Abstract
Background
a causa della crescente tassi di cancro orofaringeo, infezione da HPV orale è un problema significativo. Metodi per individuare gli HPV per via orale non è standardizzato in quanto vi sono diverse tecniche disponibili. Noi proponiamo che l'uso di campioni di risciacquo orale per rilevare per HPV è una tecnica adatta all'interno di un ambulatorio. Così, il nostro obiettivo principale è quello di studiare la rilevazione dell'HPV in campioni di risciacquo orale.
Metodi
Nel nostro studio, abbiamo utilizzato la raccolta dei campioni di risciacquo orale accoppiato con real-time PCR per rilevare per i tipi di HPV 16 e 18, e preferenzialmente amplificato campioni FAP PCR per rilevare per una vasta gamma di HPV, nel carcinoma orofaringeo a cellule squamose (OPSCC), non OPSCC, e pazienti sani.
Risultati
Trenta tre per cento dei 100 pazienti affetti da cancro sono stati positivi per qualsiasi tipo di HPV ; di quelli 23 sono risultati positivi per HPV16. Solo 1 su 110 controlli sani è stato positivo (questo argomento è stato positivo per HPV18).
Conclusione
I nostri risultati indicano che l'individuazione di HPV in campioni di risciacquo orale può essere utile come strumento di screening per rilevare tumori del cavo orale da HPV-associati.
Sfondo
tessuti infetti da virus del papilloma umano (HPV) hanno la capacità di evolvere in un cancro HPV-associati. Ciò è probabilmente dovuto ad un effetto di campo in cui l'HPV può modificare le funzioni delle cellule normali con conseguente malignità. Anche se sappiamo come eseguire il test per i tumori HPV-correlate, non esiste attualmente alcun standard per rilevare l'infezione da HPV [1], e lo screening per l'HPV potrebbe identificare i soggetti a rischio per la testa e il carcinoma a cellule squamose del collo (HNSCC). A proposito, casi HNSCC associati con HPV sono stati una sfida per lo screening del carcinoma della cavità, a cellule squamose soprattutto orale (OSCC) e casi orofaringea carcinoma a cellule squamose (OPSCC), che sono sottoinsiemi di HNSCC. L'area orofaringea comprende la base della lingua, palato molle, tonsille, e della regione tonsillare, con la cavità orale che comprende il resto dei tessuti interni della bocca. I metodi più comuni per il rilevamento dell'HPV all'interno della bocca e dell'orofaringe iniziano con raccolta di cellule con un tampone di cotone, cytobrush o un collutorio [2], seguito dall'uso di dosaggi di DNA PCR basati ibridazione in situ [3]. Tuttavia, ci sono sfide presenti per alcune tecniche. Ad esempio, l'uso di un tampone /spazzola limita la quantità della mucosa che viene campionata, e ottenere un campione da una lesione non-visibile all'interno della cripta tonsillare può non essere realizzabile [4]. La base della lingua non è interamente accessibile sia in quanto vi è sia mucosa piatta e tonsille, aumentando così il rischio di falsi negativi [5]. Abbiamo scelto di utilizzare una tecnica di sciacquare la bocca per la raccolta dei campioni in quanto è non invasivo, rapido e semplice per il paziente. Espressione
Analisi p16 è stato utilizzato come biomarker per dell'OSCC /OPSCC HPV-associati, ma gli studi hanno riportato che p16 sovraespressione non è sempre presente nei casi di HPV oncogenici [6-9]. Un recente studio ha concluso che p16 non deve essere utilizzato come marcatore surrogato per l'infezione da HPV in tumori del cavo orale a causa della scarsa concordanza tra i due [10]. Prima di questo, Pannone et al. ha anche dichiarato che p16 immunoistochimica (IHC) da sola non dimostra di essere un metodo affidabile nella rilevazione dell'HPV per i casi di OSCC /OPSCC [11]. All'interno del nostro studio, abbiamo ottenuto le informazioni per la prova p16 per vedere se i nostri dati HPV era in concordanza.
OPSCC incidenza nei paesi sviluppati è aumentata in modo significativo e l'infezione da HPV si propone di essere il fattore principale [12]. I fattori di rischio per l'infezione da HPV orale comprendono certe pratiche sessuali [13-16]; numero di partner a vita e il numero di partner sessuali recenti, l'età avanzata, il sesso maschile, e il fumo di sigaretta corrente [17, 18]. Il tipo più diffuso di HPV associata ad infezione orale è di tipo 16 [17, 19], che è stato dimostrato essere oncogeno nel HNSCCs [20]. Una revisione sistematica di tutto il mondo di biopsie HNSCC dimostrato HPV16 nel 31% dei casi OPSCC; 16% dei casi dell'OSCC; e il 17% dei casi di SCC laringe [21]. HPV tipo 18 appare anche a svolgere un ruolo significativo nella carcinogenesi, in particolare nella orofaringe [22, 23].
Con l'ascesa di OPSCCs è indispensabile avere una tecnica gold-standard in vigore per la rilevazione di HPV per via orale. Raccolta campioni dalla cavità orale e dell'orofaringe per la rilevazione di HPV orale dovrebbe essere rapido, non invasivo, economico, e sufficiente raccolta HPV DNA. Nel nostro studio, abbiamo studiato i campioni di risciacquo orale accoppiato con real-time PCR Taqman per rilevare per i tipi di HPV 16 e 18, che è sensibile e specifico. Per rilevare per una vasta gamma di HPV, che preferenzialmente amplificato i campioni di risciacquo orale da casi di cancro, e fluorescenti utilizzato arbitrariamente innescato (FAP) PCR, un metodo generale PCR usando primer degenerati HPV.
Popolazione di studio
Tra il 2011 e il 2013, abbiamo reclutato 76 OPSCC e 24 pazienti non-OPSCC dalla Seattle Cancer Care Alliance (Seattle, WA), e 110 soggetti sani provenienti da Università di Washington Dental Clinic (Seattle, WA). casi non OPSCC inclusi pazienti con tumori OSCC, della laringe, del seno, e sovraglottide. Abbiamo proiettato gli orari di cinque oncologi al fine di identificare i malati di cancro ammissibili e discusso il nostro studio alla loro nomina. Un paziente ha rifiutato a causa di dolori alla bocca e la sensibilità. 21/100 pazienti affetti da cancro avevano già iniziato il trattamento e di questi 21 pazienti: 18 pazienti hanno avuto un trattamento meno di 21 giorni prima del campionamento, due avevano più di 30 giorni di trattamento, e un paziente ha avuto un trattamento per 7 mesi. soggetti sani sono stati selezionati in modo casuale all'interno della clinica dentale studente, un paziente ha rifiutato di prendere parte allo studio. i requisiti di inclusione per la popolazione sana incluso l'essere: cancro-free, non è in stato di gravidanza, l'HIV-libera, e di età superiore ai 16. Ogni paziente ha firmato i moduli di consenso scritto per partecipare allo studio (IRB # 7490 approvato 9 aprile 2014), e ha risposto un semplice questionario di salute. Sesso, età, razza, sono stati registrati il fumo, l'alcool, la marijuana e la storia per tutti i soggetti. Grafici per un sottoinsieme dei nostri pazienti sono stati esaminati per p16 immunoistochimica (IHC) e il test HPV
Metodi
Collection & Amp.; metodi di purificazione del DNA Compra di raccolta del campione, tutti i pazienti risciacquati e gargled per 30 s con originale menta Scope® colluttorio (Procter & amp; Gamble). Quattro individui sani pregati di utilizzare Crest® colluttorio senza alcool a causa di una storia di alcolismo. campioni risciacquo orale sono stati centrifugati per 15 min. a 4 ° C per formare un pellet, il supernatante è stato scartato e il pellet è stato posto in -80 ° C fino ad ulteriore lavorazione. Il kit Puregene® Purificazione del DNA è stato utilizzato per isolare il DNA genomico dal pellet buccale cella all'interno dei campioni colluttorio (Qiagen elemento # 158467, protocollo del produttore è stata seguita).
Tutti i soggetti umani protocolli e regolamenti IRB sono stati seguiti sotto il Fred Hutchinson Cancer . le linee guida Research center (IRB # 7490 approvato 9 Aprile 2014)
HPV & amp; Metodi analitici
PCR in tempo reale Taqman sono stati utilizzati per la rilevazione sulla ABI Prism 7900 Sequence Detection System con 40 cicli in una reazione (denaturazione a 95 ° C, annealing ed estensione a 60 ° C). quantificazione assoluta è stata utilizzata per determinare HPV16 e 18 carica virale e il DNA genomico umano totale nel campione è stato determinato sulla sequenze Alu. diluizioni seriali di DNA genomico umano e pieno HPV16 lunghezza e 18 plasmidi, di concentrazioni note, sono stati utilizzati come curve standard
HPV16 E7 Primer
Inoltra:. CGGACAGAGCCCATTACAATATT
Reverse: CGCACAACCGAAGCGTAGA
HPV16 E7 sonda: TAACCTT (T /C) TGTTGCAAGTGT
HPV18 E7 Primer:
Inoltra: CCGACGAGCCGAACCA
Reverse: TGGCTTCACACTTACAACACATACA
HPV18 E7 sonda: AACGTCACACAATGTT
al fine di aumentare l'efficienza della rilevazione dell'HPV, abbiamo usato il multiply-innescato rolling-circolare tecnica di amplificazione (MP-RCA) per amplificare preferenzialmente sconosciuta, il DNA di HPV circolare. MP-RCA è stato dimostrato per amplificare i modelli di DNA circolare fino a 107 volte [24]. Il protocollo TempliPhi 100 Kit di amplificazione (Amersham Biosciences) è stata seguita.
Il FAP PCR pubblicato protocollo è stato seguito per rilevare per una vasta gamma di tipi di HPV in cui primer sono stati sviluppati dalle regioni L1 conservate [25]. Abbiamo eseguito questa tecnica solo sui casi di cancro campioni (Fig. 1). Figura. 1 FAP PCR Risultati su un gel elettroforesi. Una banda atteso di ~ 480 bp indica un campione positivo HPV
Abbiamo classificato storia di fumo come segue: non-fumatore (0 confezioni); fumatore leggero (& lt; 1pack /settimana); fumatore moderata (≥1pack /Settimana ≤1 pacchetto /giorno); fumatore pesante (≥1pack /giorno). Per coloro che hanno fumato sigari o tabacco masticato abbiamo calcolato per l'equivalente di pacchetti di sigarette fumate. la storia di alcol è stato classificato come segue: nessuno (non beve mai); Raramente /di tanto in tanto (1 drink ogni 1-2 mesi); luce (1-6 bevande /settimana per le femmine, 1-13 bevande /settimana per i maschi); moderata (7 bevande /settimana per le femmine, 14 bevande /settimana per i maschi); pesanti (& gt; 7drinks /settimana per le femmine, & gt; 14 bevande /settimana per i maschi).. in tutte le nazioni l'analisi dei dati è stata effettuata utilizzando Stata MP 13.1 (StataCorp LP, Texas, USA): Risultati
cancro orale soggetti con OPSCC e non OPSCC avevano più probabilità di essere di sesso maschile rispetto ai soggetti di controllo senza cancro, come almeno il 83% dei soggetti in ogni tipo di cancro era di sesso maschile, rispetto a solo il 46% dei controlli (Tabella 1; p
& lt; 0,001). i casi di cancro sono stati anche più vecchio di controlli, come & gt; 80% dei casi, indipendentemente dal tipo di cancro, sono stati 50 anni di età o più anziani rispetto a solo il 63% dei controlli (p
& lt; 0,001). I soggetti con OPSCC e non OPSCC sono stati simili a soggetti senza cancro rispetto alla gara (p
= 0.30) ed etnia (p
= 0.62) ed erano prevalentemente caucasici non ispanici. Coloro che hanno avuto il cancro (39% OPSCC, il 54% non OPSCC; p
& lt; 0,001) avevano più probabilità di essere fumatori pesanti rispetto a quelli senza cancro (32%). la storia di alcol è stato diffuso nel 33% dei OPSCC e nel 33% dei pazienti OSCC (p = 0,015
) rispetto a solo il 12% dei soggetti non-cancro. uso di marijuana è stata principalmente osservata in casi di cancro (11% OPSCC, 4% dell'OSCC; p = 0.010
) e raramente nei controlli (0,91%). I casi di entrambi i tipi di cancro (33% OPSCC, il 33% non OPSCC; p
& lt; 0,001) avevano più probabilità di avere l'HPV rilevabili rispetto ai controlli sani (0,9%), e in particolare di tipo 16 (25% OPSCC, 17% non OPSCC; p
& lt; 0,001) rilevato nei loro campioni di risciacquo orale rispetto ai controlli. rilevamento HPV18 non variava dal gruppo di studio ed è stato rilevato in un singolo campione da un soggetto di controllo (p = 0,63
), e nessuno nei casi di cancro. Il nostro metodo per la rilevazione dell'HPV aveva una sensibilità del 33% e una specificità del 99% (p
& lt; 0,001) .able 1 Demografia tra tutti i soggetti in casi di non-cancro e tumore
No cancro
OPSCC
non OPSCC
p
-value
n = 110
n
= 76
n = 24
genere
Maschio
51 (46.36%)
63 (82.89%)
20 (83.33%)
& lt; 0,001
femminile
59 (53.64%)
13 (17,11%)
4 (16,67%)
età raggruppati
20-39
27 ( 24.55%)
1 (1.32%)
1 (4.17%)
40-49
13 (11.82% )
10 (13.16%)
2 (8,33%)
50-59
21 (19.09%)
29 (38,16%)
11 (45.83%)
& lt; 0,001
60-69
29 (26.36%)
30 (39.47%)
8 (33,33%)
70 +
20 (18,18%)
6 (7,89%)
2 (8,3%)
Race
asiatico
5 (5,55%)
Pagina 2 (2,63%)
1 (4.17)
nero
6 (5,45%)
1 ( 1,32%)
0
Bianco
92 (83.64%)
65 (85.53%)
21 ( 87.50%)
0.30
Altro
7 (6,36%)
4 (5,26%)
1 ( 4,17%)
sconosciuta
0
4 (5,26%)
1 (4.17%)
Razza (Spagnolo /Latino)
Sì
4 (3,64%)
2 (2,63%)
0
0.62
No
106 (96.36%)
74 (97.37%)
24 (100%)
storia di fumo
non fumatore
51 (46.36%)
21 (27.63%)
5 (20.83 %)
fumatore
1 (0,91%)
14 (18.42%)
2 (8,33%)
& lt; 0,001
Moderato fumatore
23 (20,91%)
11 (14,47%)
4 (16.67 %)
pesante fumatore
35 (31.82%)
30 (39.47%)
13 (54.17%)
storia alcool
Nessuno
24 (21.82%)
7 (9,21%)
3 (12,50%)
Raramente /
occasionalmente
16 (14.55%)
14 (18.42%)
4 (16,67%)
Luce
54 (49.09%)
27 (35.53%)
9 (37,50%)
0,015
Moderato
3 (2,73%)
3 (3,95%)
0
Heavy
13 (11,82%)
25 (32.89%)
8 (33,33%)
Qualsiasi marijuana utilizzare
Si
1 (0,91%)
8 (10.53%)
1 (4.17%)
0,010
No
109 (99,09%)
68 (89.47%)
23 (95.83%)
Qualsiasi HPV
1 (0,91%)
25 (32.89%)
8 (33,33%)
& lt; 0,001
HPV 16 positivo
0
19 (25,00%)
4 (16,67%)
& lt; 0,001
HPV 18 positivo
1 (0,91%)
0
0
0.63
ADATA per "No cancro" è associato dati pubblicati dalla prevalenza di tipi di HPV 16 e 18 entro la fissazione di un ambulatorio dentistico studente
(J relative et al.)
Ventidue campioni positivi di HPV sono stati testati per la p16 prima del campionamento, e solo un test negativo per p16 . Tuttavia, 26 campioni sono risultati negativi per l'HPV sono stati positivi per p16 (Tabella 2). Va notato che tre dei 26 pazienti (p = 0,085
) sottoposti a trattamento (es. Chemioterapia, radioterapia, escissione) prima del campionamento, che potrebbero influire la presenza di infezione da HPV prima. HPV è stato marginalmente associata con p16 rilevamento (p = 0,076
); dei pazienti che erano HPV positivo, il 96% ha avuto un test positivo p16; un solo campione che è stato positivo per HPV risultato negativo per p16. Tra i pazienti negativi HPV, 79% era positivo p16. Solo due pazienti caso era lo screening HPV completato prima del campionamento ed entrambi sono risultati negativi per l'HPV nei nostri test e la screening.Table 2 p16 e qualsiasi HPV
Qualsiasi HPV
p16 prova
p
-value
positiva negativa
0,076
n = 48
n = 8
Sì
22 (95.65%)
1 (4,35%)
No
26 (78.79%)
7 (21.21%)
Discussione
raccolta del campione del paziente può essere un compito difficile e richiede tempo soprattutto quando il ricercatore è interrompendo un appuntamento. Inoltre, molti individui hanno riflessi gag sensibili, pertanto se una tecnica pennello o tampone viene utilizzato per raschiare la parte posteriore della gola, ottenendo un campione può essere molto difficile senza l'aiuto di un anestetico locale. Questo è il motivo per cui è indispensabile avere una tecnica di campionamento sul posto che non è invasivo e veloce, ancora sufficienti per la rilevazione dell'HPV. Il nostro studio ha dimostrato che la raccolta dei campioni di risciacquo orale è un metodo discreto da utilizzare per la rilevazione di HPV per via orale. Ciò è in accordo con uno studio di confronto risciacquo orale e campionamento pennello la citologia, che ha concluso che risciacqui orali sono stati la scelta migliore per il campionamento dal cavo orale al fine di individuare per l'HPV [26].
Abbiamo usato Scope® perché era osservate per avere un'ottima conservazione della qualità DNA ad alto peso molecolare, ed è più appetibile maggior parte degli altri mezzi di risciacquo [27]. Quattro pazienti di controllo pregati di risciacquare con Crest Pro-Salute® colluttorio analcolico. Non abbiamo visto differenze nella quantità di DNA (dati non riportati), ma più ricerca è necessaria per vedere se c'è una differenza con la quantità e la qualità.
quantificazione carica virale può essere cruciale nel determinare se OPSCC HPV-positivi /OSCCs sono senza dubbio il risultato di infezione da HPV [28]. Il gold standard per la valutazione della carica virale HPV è real-time PCR [29, 30]. Uno studio ha dimostrato OPSCC di avere una carica virale di ~ 80.000 volte superiore rispetto OSCC e altri HNSCCs [29]. I nostri risultati hanno mostrato differenze significative tra i due gruppi di cancro (Fig. 2). Inoltre, differenze nei risultati potrebbero essere causa di utilizzando biopsie fresche ghiacciato dove viene campionato solo una piccola porzione della cavità orale o orofaringe autori. campioni di risciacquo orale possono consentire una raccolta più efficace delle cellule orali per la rilevazione dell'HPV. Variazione reperti garantisce ulteriori indagini della carica virale in associazione con sottoinsiemi di HNSCC. Figura. 2 Confronto di HPV16 carica virale (copie /ng DNA) tra i due gruppi di cancro. Nessuna differenza statisticamente significativa è stata osservata (p
= 0.40). Le caselle grigie dimostrano gamma dal più basso al quartile superiore. La mediana è rappresentata da una linea orizzontale. Valori massimi e minimi sono indicati da linee verticali. è stato dimostrato variazione del carico virale tra ciascun gruppo. La carica virale mediana OPSCC è stato leggermente superiore a quello dei casi non OPSCC
Quello paziente con OPSCC, che aveva subito un trattamento per 7 mesi prima del prelievo, è stato positivo per l'HPV, in particolare di tipo 16. Questo caso è unico in quanto sottoposti a diversi mesi di trattamento dovrebbero sradicare il virus meno che se l'infezione era recente. Va notato che il paziente aveva una fumare e bere pesante storia. Più ricerca sulla prevalenza di infezione da HPV dopo la radiazione /la chemioterapia è garantito.
Una limitazione importante è stato non avere il DNA dal tessuto tumorale per confrontare la rilevazione dell'HPV. I campioni di tessuto non erano disponibili a noi, ma avrebbe agito come un gold standard nel nostro studio. Altre limitazioni al nostro studio includono: i nostri risultati dimostrano una bassa sensibilità per la rilevazione dell'HPV in pazienti affetti da cancro, ma con una elevata specificità; non siamo riusciti a controllare quanto bene un paziente sarebbe gargarismi e swish il colluttorio, che avrà un effetto sulla quantità e qualità del DNA raccolti; Scope® ha un forte sapore di menta, che non può essere adatto per le persone con bocche sensibili; piccole dimensioni del campione; non rileva per l'HPV RNA per mostrare infezione attiva; e FAP PCR è abbastanza sensibile per rilevare per una vasta gamma di HPV, ma alcuni HPV potrebbe non essere rilevato a causa della genericità dei primer disegnati [25]. test
p16 è di solito eseguita solo nei casi in cui non si adattano i fattori di rischio tradizionali (es. significativa di tabacco e alcol la storia), e il test HPV avviene raramente. Questo è qualcosa che deve essere cambiato durante la diagnosi a causa dell'aumento in OPSCCs HPV-associati.
Conclusioni
Dai nostri risultati abbiamo dimostrato che preferenzialmente amplificato campioni di risciacquo orali con la rilevazione dell'HPV da real-time PCR Taqman e FAP PCR, è un metodo utilizzabile complessiva, che potrebbe essere utilizzato in un ambulatorio. Studi più specifici dovranno essere fatto per determinare se collutori realtà non riflettono, in casi, il tipo di HPV associato alla lesione cancerosa
Abbreviazioni
dell'OSCC:.
carcinoma a cellule squamose orale
OPSCC:
orofaringea carcinoma a cellule squamose
HNSCC:
testa e del collo a cellule squamose carcinoma
RT-PCR: Real-time polymerase chain reaction
FAP PCR:
fluorescente arbitrariamente innescato la reazione a catena della polimerasi
MP-RCA:
Moltiplicare-innescato l'amplificazione di laminazione circolare
dichiarazioni
Ringraziamenti
fonte di finanziamento dell'Università di Fondo di Washington Royalty Research
Aperto. AccessThis articolo è distribuito secondo i termini della licenza creative Commons Attribuzione 4.0 Internazionale di Licenza (http: //. creativecommons org /licenze /da /4 0 /), che permette senza restrizioni l'uso, la distribuzione, la riproduzione e con qualsiasi mezzo, a condizione di dare adeguata credito all'autore originale (s) e la sorgente, fornire un collegamento alla licenza creative Commons, ed indicare se sono state apportate modifiche. La rinuncia Creative Commons Public Domain Dedication (http: //. Creativecommons org /pubblico dominio /zero /1. 0 /) si applica ai dati resi disponibili in questo articolo, se non indicato diversamente
concorrenti. interessi
Gli autori dichiarano di non avere interessi in competizione.
contributi degli autori
JD completati tutti gli esperimenti, hanno analizzato tutti i dati, e ha scritto il manoscritto. NBK e QF concepito /progettato lo studio, e la recensione /modificato il manoscritto. KDE è stato l'oncologo di collaborazione per lo studio che ha contribuito con la raccolta dei campioni, e con la recensione /modifica della carta. HJ assistito nella raccolta dei campioni. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.
