Tannerella
, Treponema
e Aggregatibacter
). La placca di bassa malattia esposta una popolazione batterica nettamente diverso, tra cui principalmente Streptococcus
e Veillonella
con un numero moderato di Capnocytophaga
. La diversità batterica in condizioni di scarsa malattia campioni COHRA era altamente coerente con uno studio recente, che ha individuato Streptococcus
, Veillonella
e Capnocytophaga
nel 100% dei campioni di placca ottenuti da individui con cavità orale sani [27]. Così, mentre i batteri associati con la salute orale in West Virginia era altamente riflettente di altre regioni degli Stati Uniti, una firma filogenetico patogeno atipico che include Selenomonas
e altri batteri a grappolo Clostridiales sembrava di essere associati con il declino della salute orale in West Virginia. Figura 1 Identificazione delle popolazioni batteriche della placca sottogengivale conto di West Virginia. composizione batterica in campioni di placca è stata determinata utilizzando 16S rRNA sequenziamento del gene in 2 bassi e 5 partecipanti alti malattia COHRA orali, basato su esami parodontali, e 5 partecipanti allo studio cognitivi, basato su indice di carie. DM è un campione di controllo malattia parodontale bassa ottenuta attraverso la West Virginia University Dental Clinic. Ogni scatola numerata indica la percentuale di cloni dello specifico tipo batterica 16S rRNA gene rispetto al numero totale di cloni sequenziati, che viene indicato nella parte inferiore di ogni colonna. Il colore della casella riflette i conteggi osservati.
Partecipanti allo studio avevano un'età compresa COHRA 23-48, e partecipanti allo studio cognitivi (età 73-93) hanno fornito un mezzo per valutare come i tipi di batteri in relazione allo stato dei denti più tardi nella vita. La salute parodontale dei 5 partecipanti allo studio cognitivi inclusi in questo studio era eccezionalmente buono, come evidente in profondità di sondaggio di o inferiore a 3 mm, indicati nella tabella 2. Tuttavia, come previsto per questa età, una notevole variazione è stata osservata in salute della carie (Tabella 2, delimitata da linee tratteggiate), con DT avere la più alta percentuale dei denti sani, e DAA e DZ avere la più alta percentuale di denti mancanti /cariati. Esame di tipi di batteri della placca sottogengivale di DT rivelato principalmente Veillonella
, Streptococcus
e Capnocytophaga
(figura 1), come osservato per i partecipanti COHRA basso di malattia. In confronto, DAA e DZ avevano modelli batteriche che comprendeva una maggiore diversità e la ricchezza di specie di Selenomonas
, Eubacterium
e dialister
, oltre a molte delle altre specie batteriche osservate in alte partecipanti malattia COHRA orali. analizza questi dati sono coerenti con la firma batterico di età compresa tra i Virginians ad ovest con la perdita dei denti essendo simile a quella dei più giovani Virginians West con malattia parodontale.
statistica di tipi di batteri identificati nella placca subgengivale
analisi Unifrac [17], che prende in considerazione le distanze filogenetiche, è diventato il metodo di scelta per analizzare le differenze tra le comunità microbiche ed è stato usato nei nostri studi per fornire validazione statistica delle differenze in ambienti placca bassa e alta della malattia. Il metodo richiede un albero filogenetico radicato come input, e abbiamo usato il server RDP per generare l'albero, che è particolarmente adatto per allineamenti rRNA come impiega Infernal [28] che è guidato dalla struttura secondaria previsto. L'albero è stato costruito con il metodo del vicino di casa-giunzione [29], utilizzando APE in R. Si era radicata includendo Thermotoga maritima
SL7 come outgroup. L'algoritmo Unifrac è stato utilizzato per calcolare la frazione unica di lunghezza ramo per ogni campione. Questi risultati (che sono distanze filogenetiche che separano i singoli campioni) sono stati analizzati utilizzando cluster analysis (UPGMA) e PCOA e sequenze duplicate ignorati. Come mostrato in Figura 2A, PCOA separato partire malattia da campioni malati in due gruppi lungo il primo autovettore. analisi dei cluster anche diviso malattie basso e campioni malati in diversi cladi, con DT campione (etichettati T in figura 2), il campione di almeno malata basato su carie risultati nello studio cognitiva, frazionamento al basso clade malattia. Il supporto per i cluster è stata valutata mediante prove Jackknife (1000 replicati; Figura 2B). Quando le analisi sono state ancora eseguite con tutte le sequenze rietichettato come malato o sano, analisi Unifrac trovato i due ambienti per essere statisticamente differente (P
& lt; 0,001), anche se non duplicati sequenze sono state prese in considerazione. Figura 2 Analisi statistiche delle popolazioni batteriche in placca bassa e alta malattia. A) coordina Principal analisi delle comunità batteriche dalla placca sottogengivale di Virginians ad ovest con bassa malattia orale (blu) rispetto alla placca di Virginians ad ovest con vari gradi di malattia orale (rosso). B) L'algoritmo Unifrac è stato utilizzato per calcolare la lunghezza ramo unico per un dato sottocampione. cluster analysis spaccatura bassa (blu) e campioni di malati (rosso) in diverse cladi. Il supporto per i cluster è stata valutata mediante test di coltello a serramanico (1000 replicati). T è stato il campione di almeno malata nello studio cognitiva, come classificati nella tabella 2. Il 'D' è stato rimosso dal campione notazioni in queste figure per chiarezza
. Analisi delle popolazioni batteriche nella placca usando HOMIM analizza
Dal rRNA sequenziamento del gene ha rivelato una firma batterica inaspettato nella placca di Virginians ad ovest con alta malattie orali, abbiamo chiesto se questo modello potrebbe essere rilevato utilizzando un metodo alternativo di 16S rRNA analisi del gene, HOMIM. In HOMIM, più primer sono inizialmente utilizzati per amplificare 16S geni rRNA all'interno di un campione di DNA, che vengono poi analizzati per la presenza di 16S rRNA specifici geni con sonde progettate per ottimizzare il rilevamento di 272 differenti specie batteriche [30]. Diversamente 16S rRNA sequencing, che consente la quantificazione della frequenza dei cloni batterici, read-out per HOMIM è una intensità di segnale relativo per ciascun rilevato sequenza di 16S rRNA su una scala da 0 a 5. Nei nostri studi HOMIM risultati sono presentati come somma dei segnali per tutti i taxa orale all'interno di ogni genere. I confronti di HOMIM e sequenza di DNA analisi di campioni di placca da 4 a bassa malattia (DB, DC, DM, DT) e la più alta 5 malattia (DA, DI, DG, DZ, DAA) partecipanti al nostro studio sono illustrati nella Figura 3. HOMIM analisi della placca dal basso malattia rilevato una frequenza elevata di Veillonella
, Streptococcus
e Capnocytophaga
, in parallelo da vicino i risultati di 16S rRNA sequencing (Figura 3A). tipi di batteri meno diffusi rilevati nel 16S rRNA sequencing, come Gemella
, Fusobacterium
, Actinomyces
, Granulicatella
, Neisseria
e Haemophilus
, sono stati confermati da HOMIM. Altri tipi di batteri, presumibilmente troppo bassa frequenza per rilevare mediante sequenziamento, sono state rilevate anche in condizioni di scarsa malattia HOMIM, il più evidente dei quali erano Campylobacter
, Prevotella
, Leptotrichia
, Lautropia
e Aggregatibacter
. Questi risultati evidenziano differenze osservabili tra il sequenziamento del DNA e HOMIM causa metodologie impiegate in HOMIM che può aumentare la sensibilità di rilevazione di specie batteriche specifiche per 10 volte. Figura 3 Confronto di 16S rRNA gene analisi utilizzando il sequenziamento e HOMIM. La frequenza di tipi di batteri (in percentuale), determinato da 16S rRNA sequenziamento, di 4 campioni di placca dal basso malattia e 5 campioni di placca da alta malattia Virginians ad ovest, basato su criteri definiti nei materiali e metodi, è stato confrontato con l'intensità del segnale microarray acquisite dagli stessi campioni HOMIM analisi. tipi di batteri di sopra della linea rossa erano più frequenti in condizioni di scarsa malattia.
in placca da individui con elevata malattia, HOMIM analisi hanno confermato la presenza di generi dall'ordine Clostridiales, tra cui Selenomonas
, Eubacterium
e dialister
(Figura 3B). In particolare, come con i dati di sequenziamento, batteri nel 'complesso rosso' erano assenti o presenti a livelli bassi in analisi HOMIM. Come con basso placca malattia, i segnali sproporzionatamente elevati per alcuni batteri, in particolare Campylobacter
, Prevotella
e Leptotrichia
, sono stati osservati in analisi HOMIM rispetto al sequenziamento, ancora una volta a causa dell'aumento della sensibilità delle metodologie di rilevamento microarray. È importante sottolineare che, conclusioni HOMIM analisi hanno confermato quelli di 16S rRNA sequencing, e identificato una maggiore ricchezza genere e segnali ad alta intensità per Selenomonas
, Eubacterium
e dialister
in associazione con un declino della salute orale.
Origin di tipi di batteri in alta placca malattia
alberi filogenetici di tipi di batteri sviluppato utilizzando 16S rRNA sequencing anche fornito informazioni sull'origine di firme batterica associata a elevata malattia orale. Ad esempio, il confronto di sequenze di geni 16S rRNA ha rivelato che diversi Selenomonas
spp. sono stati effettivamente ripetute colonizzatori dell'ambiente orale alta malattia. L'albero rRNA 16S rappresentato in figura 4 mostra la grande diversità dei Selenomonas
filotipi recuperati in un singolo campione di placca da un soggetto ad alto malattia (DA). Al contrario, lo stesso clade in un campione da un minimo di malattia soggetto (DB) conteneva solo bassa diversità Veillonella
filotipi. L'ordine Clostridiales ha la sua assegnazione filogenetica nei Firmicutes (tipicamente Gram-positivi), ma include una grande famiglia, Veillonellaceae, che sono anaerobi obbligati che macchiano Gram-negativi a causa di una membrana pseudo-esterna porosa. Bassa malattia Veillonella
hanno sequenze quasi identiche tipici di una singola specie (& gt; 97% 16S rRNA sequenza genica di identità), come rappresentato nella figura 4. Nei nostri studi, abbiamo trovato il stretto gruppo di Veillonella
osservato in condizioni di scarsa la malattia è stato sostituito nella placca da alta malattia da una vasta espansione di altri membri della famiglia Veillonellaceae, come Selenomonas
e dialister
. Allo stesso tempo, in alta malattie c'era una espansione del Gram-positivi dall'ordine Clostridiales, soprattutto nelle famiglie eubacteriaceae e Lachnospiraceae. L'ampiezza di questo gruppo batterico è di grandi dimensioni (minimo ~ identità 85%), e questo ci ha permesso di riconoscere che sono state ripetute Clostridiales colonizzatori nella placca di individui aventi alta malattia orale, come rappresentato dalla diversità filogenetica di Selenomonas
in figura 4 . Questa scoperta è importante perché evidenzia il ruolo dell'ambiente orale (al contrario di nell'evoluzione situ causa di trasferimento genico orizzontale) nella generazione di firme batterici associati all'elevata malattia orale in West Virginia. Figura 4 alberi filogenetici di Selenomonas e Veillonella isolati dai singoli campioni di placca. 16S rRNA sequenze di geni provenienti da un singolo campione di alta malattia placca (DA, il testo rosso) e un singolo campione basso di malattia di placca (DB, il testo blu) sono stati utilizzati per generare alberi filogenetici di Selenomonas
e Veillonella
, rispettivamente. L'asse x indica la differenza per cento nel 16S rRNA sequenza genica. I gruppi separati di Selenomonas
mostrare che questa popolazione discende da colonizzare in modo indipendente, ma i batteri filogeneticamente correlato. Veillonella
da DB espone diversità limitata.
Conclusioni
L'eziologia dei poveri salute orale che porta alle statistiche di perdita di alta dente in West Virginia è sconosciuta. L'obiettivo di questo studio è stato quello di ottenere una visione in questo problema utilizzando 16S rRNA gene analisi per caratterizzare le specie batteriche nella placca sottogengivale di Virginians ad ovest avere alta malattia orale. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.
| 