.
Abstract
sfondo
Questo studio ha lo scopo di osservare le caratteristiche morfologiche e di individuare le caratteristiche funzionali del dell'epitelio giunzionale (JE) tessuti e cellule in coltura JE
Metodi sezioni
paraffina di molare umano o premolari sul lato bucco-linguale gengivale sono stati preparati da 6 soggetti. HE colorazione e l'analisi delle immagini sono state eseguite per misurare e confrontare la differenza morfologica tra JE, gengivale epitelio orale (OGE) e l'epitelio sulculare (SE). Immunoistochimica è stata applicata per rilevare il pattern di espressione di citocheratina 5/6, 7, 8/18, 10/13, 16, 17, 19, e 20 in JE, OGE e SE. D'altra parte, le cellule JE e OGE umani primari sono state coltivate in vitro. Cellulare identificare è stata confermata dalla istologia e l'immunoistochimica. In un modello di co-coltura, TEM è stato utilizzato per osservare la formazione di attacco tra le cellule JE e superficie del dente.
Risultati
JE umano è stato un tessuto unico che era diverso da SE e OGE nella morfologia. Allo stesso modo, la morfologia delle cellule JE è stato inoltre confrontato con particolare cellule OGE coltivate in vitro. Inoltre, le cellule JE ha avuto un periodo di incubazione più lungo di cellule OGE. Diversa espressione di diversi CKs illustrato JE era una caratteristica di bassa differenziazione e alta rigenerazione. Dopo essere stato co-coltura per 14 d, più strati di cellule, membrana basale-like e strutture emidesmosoma-simile erano apparsi allo svincolo della membrana cellulare JE e superficie del dente.
Conclusioni
JE è un epitelio stratificato appositamente con basso differenziazione ed elevata capacità di rigenerazione in tessuto gengivale sia in vivo che in vitro. Nel modello di co-coltura, le cellule umane JE possono formare strutture membrana basale-like e emidesmosoma-like in circa 2 settimane.
Parole
giunzionale epitelio orale gengivale epitelio Citocheratina immunoistochimica Co-cultura elettronica materiale supplementare
La linea versione di questo articolo (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-30) contiene materiale supplementare, che è disponibile per gli utenti autorizzati
Sfondo
gengivale epitelio è costituito da tre regioni:. dell'epitelio gengivale orale ( OGE), epitelio sulculare (SE) e giunzionale dell'epitelio (JE). JE è un epitelio gengivale specializzata localizzare all'incrocio dei tessuti molli parodontali e tessuti duri, e allegando alla corona o radice come un collare. cellule JE sono uniformi in forma (sia piatta o mandrino) e parallela allineato alla superficie del dente, che contiene ampi spazi intercellulari a causa di giunzioni cellulari rilassato [1]. Come una struttura speciale allo svincolo dento-gengivale, JE è diverso da altri epiteli (OGE, SE) in origine, morfologia delle cellule, proliferazione e la differenziazione [2, 3]. Nel frattempo, è stato riportato che JE è fondamentale per mantenere l'integrità del tessuto parodontale [4, 5] ed è un settore chiave primaria insorgenza di malattie periodontali e trattamenti [6]. Inoltre, neutrofili a-defensine è stato trovato per localizzare nell'epitelio giunzionale, che ha effetti significativi sulla integrità epiteliale e funzionamento (adesione dei cheratinociti, si diffondono e la proliferazione), e gli effetti sono al di là delle loro attività antibatterica [7]. Tuttavia, non è ancora chiaro e controverso su JE nella differenziazione, attività fagocitaria, meccanismo della sua attaccamento alla superficie del dente, la riparazione e il meccanismo di ricostruzione dopo la lesione [5, 8].
I metodi istologici convenzionali per indagini di JE in vivo sono semplicistico approccio e limitato nel campo di osservazione [9-12]. Negli ultimi anni, gli studiosi hanno studiato il JE utilizzo in modelli di colture cellulari in vitro e le tecniche citologiche molecolari utilizzando animale e /o di cellule umane OGE, parodontali cells epiteliali del legamento e le cellule epiteliali orali [13-16]. Anche se queste cellule sono cellule epiteliali orali, non si possono modellare le cellule primarie JE completamente a causa di differenze di origine, la morfologia, la struttura, la differenziazione e stimoli che inducono la proliferazione.
Citocheratine (CK) sono proteine filamenti intermedi di famiglia citoscheletro e sono la principale proteine strutturali nelle cellule epiteliali. Come sappiamo, l'espressione di cheratine è una delle caratteristiche definitive delle cellule epiteliali e riflette le proprietà biologiche delle cellule epiteliali, tra loro origine, sviluppo, tipo istologico, e il livello di differenziazione [17, 18]. Numerose ricerche hanno studiato l'espressione e la distribuzione di una varietà di CK (CK-pan, 5/6, 7, 8/18, 10/13, 16, 17, 19, 20) nei tessuti parodontali di esseri umani e animali, e espressione di alcuni cheratine dell'epitelio gengivale sono stati determinati [15, 19-21]. Ad esempio, i pattern di espressione di CK10 /13, 16, 19 in JE erano diversi da quello in OGE e SE; La particolarmente elevata espressione di CK19 in tutti gli strati di JE fatto è diventato un marcatore caratteristico istologico per JE in vivo [3, 22-24]. Tuttavia, le espressioni di vari tipi di citocheratina in JE e la differenza con OGE e SE non sono stati segnalati sistematicamente.
In questo studio, le caratteristiche morfologiche dei tessuti JE stati esaminati mediante osservazione istologica, analisi dell'immagine e immunoistochimica. L'espressione e la distribuzione di una varietà di CK sono stati determinati nei tessuti JE e confrontati con OGE e SE. Inoltre, le cellule JE e OGE primarie sono state coltivate. La struttura e la crescita modello morfologica delle cellule JE e OGE primari sono stati osservati e le espressioni di cheratina specifici (CK-pan, 19, 10/13, 16) sono state rilevate anche mediante immunoistochimica. Abbiamo il sospetto di identificare le proprietà biologiche uniche (morfologia, potenziale rigenerativo) di JE in vivo e in vitro. Inoltre, le cellule umane in coltura JE sono stati seminati direttamente su fettine di radice umani in una cultura composita, al fine di esplorare il processo di JE nuovo attacco. Ciò fornirebbe prova sperimentale per un ulteriore studio di come nuovo attacco si verifica dopo la chirurgia parodontale e la formazione di perimplantare guarigione dei tessuti in clinica
. Metodi
Caratteristiche morfologiche dei tessuti epiteliali gengivali umani
esemplari gengivali umani sono stati isolati da campioni mandibola di due pazienti di sesso femminile con ameloblastoma mandibolare quattro maschi e. Erano non fumatori senza altre malattie. Il sito di età e il campionamento è stato elenco nella tabella 1. è stato effettuato un intervento chirurgico ablativo nel dipartimento di patologia orale presso l'Ospedale Affiliato del Popolo Nona di Shanghai Jiao Tong University tra settembre e ottobre del 2010. Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico locale , e il consenso informato è stato ottenuto da tutti i pazienti. molare mandibolare o premolari e dei suoi tessuti gengivali distanti dal sito del tumore con normale morfologia gengivale sono stati selezionati da osservazione clinica. Inoltre, i campioni meno di 3 mm di profondità rilevata dal sondaggio parodontale sono stati raccolti e fissati in formaldeide al 10% a temperatura ambiente per 24 h. I campioni sono stati posti in Plank-Rychlo decalcificazione soluzione (70 g di AlCl
3, 56 ml di acido formico, 85 ml di acido cloridrico e acqua distillata aggiunto 1 L) per 2 settimane dopo che erano stati tagliati verticale al asse lungo del dente lungo il lato bucco utilizzando una sega a mano. Infine, diversi 5 mm sezioni spesse di denti e tessuti gengivali nel centro del dente sono stati ottenuti da ciascun campione. Poi queste sezioni sono state sottoposte a etanolo disidratazione e paraffina. Tre blocchi di paraffina sono stati scelti a caso da ciascun campione e in serie sezionati a 4 micron. Le fette sono state colorate con ematossilina-eosina (HE) e osservati al microscopio luce. La larghezza, spessore, superficie di JE e la larghezza della SE sul lato buccale sono stati misurati da Axioplan immagine 2 analisi system.Table 1 misurati dimensioni in umano JE e SE
campione n.
Età
sito
campionamento
Larghezza JE (mm)
Spessore di JE (mm)
Area di JE (mm2)
Larghezza SE (mm)
1
21
Premolar
1.135
0.069
0.047
0.325
1.134
0.066
0.045
0.321
1.133
0.064
0.043
0.334
2
28
Molar
1.113
0.062
0.043
0.308
1.102
0.066
0.044
0.303
1.120
0.065
0.044
0.323
3
31
Molar
0.850
0.058
0.041
0.563
0.845
0.059
0.041
0.565
0.847
0.060
0.041
0.554
4
28
Molar
0.838
0.052
0.038
0.550
0.844
0.055
0.040
0.552
0.858
0.056
0.040
0.543
5
33
Premolar
1.105
0.083
0.043
0.785
1.108
0.083
0.043
0.801
1.105
0.083
0.041
0.808
6
38
Premolar
1.081
0.069
0.041
0.625
1.072
0.065
0.038
0.667
1.078
0.069
0.040
0.644
Mean
1.021
0.066
0.042
0.532
Standard deviazione
0,128
0,009
0.002
0.176
Il campione 2, 3 erano femmine e sinistra erano maschi .
causa di separazione JE con la superficie del dente dopo la decalcificazione, il confine tra JE e SE è stata determinata secondo creste epiteliali, cheratinizzazione, morfologia cellulare, e la colorazione. Secondo il metodo di proiezione, linee perpendicolari sono stati elaborati dal margine libero SE, giunzione di JE e SE, e la parte più radice JE verso la superficie del dente, rispettivamente. Le lunghezze di proiezione di SE e JE sulla superficie dentale sono state misurate le loro larghezze. Una linea perpendicolare stato elaborato nel punto più spesso della JE e la distanza tra i due punti di intersezione della linea perpendicolare ed epitelio è stato misurato lo spessore di JE. Una curva è stata elaborata dalla parte più radice JE alla sua confluenza con SE compreso l'intera regione ed area (Figura 1) JE. Figura descrizione di misura JE e SE 1 Schemi. larghezza A. SE; larghezza B. JE; Spessore C. JE; D. JE zona
. JE umana e OGE cellule di coltura
Per cultura cells JE e OGE in vitro, incisioni di 2 mm di lunghezza sono stati effettuati lungo buccale e la gengiva marginale linguale. Cinque denti sani e completamente scoppiati sono stati rimossi con denti ortodontico o influenzato (12 a 25 anni, buona salute orale e clinica gengiva sana). I denti insieme con la gengiva marginale incisi sono stati rimossi. La gengiva libera (compresi OGE e SE) è stato tagliato fuori il più possibile macroscopicamente. tessuti JE saldamente fissati al colletto del dente (non root) sono stati raschiato dalla superficie del dente (Figura 2), e lavato con una soluzione di D-Hank contenenti doppi antibiotici penicillina-streptomicina. Il protocollo di studio è stato approvato dal comitato etico di Zhongshan Hospital (No: 2009-173). Figura 2 campioni JE. A. Rimuovere completamente scoppiata dente incluso con gengiva marginale; B. Tagliare la gengiva libera in eccesso (compresi OGE e SE); C. Rimangono tessuto JE sul collo del dente; D. ottenere tessuto JE raschiando sul collo del dente; E. Rimosso tessuti JE; F. collo dente liscia dopo la raschiatura.
In coltura primaria, tessuti JE sono stati digeriti con 2 ml di soluzione di lavoro DispaseII a 4 ° C per 16-18 ore. L'epitelio è stato separato dalla lamina propria dalla pinza, e poi tagliato a pezzi, digerito con 4 ml di 0,025% tripsina-EDTA 0,01% per 5-8 minuti con agitazione. La digestione è stata interrotta aggiungendo una soluzione di D-Hank contenente 10% FBS, seguita da filtrazione con 180 micron setaccio in acciaio e quindi centrifugazione. I precipitati sono stati mescolati in (definito terreno di crescita dei cheratinociti) DKGM per formare sospensione cellulare. Le cellule sono state seminate in piastre da 24 pozzetti a 2 × 10 5 cellule /ml, e posti in un 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. Il mezzo è stato aggiornato dopo 3 giorni per la prima volta, una volta al giorno. Nella cultura passaggio, le cellule sono state diversi passaggi al 60-70% di confluenza con l'aggiunta di 0,25% tripsina-EDTA 0,02% a 37 ° C per 5-8 min. Quando le cellule apparivano arrotondati al microscopio, la digestione è stato terminato. Quindi le cellule sono state sospese e centrifugati. DKGM è stato aggiunto per formare sospensione cellulare, e distribuito in nuove capsule di Petri. D'altra parte, le cellule sono state trattate OGE come cellule JE sopra. Diversamente, il tessuto OGE è stato tagliato in piccoli pezzi di 5 × 5 mm 2. La sospensione cellulare OGE è stato seminato a densità che vanno 5-10 × 10 5 cellule /ml in piastre di Petri di 60 mm di diametro. Le cellule in coltura sono stati osservati quotidianamente utilizzando invertito microscopio a contrasto di fase per monitorare le loro condizioni di morfologia e di crescita. Inoltre, la sospensione di cellule singole diversi passaggi è stata inoculata a densità variabili 2-5 × 10 5 cellule /ml sulla copertura scivola in Petri-piatti sterili. Poi trattato con H & amp; E colorazione quando le cellule sono state coltivate al 60% di confluenza, e osservati con un microscopio ottico per tenere traccia delle modifiche sulla morfologia e la struttura della curva
la crescita delle cellule in cellule JE e OGE
JE primaria, le cellule OGE. al 100% di confluenza sono stati digeriti per formare un'unica sospensione cellulare e seminate ad una densità di 2 × 10 piastre 4 /cm 2 a 24 pozzetti. Le cellule in due pozzi a caso sono stati contati tutti i giorni con un hematocytometer. Una curva di crescita cellulare è stata tracciata per il numero medio di cellule ogni giorno rispetto al numero di giorni. Il tempo di raddoppio è stato ottenuto dalla curva di crescita che potrebbe indicare la durata del tempo necessario per le cellule per raddoppiare di numero durante la fase logaritmica.
Analisi immunoistochimica dei tessuti gengivali epitelio umane e cellule in coltura in vitro
immunoistochimica coniugato con perossidasi streptavidina metodo (SP) è stata eseguita su tessuto gengivale umano mediante incubazione con anti-CK 5/6 (clone D5 /16B4), anti-CK 7 (OV-TL12 /30), anti-CK 8/18 (clone Zym5.2) , anti-CK 10/13 (clone DE-K13), anti-CK 16 (clone LL025), anti-CK 17 (clone E3), anti-CK 19 (clone A53 /BA2) e anti-CK 20 (KS20 clone .8). Questi citocheratina anticorpi monoclonali anti-umani sono stati ottenuti da Zymed (U.S.A). tessuto ghiandola parotide umana era macchiato come controllo positivo [25] e l'anticorpo primario sostituito da PBS è stato utilizzato come controllo negativo. La procedura di immunoistochimica colorazione è stata eseguita da istruzioni del produttore Ab. Semplicemente, sezioni decerati sono state incubate con soluzione di pepsina a 37 ° C per 5-10 minuti, e incubate con siero di blocco a temperatura ambiente per 30 min. anticorpo primario alle 1:50 di diluizione è stato aggiunto nel gruppo di studio e il controllo positivo. PBS invece dell'anticorpo primario è stato aggiunto nel controllo negativo. Dopo essere incubate a 4 ° C per una notte, le sezioni sono state incubate nella soluzione di lavoro con biotina anticorpo secondario marcato a temperatura ambiente per 30 min e seguita con rafano perossidasi soluzione streptavidina a temperatura ambiente. soluzione cromogena DAB è stato aggiunto per 5-10 min. Le sezioni sono state lavate con acqua corrente, ri-colorate con ematossilina e montate. D'altro canto, le cellule diversi passaggi aderito a coprire slittamenti sono stati fissati con formalina al 10% neutra. Le cellule sono state trattate come JE tessuti sopra. In queste cellule, CK-Pan, CK19, sono stati rilevati CK10 /13 e CK16. Il citoplasma delle cellule positive CK era macchiato ed è stato classificato come negativo (-), senza coloranti, debolmente positivo (+) con colorazione giallo chiaro, positivo moderato (++) con colorazione positiva giallo o forte (+ + +) con colorazione marrone [26].
co-coltura di cellule umane JE e fette di radice
Denti fette provenivano da stessi campioni reclutati per le cellule primarie JE. I campioni sono stati Imbricated rottami utilizzando una curetta grazia a rimuovere la membrana parodontale. Sono stati fissati in formalina neutra al 10% per 12 ore, e decalcificate usando la soluzione di decalcificazione Plank-Rychlo per 2 settimane. Le corone dentali sono state rimosse ei denti sono stati sezionati lungo la superficie della radice in pellicole dentali su 5 × 5 mm 2 in termini di dimensioni e 1-1,5 mm di spessore. I film sono stati lavati per 2-3D quindi immersi in una soluzione di D-Hank contenenti doppi antibiotici penicillina-streptomicina a 4 ° C prima dell'uso. Il JE cellule in sospensione diversi passaggi umano è stato inoculato con una densità di 5 × 10 5 cellule /ml sulle fette di root con il cemento superficie in piastre da 24 pozzetti, 2 o 3 fette per bene, e poste per 14 d in un 37 ° C 5% di CO 2 saturazione di umidità incubatore. Il mezzo è stato aggiornato 3 d tardi, e poi una volta al giorno
osservazione al TEM:. Fette Root stati raccolti 3, 5, 7, 9, 11, e 14 d dopo l'inoculo rispettivamente e fissati in glutaraldeide al 2% a 4 ° C per 2 h. fette Root, con il cemento superficie up, sono stati tagliati in piccoli pezzi di 5 × 1 × 1 mm post-fissate in acido osmico 1% a 4 ° C per 2 h, disidratarli etanolo, imbevuto con ossido di propilene a temperatura ambiente per 24 h, e incorporato in Araldite. I campioni incorporati sono stati tagliati a fette ultrasottili, che sono stati macchiati con citrato di piombo, seguita da osservazione tramite TEM (PHILIP CM-120, Olanda) per monitorare la formazione di JE cells fissaggio su una superficie cemento.
Risultati
morfologica analisi dei tessuti epiteliali gengivali umani
Sotto il microscopio, JE è stato breve e strip-come, a poco a poco addensato dalla giunzione smalto-cemento per il coronale. Dopo aver macchiato con SE, senza cheratinizzazione o creste epiteliali esistevano nel tessuto JE che è stato diviso in strato basale e strato soprabasale, mentre le creste epiteliali cheratinizzate o epitelio partially cheratinizzata, dense e irregolari sporgenti in tessuto connettivo adiacente sono stati trovati in scuro macchiato di SE e OGE tessuti (Figura 3A). Inoltre, le cellule JE erano diversi da SE e OGE nella morfologia e aveva chiaro confine con SE (Figura 3B). Le cellule in tessuti JE erano uniformi in forma piana o mandrino, allineati parallelamente alla superficie del dente e le giunzioni cellulari erano allentate con spazio intercellulare evidente. Tuttavia, le cellule SE e OGE sono stati tutti i poligoni irregolari e strettamente allineati con meno o addirittura nessuno spazio intercellulare. Inoltre, le cellule JE erano abbondanti in organelli e il nucleo era grande, e allo stesso modo, i nuclei delle cellule SE e OGE erano anche grandi, ma ipercromatico. Inoltre, le cellule SE e OGE presentati caratteristiche strutturali tipiche delle cellule squamose e potrebbero reciprocamente trasformare senza confini chiari. Figura 3 HE colorazione del tessuto gengivale umano. R. La regione tra le frecce è JE (x150); B. Il confine tra JE e SE, la freccia indica il confine (X1200).
Secondo le misurazioni per l'analisi delle immagini, il tessuto JE era 1.021 ± 0,128 millimetri di larghezza, 0.066 ± 0,009 millimetri di spessore, e 0,042 ± 0,002 mm 2 nella zona, mentre, la SE era 0,532 ± 0,176 millimetri di larghezza (Tabella 1).
analisi morfologica delle colta gengivali umana JE e OGE cellule in vitro
al fine di osservare le cellule JE in modo chiaro e identificare le caratteristiche, le cellule JE e OGE sono state coltivate in vitro. Come risultato, inizialmente seminate cellule primarie JE presentati diversi morfologia, come poligonali piatta, fusiforme, ovale e sferica. Dopo 24-96 ore di incubazione, le cellule aderito al fondo capsula di Petri, il citoplasma diventata scura, la membrana era agitato, e 2-3 cellule piega sono stati completamente allungato. I nuclei sono grandi e comunemente 2 a 3 nucleoli in ogni cella. Dopo 7 d, celle a poco a poco è entrato in periodo di crescita rapida ed estesi lungo il bordo capsula di Petri al centro. mitosi e cellule cloni sparse con morfologia angolare o fusiforme apparso come mostrato in figura 4A. Dopo 10-12 d, cloni di cellule con morfologia diversificata, formato non uniforme formate chiazze confluenti (Figura 4B). Nel primo passaggio, cellule rispettate fondo piatto e stirate in 24-48 ore dopo l'inoculazione, allora le cellule presentati morfologia simile con cellule primarie; Nel secondo passaggio, le cellule hanno mostrato JE morfologia irregolare come pseudopodi 'cellule giganti', e vacuolizzazione citoplasmatica (Figura 4C); Nei seguenti passaggi, la morfologia era più irregolare e la proliferazione delle cellule sembrò rallentare, anche presenting invecchiamento e la morte segni (Figura 4D). Figura 4 L'osservazione di JE e OGE morfologia delle cellule (cellule primarie). cloni cellulari A. JE formate (la freccia × 200); B. A 10-12 d, cellule JE presentati morfologia non uniforme e la disposizione sparsi (× 200); C. Il 3 ° passaggio JE celle multiple è apparso 'cellule giganti "(la freccia × 200); D. Il 5 ° passaggio cells JE ha mostrato segni di invecchiamento e la morte (× 400); E. i cloni di cellule OGE formate e ampliato (la freccia × 200); F. A 7-9 d, le cellule OGE presentato morfologia uniforme, arrangiamento stretto, e 'pavimentazione in pietra-like' cheratinizzanti (× 200); G. Nella 3 ° passaggio è apparso cellule OGE 'cellule giganti' (× 200); H. Il 7 ° passaggio cells OGE ha mostrato segni di invecchiamento e la morte (× 400)
Come le cellule OGE, inizialmente seminate cellule primarie hanno presentato forme poligonali o sferiche e rispettate il fondo piatto entro 24-72 ore.; Dopo 5 d, cloni formati con morfologia triangolare o poligonale, tuttavia, queste cellule erano più uniforme rispetto ai cloni cellulari JE dello stesso periodo (figura 4E); Dopo 7-9 d, i cloni OGE ingrandite e convergenti, poi ermeticamente organizzato e ha mostrato tipico 'pavimentazione in pietra-like' cheratinizzazione (Figura 4F); Dopo 9-11 d, le cellule sono state circa il 100% confluenti; Nel secondo passaggio, le cellule rispettate e stirate in 48 h. E poi apparvero le "cellule giganti '(figura 4G); Dopo essere stato diversi passaggi per 4 volte, le cellule erano principalmente 'cellule giganti' e la proliferazione rallentato anche con l'invecchiamento e la morte segni (Figura 4 ore).
Dopo di che, le cellule JE e OGE sono state colorate con SE e osservati al microscopio. Come risultato, le cellule JE apparivano diverse morfologia (-fusiforme, triangolare, ovale), formato non uniforme, disposizione rilassata, grandi e scuri nuclei macchiati e più divisioni nucleari come menzionato sopra (Figura 5A). Tuttavia, le cellule OGE erano uniformi in dimensioni, ben disposte, tipicamente cheratinizzate, e con nuclei rotondi al centro, così come divisioni nucleari visibili (Figura 5B). Pertanto, JE erano significativamente differenti da OGE nella morfologia delle cellule. Figura 5 H & amp; E colorazione delle cellule JE e OGE (cellule secondo diversi passaggi, H & amp; E × 400). cellule A. JE attuale non uniformi in termini di dimensioni e morfologia, disposizione sparse, grandi e profondamente-macchiati nuclei e più divisioni nucleari; cells B. OGE erano uniformi per forma e dimensioni, ben organizzato, e 'pavimentazione in pietra-like' cheratinizzanti. condizioni
crescita delle cellule JE e OGE coltivate in vitro
Analizziamo poi le condizioni di crescita di queste due cellule. Ci sono stati più cellule coltivate OGE rispetto al JE. Come risultato, il periodo di incubazione le cellule JE attaccare e proliferare era 1-7 d in vitro, mentre per le celle OGE era 1-3 d, un po 'più corto. La fase logaritmica e la crescita di picco delle cellule JE apparso nella 8 th - 12 th d (durano solo per 5 giorni), mentre di OGE è stato 4 - 11 th d (8 giorni). Dopo 12 d, cellule JE e OGE erano entrambi entrati in un periodo di stagnazione. Inoltre, il numero di cellule JE è cresciuto da 6 × 10 4 /ml a 12 × 10 4 /ml in 9-12 giorni, e cellule OGE è passata da 7 × 10 4 /ml a 14 × 10 4 /ml durante 6-10 giorni. Secondo le statistiche, il tempo delle cellule raddoppio delle cellule JE era 48-60 h, mentre OGE era 72-96 h. Nel complesso, OGE mostrano curve più dolcemente di JE (Figura 6). Come mostrato in figura 7, cellule JE stati diversi passaggi con successo per 5 volte mentre OGE 7 volte nel presente esperimento. La qualità delle cellule JE diversi passaggi drasticamente diminuita dopo il 3 ° passaggio, ma dopo 4 th passaggio nelle cellule OGE. Figura 6 Curva crescita delle cellule JE e OGE. Le cellule JE erano in fase latente (1-7 d dopo l'inoculazione), fase esponenziale (8-12 d), e fase di plateau (12 d in seguito). cells OGE erano in fase latente (1-3 d dopo l'inoculazione), fase esponenziale (4-11 d), e fase di plateau (12 d in seguito).
Figura 7 numeri passaggio delle cellule e numero di celle per passaggio per JE e le cellule OGE. (Cellule del JE were diversi passaggi cinque volte. Le cellule OGE were diversi passaggi 7 volte).
Analisi immunoistochimica dei tessuti gengivali epitelio e cellule umani in coltura in vitro
Al fine di identificare a fondo le caratteristiche funzionali di JE, diversi CK sono stati analizzati. Nei tessuti epiteliali gengivali umani, l'espressione di CK5 /6 e CK20 era simile anche se CK5 /6 era più forte macchiato. Erano positivo macchiati nello strato soprabasale (specialmente vicino alla superficie) e negativo macchiato nello strato basale; L'espressione di CK7 e CK17 è stato negativo o solo debolmente positivo in pochissime cellule; In CK10 /13 e CK16, sono state espresse in tutti gli strati JE ma solo nello strato soprabasale di OGE e SE; L'espressione di CK10 /13 era forte e positiva CK16 era debole positivo o positivo; CK19 è stato rilevato in tutti gli strati JE con forte espressione positiva, mentre la sua espressione in OGE e SE era limitata allo strato soprabasale e alcuna colorazione è stata osservata nello strato basale. Il confine tra JE e SE era chiaramente dovuta alla differenza di CK19 colorazione; Il pattern di espressione di CK8 /18 era ad un livello inferiore che era simile al CK19 tranne lo strato basale OGE e SE. Inoltre, anche mostrato espressione debole positivo nello strato soprabasale (vicino allo strato basale) in alcune fette. Le descrizioni dettagliate erano in Tabella 2 e Figura 2 8.Table Espressione modello di diverse cytokeratins in JE, OGE, e SE
anticorpo
CK
campione n. (N)
fetta no. (N)
JE
OGE
SE
b
sb
b
sb
b
sb
D5/16B4
5/6
6
20
-
++
-
+
-
+
OV-TL12/30
7
6
10
-
-
-
-
-
-
Zym5.2
8/18
6
15
++
++
+
-*
+
-*
DE-K13
10/13
6
20
+++
+++
-
+++
-
+++
LL025
16
6
18
+
+
-
++
-
+
E3
17
6
11
-
-
-
-
-
-
A53/BA2
19
6
10
+++
+++
+++
-
+++
-
Ks20.8
20
6
14
-
+
-
+
-
+
Nota: B: strato basale, SB: strato soprabasale, -:. Negativo, +: debole positivo, ++: moderato positivo, +++: fortemente positivo, *: espressione positiva deboli nello strato soprabasale in alcune fette
Figura 8 immunoistochimica macchia di tessuti gengivali umani (× 100). La colorazione contro diversi citocheratine è stata eseguita. A. CK5 /6; B. CK7; C. CK8 /18; D. CK10 /13; E. CK16; F. CK17; G. CK19; H. CK20; tessuto gengivale I. umano è stato utilizzato come controllo negativo; J. tessuto parotide umano è stato utilizzato come controllo positivo.
In cellule in coltura, sia le cellule JE e OGE sono state colorate positivamente per CK-Pan (Figura 9A, B). colorazione fortemente positiva di CK19 è stata osservata nelle cellule JE (Figura 9C), ma solo un piccolo numero di cellule OGE sparse erano macchiati positivo (Figura 9 quinquies); Il CK10 /13 macchia di entrambe le cellule JE e OGE erano deboli positivi o positivi (Figura 9E, F); Inoltre, le due cellule tipi erano sparsi macchiati positivamente con CK16 (figura 9G, H). I controlli negativi non sono state colorate in tutte le condizioni (Figura 9I, J). Figura 9 colorazione immunoistochimica di cellule JE e OGE (cellule di secondo passaggio, SP × 400). cellule A. JE, CK-Pan positivo; cellule B. OGE, CK-Pan positivo; cellule C. JE, CK19 fortemente positivo; D. cellule OGE, CK19 in un piccolo numero di cellule positive sparse; E. JE cellule, CK10 /13 debolmente positivo a positivo; F. OGE cellule, CK10 /13 debolmente positivo a positivo; cellule G. JE, CK16 sparsi positivo; cellule H. OGE, CK16 sparsi positivo; cellule I. JE, controllo negativo; cells J. OGE, controllo negativo.
osservazione TEM della formazione di JE cells attaccamento alla radice fette
Infine, la formazione di attacco tra le cellule JE e superficie del dente è stato studiato da un modello di co-coltura. cells JE e fette di radice sono stati co-coltura in vitro. Poi sono state osservate cellule JE sulla superficie cemento umana. Tre giorni dopo l'inoculazione, le cellule erano sferici e non completamente allungato (Figura 10A); Cinque giorni dopo, il numero di cellule JE sulla superficie cemento aumentata e una porzione di cellule sono state allungato (Figura 10B); Alle 7 d, le cellule sono state completamente JE allungati per essere piatta-forma, attaccato alla superficie cemento con membrana cellulare, ma non sembra chiaro membrana basale e le strutture emidesmosoma-simili (Figura 10c); Alle 9 d, cellule JE sembrava avere un piccolo numero di depositi di elettroni ad alta densità come emidesmosoma a livello della membrana cellulare locale collegato alla superficie di cemento (frecce, figura 10D); A 11-14 d, c'era un numero significativamente maggiore di cellule in fettine di radice, e le cellule multistrato apparso (Figura 10E). Inoltre, un gran numero di depositi elettroni dense presentava membrana cellulare-cemento giunzione superficiale. Infine, membrana basale-like e strutture emidesmosoma simili si sono formati (frecce, figura 10F). Figura 10 osservazioni TEM della formazione strutturale di JE cellule fissaggio su una superficie cemento. R. In 3 d, c'era un piccolo numero di cellule sulla superficie cemento, cellule erano sferica, non allungare (TEM × 13500); B. A 5 d, cellule sulla superficie cementum aumentato di numero, ed una porzione di cellule allungato (TEM × 9700); C. A 7 d, cellule completamente sono allungati per essere a forma piatta, e attaccato alla superficie cemento, ma non ha forma chiara strutture membrana basale-like e emidesmosoma-like (TEM × 24500); D. Alle 9 d, cellule JE sembrava avere un piccolo numero di depositi di elettroni ad alta densità come emidesmosoma a livello della membrana cellulare locale collegato alla superficie di cemento (frecce, TEM × 33000); E. A 11-14 d, c'è stato un aumento significativo del numero di cellule sulla superficie cemento, e le cellule multistrato è apparso (TEM × 7400). F. un gran numero di depositi di elettroni ad alta densità (frecce) presentava nel JE membrana cellulare-cemento giunzione di superficie, formando le strutture membrana basale-like e emidesmosoma-like (TEM × 46000).
Discussione
JE è un tessuti unici umani gengivale epitelio
Secondo l'osservazione di tessuti, abbiamo scoperto che JE tessuto normale umano apparteneva alla semplice epitelio stratificato. Le cellule erano uniformi in forma, relativamente più bassi nella differenziazione, senza cheratinizzazione e creste epiteliali in vivo. Questo è probabilmente dovuto alla sua posizione nella parte inferiore del solco gengivale, attaccamento superficie del dente e raramente sottoposti a stimoli esterni. Tuttavia, SE e OGE sono esposti all'ambiente cavità orale presentano caratteristiche tipiche di cellule epiteliali squamose. Erano del poligono in forma, ben allineata, cheratinizzata nello strato superficiale con creste epiteliali dense, che proiettate nel tessuto connettivo, e presentano un confine netto con JE. In esperimenti preliminari, creste epiteliali sono stati osservati anche in JE di atrofia gengivale o tasche parodontali. Questi suggeriscono che la stimolazione esterna e infiammazione può portare alla formazione di creste epiteliali. Inoltre, i risultati di analisi di immagine mostrato che JE era solo di circa 1 mm di lunghezza, 60 micron di larghezza e 15 a 20 strati di cellule in profondità. Questo risultato ha mostrato che il volume del tessuto JE era estremamente piccola e difficile da raccogliere, che è uno dei principali motivi per cui JE è difficile da studiare. D'altro canto, le cellule JE e OGE sono stati isolati e coltivati in vitro. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.
