Abstract
sfondo
fattore Krüppel-like 4 (Klf4) è un fattore di trascrizione che regola la proliferazione differenziazione equilibrio dell'epitelio, e il basso regolata nei carcinomi orali meno differenziati e avanzate. Anche se l'espressione viene inattivato dalla ipermetilazione promoter nelle cellule tumorali maligne, rimane sconosciuta nelle cellule di carcinoma orale.
Metodi
DNA genomico isolato da nove diverse linee cellulari di carcinoma orale e una linea di cheratinociti normale è stato trattato con bisolfito di sodio, e metilazione a Klf4
promotore del gene è stata determinata mediante PCR analisi di sequenza diretta. . Espressione Klf4 in cellule in coltura con o senza il reagente demetilazione è stata controllata dalle quantitativa real-time PCR e immunoblot
Risultati
Una regione spanning 237 bp promotore - 718 e - 482 di Klf4
gene è stato hypermethylated in orale cellule di carcinoma che esprimono Klf4
ad un livello basso, ma la metilazione era infrequente in cellule che esprimono Klf4
quantità elevata. La regione a valle - 481 al +192 non metilato in tutte le linee cellulari. trattamento demetilazione di cellule up-regolata l'espressione a livello di mRNA e di proteine.
Conclusione
Questo studio ha dimostrato che hypermethylation in una gamma ristretta della regione del promotore down-regola l'espressione Klf4, e suggerisce che la perdita di espressione da parte del hypermethylation contribuisce alla progressione del carcinoma orale
Parole
Gene ipermetilazione del promotore Krüppel-come fattore orale cancro elettronico materiale supplementare
La versione online di questo articolo (doi:.. 10 1186 /s12903-016-0172- 5) contiene materiale supplementare, che è disponibile per gli utenti autorizzati.
Sfondo
carcinomi orali sono un tumore maligno più frequente della testa e del collo, ma la prognosi dei pazienti non è stata migliorata sufficientemente. cellule di carcinoma invasivo anteriori mostrano spesso l'espressione genica aberranti, e dedifferentiate in stati simili alle cellule mesenchimali in un processo di progressione della malattia [1-3]. Inoltre, la proliferazione sostenuta è un'altra caratteristica importante in un sottogruppo aggressivo dei carcinomi. Proliferazione e l'equilibrio la differenziazione delle cellule controllano lo sviluppo e l'omeostasi dell'epitelio e svolgono un ruolo definitivo in stato patologico di carcinomi [4]. Essi sono in gran parte regolati da geni del tumore soppressiva, e l'espressione dei geni è spesso inattivati da meccanismi epigenetici [5]. E 'importante per svelare una causa l'inattivazione genica del tumore soppressiva per comprendere i meccanismi di progressione del carcinoma orale.
In epitelio squamoso stratificato tra cui epitelio orale, fattore Krüppel-like (KLF) 4 e 5 sono espressi nelle cellule cheratinizzanti soprabasali post-mitotico e proliferativa delle cellule basali meno dissociati, rispettivamente. Essi controllano criticamente un equilibrio proliferazione differenziazione dell'epitelio [6, 7]. KLFs regolare trascrizionalmente l'espressione del gene bersaglio attraverso vincolante per il promotore, e studi precedenti documentato che la perdita di Klf4 soci espressione con de-differenziazione delle cellule di carcinoma orale ed è spesso osservata in un sottogruppo aggressivo dei carcinomi [7, 8]. Essa suggerisce un coinvolgimento della perdita di espressione in progressione del carcinoma.
Dal cromosomica delezione di Klf4
locus genico in 9q31.2 è un evento raro nei carcinomi [9, 10], l'inattivazione epigenetica del gene è un numero primo candidato responsabile della perdita di espressione. Tra le aberrazioni epigenetiche presenti nelle cellule di carcinoma, ipermetilazione del promotore è una causale più comune per inattivare l'espressione genica [11, 12]. Infatti, hypermethylation a Klf4
promotore del gene e enhancer è documentata nei carcinomi del colon, dello stomaco, della cervice e del rene [13-16]. Tuttavia, le regioni hypermethylated sono variabilmente localizzati nei carcinomi di diversa origine e sconosciuto nei carcinomi orali. In questo studio, abbiamo analizzato l'ipermetilazione e correlazione con l'espressione Klf4 nelle cellule di carcinoma orale.
Metodi
linee cellulari
linee cellulari di carcinoma orale (Ca9.22, HO-1-u-1, HOC313, HSC2 , HSC3, KOSC3, OSC19, SCCKN, TSU) e una linea cellulare cheratinociti normali immortalato ma non trasformato, HaCaT [17], sono state coltivate in 10% medio fetale bovino siero contenente.
analisi della sequenza bisolfito modificata del Klf4
promotore regione
stati metilazione del promotore a Klf4
gene sono state analizzate secondo uno studio precedente [18]. DNA genomico isolato da cellule sono state trattate con bisolfito di sodio e applicato per amplificazione PCR della regione del promotore attraversa - 718 e +192 (sito di inizio della trascrizione è fissato al +1) per l'analisi di sequenza diretta. Le sequenze di primer utilizzati per l'analisi sono i seguenti: 5 '-
-736GTATGTTAGTAGGGGTG-3' (avanti), 5 '- -442GAGTTTGTTGATTTAGTTGT-3' (avanti), 5 '- -331AAGGAAGTTATAAGTAAGGAA- 3 '(avanti), 5' - -72AATAAAACTAACTACC-3 '(indietro), e 5' - + 213AAACCCAAAACCCCAAATTAA-3 '(reverse). Abbiamo fatto riferimento a dati di sequenza del DNA di Klf4
gene depositato a GenBank (DQ658241.1).
Quantitativa real-time PCR
cellule forma isolata RNA totale con o senza 5 micron 5-aza-2-deoxycitidine ( 5-AZA) il trattamento è stato inverso trascritto in cDNA da MultiScribe trascrittasi inversa (Applied Biosystems) e sottoposto a quantitative PCR in tempo reale utilizzando il real-time PCR sistema StepOne (Applied Biosystems). Le condizioni di PCR erano 95 ° C per 20 s seguiti da 40 cicli di 95 ° C per 1 s e 60 ° C per 20 s. Le sonde TaqMan specifiche per Klf4
(Hs00358836_m1, Applied Biosystems) è stato utilizzato. I livelli di espressione normalizzati contro ACTB
(TaqMan endogeno di controllo ACTB umana, Applied Biosystems) sono stati calcolati con il metodo della curva standard (2 -ΔΔCt). Per analizzare relativo volte di cambiamenti di espressione, l'espressione dopo il trattamento 5-AZA è stato diviso per che, senza trattamento.
Immunoblot
lisati cellulari totali nel tampone campione SDS contenente 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoro e inibitore della proteasi cocktail ( Roche Diagnostic GmbH) è stata applicata al gel SDS-poliacrilammide in condizioni riducenti, e elettrotrasferite alle membrane PVDF. Le membrane sono state incubate con anticorpi contro Klf4 (Santa Cruz Biotechnology) o β-actina (Sigma-Aldrich) seguiti da anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano. I segnali sono stati rilevati utilizzando Chemi-Lumi One Super (Nakarai Tesque) e catturato il Ez-Capture MG (ATTO).
Risultati
espressione di Klf4 nelle cellule di carcinoma orale
espressione di mRNA era Klf4
quantificato dalla real-time PCR (Fig. 1). Tra le linee cellulari di carcinoma, è stato fortemente espresso in HaCaT cheratinociti normali. E 'stato rilevato ad un livello relativamente alto in KOSC2 cellule e HOC313 cellule, bassi nelle cellule HSC2, Ho-1-U-1 le cellule e le cellule Ca9.22, e non rilevabile in OSC19 cellule. Figura. 1 L'espressione di mRNA Klf4
in linee cellulari di carcinoma orale e cheratinociti normali (HaCaT). Klf4
espressione è stata quantitativamente esaminato dal real-time PCR. espressione relativa è stata standardizzata da espressione di ACTB
in ogni campione (n =
4) e confrontato con l'espressione nelle cellule HaCaT
ipermetilazione del promotore in cellule di carcinoma
metilazione a Klf4
promotore del gene da - 718-192 è stata esaminata dal PCR analisi di sequenza diretta bisolfito modificati. Il promotore incluso 109 cytosines metilazione-sensibili (file aggiuntivo 1: Figura S1), e ci ha descritto lo stato di metilazione di ogni citosina come U (metilato), M (metilato) o U /M (miscela di unmethylation e metilazione) in questo studio. In contrasto con l'assenza di metilazione HaCaT, tutte le linee cellulari di carcinoma contenute cytosines e frequenza di M citosina M e /o U /M era molto diversi (Fig 2 e complementari file di 1:. Tabella S1). La metilazione è stata confinata in una regione spanning 237-bp - 718 e - 482 che contiene 39 cytosines metilazione-sensibili designate come # 1 a # 39, e le cytosines nella regione di 673 bp a valle del # 39 citosina (# 40- # 109 ) non è stato metilato. analisi computazionale ha indicato che la regione 237-bp contiene cytosines metilazione-sensibili in quattro siti Sp1 di legame (# 5, 6, 23, 34 e 38) e cytosines sito una PU.1-binding (# 19 citosina). Le N ° 5, 6, 19 e 23 cytosines erano frequentemente metilato nei cellule che esprimono Klf4
a basso livello (Fig 3 e aggiuntive di file. 1: Tabella S1). Figura. 2 La metilazione del Klf4
promotore del gene. Una posizione di cytosines metilazione-sensibili nel promotore è indicato come il blu (in alto la linea
) e le cytosines sono numericamente numerate da 1 # a # 109. linee inferiori mostrano cytosines che sono stati completamente metilati (nero
) o non metilato (
bianco) e la miscela di metilazione e unmethylation (grigio
). M% e U /M% indicano percentuale di cytosines metilati e la miscela in 39 cytosines rispettivamente. dati; b sequenza sulla # 10 e # 11 cytosines. Quattro linee cellulari di carcinoma contenenti metilato (M) e cytosines non metilato (U) e la miscela (U /M) sono stati presentati come esempio
Fig. siti di legame 3 fattore di trascrizione nella regione 237-bp. siti di metilazione-sensibili sono contrassegnati da rosso, e siti Sp1 di legame (frecce blu) e
sito PU.1 di legame (linea verde
) sono indicati
Klf4
espressione dopo la demetilazione
Per esaminare un coinvolgimento della metilazione di espressione Klf4, le cellule sono state trattate con un reagente di demetilazione 5-aza e l'espressione è stata analizzata a livello di mRNA e di proteina. Il trattamento fortemente aumentata espressione di mRNA in cellule TSU e soprattutto HSC2 cellule (Fig. 4a), in cui il promotore stati hypermethylated ampiamente. Altre linee cellulari è aumentato l'espressione variamente, escludendo le cellule che esprimevano OSC19 mRNA di sotto di un livello rilevabile. espressione della proteina Klf4 era quasi identica a quella espressione di mRNA. E 'stato non rilevabile nelle cellule HSC2, cellule HSC3, HO-1-U-1 le cellule, le cellule TSU e OSC19 cellule. Dopo il trattamento demetilazione, hypermethylated HSC2 cellule e cellule TSU fortemente up-regolati l'espressione della proteina (Fig. 4b), e Ho-1-u-1 le cellule, le cellule e le cellule HOC313 Ca9.22 che non conteneva M citosina non ha aumentare la espressione. cellule OSC19 non hanno espresso la proteina come mRNA. Tra tre linee di cellule contenenti sia M e cytosines U /M in varie tariffe, le cellule e le cellule HSC3 KOSC2 apparentemente aumentato l'espressione, ma un altro (cellule SCCKN) non hanno. Figura. 4 Espressione del Klf4 dopo la demetilazione. una piega relativa della Klf4
mRNA in cellule trattate con 5-aza reagente demetilazione diviso per l'espressione senza trattamento 5-aza (n
= 4). espressione della proteina b Klf4 in cellule con (+) e senza (-) Trattamento 5-aza sono stati esaminati da immunoblot. β-actina è stato utilizzato come controllo interno
Discussione
cellule di carcinoma acquisiscono comportamenti aggressivi in un processo di progressione attivando e inattivando l'espressione genica associata al tumore. espressione Klf4 è diminuita in molti tipi di carcinomi in fase avanzata e la perdita di espressione avvia transizione epitelio-mesenchimale delle cellule di carcinoma che stimola fortemente la progressione [19]. Infatti Klf4 è down-regolato nei carcinomi orali meno differenziati e avanzati e sopprime de-differenziazione delle cellule [7]. Sebbene l'ipermetilazione promotore è considerata come causa della perdita di espressione [13-16], non è noto nei carcinomi orali. Questo studio dimostra che l'espressione correla strettamente con gli Stati hypermethylation a BP-239 regione nel promotore
. Ipermetilazione del gene responsabile della inattivazione è frequente negli CpG isole di geni tumore soppressiva [11, 12], ed è stato dimostrato in Klf4
gene in questo studio, suggerendo che la regione è importante per regolare l'espressione Klf4 nelle cellule di carcinoma orale. Questo è supportato da che il trattamento demetilazione up-regolati Klf4 mRNA e di proteine nelle cellule hypermethylated ma non le cellule senza hypermethylation. cellule Ca9.22, cellule Ho-1-u-1 e OSC19 cellule che non sono stati hypermethylated quasi non aumentare l'espressione. Si suggerisce una presenza di ulteriori fattori di attivare l'espressione. Tuttavia, è chiaro che l'ipermetilazione è responsabile Klf4 down-regulation, e che la bp regione 237 può svolgere un ruolo importante nell'espressione.
Ipermetilazione Klf4
gene è accaduto a enhancer del gene in cellule tumorali maligne umane; -2128 -1770 ~ Regione in cellule di medulloblastoma [20] e - 1.852 ~ -1658 regione in cellule di carcinoma della cervice uterina [15]. Anche se non abbiamo affrontato la metilazione al potenziatore in questo studio, la metilazione in regione del promotore è più direttamente come una piattaforma per regolare l'espressione genica in generale [11, 12]. Hypermethylation a Klf4
promotore del gene è stata osservata nelle cellule di carcinoma gastrico (-130 ~ -13 regione; Rif. 14) e nelle cellule di carcinoma del colon-retto (79 ~ +355 regione; Rif. 13), ma il - 481 ~ regione 192 non è stato metilato in questo studio. Esso indica che hypermethylation limitato ad una regione 237-bp da - 718 a - 482 è importante per la regolazione negativa nelle cellule di carcinoma orale. Recenti evidenze stabilito che hypermethylation avviene a diversa regione promotore del gene /enhancer in differenti tipi di cellule di carcinoma e l'ipermetilazione promotore è più designato per cellula-lineage e tipo cellulare specifica [11, 12]. E 'plausibile che i siti hypermethylation sensibili in cellule di carcinoma orale individuare oltre ad altri tipi di cellule di carcinoma.
La regione 237-bp codifica SP1 e PU.1 siti di legame che sono necessari per l'espressione [21, 22] . Sp1 svolge un ruolo critico nello sviluppo epiteliale [23, 24], e Klf4
- /-
topi sviluppano carcinomi orali [8, 25]. Pertanto, ipermetilazione alla regione 237-bp sembra avere un ruolo significativo nella Klf4 down-regulation. Dal momento che la perdita di espressione Klf4 associa a stretto contatto con la progressione del carcinoma orale, ripristinando l'espressione può essere una strategia interessante per trattare i pazienti.
Conclusioni
Questo studio ha dimostrato che Klf4
promotore del gene è stata hypermethylated nelle cellule di carcinoma orale in un regione diverso da altri tipi di cellule di carcinoma, e che è stata associata con l'espressione Klf4. Dal momento che Klf4 è soppressivo del tumore, la sua inattivazione da parte del hypermthylation promotore può essere un meccanismo di progressione del carcinoma orale in linee cellulari di carcinoma analizzati in questo studio
Abbreviazioni
5-AZA:.
5-aza -2-deoxycitidine
KLF:
fattore Krüppel simile
M citosina:
citosina metilato
U citosina:
citosina non metilato
U /M citosina:
Miscela di cytosines non metilato e metilati
dichiarazioni
Riconoscimento
Questo studio è stato supportato da JSPS KAKENHI di Grant numero 26.462.859, ed effettuate sotto un curriculum di ricerca per la vita Dental Science presso la scuola della vita Odontoiatria presso Tokyo, The Nippon Dental University.
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aggiuntive. presentare
sui file 1: Figura S1. Metilazione siti sensibili presenti Klf4
gene e il promotore. sequenza di DNA analizzati in questo studio è mostrato (la sequenza in esone 1 è in maiuscolo). Cytosines potenzialmente suscettibili di metilazione e il loro numero numerica sono stati evidenziati in rosso, e un hypermethylated regione 237 bps è stata sottolineata. Tabella S1. Una sintesi di metilazione afferma ad ogni metilazione citosina sensibili. (PDF 160 KB) Competere interessi
Gli autori dichiarano di non avere interessi in competizione.
Contributo degli autori
AA, KK, AT, AS, HA, TH, DU, KY e TC completato tutti gli esperimenti. TC e KI progettato lo studio, e KI ha scritto il manoscritto. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.
