Abstract
sfondo
Il ruolo dei glicoconiugati superficie cellulare in orale malattia della mucosa graft-versus-host (GVHD) è ancora chiaro, anche se i cambiamenti molecolari nel dell'epitelio orale sono essenziali per la patogenesi di queste lesioni. In questo studio, abbiamo studiato i cambiamenti nel legame di mannosio (Man) Lens culinaris SPECIFICI
lectina (LCA) nella mucosa orale di ratti con GVHD.
Metodi
cellule della milza di ratto Lewis sono state iniettate in ( Lewis x Brown Norvegia) F
1 ratti per indurre GVHD sistemica, tra cui lesioni della mucosa orale. campioni di lingua e milza sono stati valutati usando istochimica lectina, immunoistochimica, Western blotting, transwell saggi di migrazione e Stamper-Woodruff saggi di legame.
Risultati
Binding of Man-specifica LCA ampliato agli strati epiteliali della lingua in GVHD-ratti . Un'espansione di LCA legame era legato alla aumentata espressione di mannosyltransferase nella mucosa orale. CD8 + cellule, cellule effettrici di GVHD mucosa orale, ha espresso il mannosio-binding protein (MBP) e migrato al mezzo contenente uomo nel test di migrazione transwell. L'aderenza del CD8 + cellule dell'epitelio orale potrebbe essere inibita dal pretrattamento + cellule CD8 con anticorpi MBP e /o pretrattamento sezioni con l'uomo-specifica LCA.
Conclusioni
aumentata espressione di Man on cheratinociti porta alla migrazione e /o adesione di cellule CD8 + nell'epitelio di superficie, che viene mediato in parte dal percorso MBP /Man-binding durante lo sviluppo di GVHD mucosa orale.
Parole
Graft versus host disease Lens culinaris
lectina proteine mannosio vincolante CD8 + linfociti materiale supplementare elettronica
La versione online di questo articolo (doi:. 10 1186 /1472-6831-14-5) contiene supplementare materiale, che è disponibile per gli utenti autorizzati.
Sfondo
malattia del trapianto contro l'ospite (GVHD) è una complicanza che può verificarsi dopo un cellule staminali ematopoietiche o trapianto di midollo osseo, che le cellule del donatore di recente trapiantate attaccano il trapianto il corpo del ricevente. GVHD è caratterizzata da infiammazione selettivo epiteliale che colpisce gli organi mucocutanee, tratto gastrointestinale, e il fegato [1]. Entrambi gli studi clinici e sperimentali hanno identificato mucosa orale come uno dei siti critici affetti da GVDH [2, 3]. cambiamenti istopatologici di GVHD mucocutanea includono satellitosi, in cui linfociti grappoli si formano attorno dyskeratotic e /o cheratinociti necrotici (KCS). Linfociti, soprattutto CD8 + cellule, la migrazione da nell'interstizio perivascolare nello strato epiteliale sovrastante e indurre alterazioni degenerative KC, suggerendo che determinare la natura della distruzione KC può essere di aiuto nella comprensione della patogenesi della GVHD mucocutanea [4]. Durante questo processo, espressione di molecole specifiche, come MHC di classe II e ICAM-1 (ICAM-1), si verifica in epiteliale KCs di interagire con le cellule effettrici [5-8]. In particolare, aumentata espressione di ICAM-1 in KCs porta alla migrazione di cellule effettrici nell'epitelio superficiale, che è mediata in parte dal percorso di ICAM-1 /linfociti Function-associated Antigen-1 (LFA-1) [3].
I recenti progressi nella glycobiology ha rivelato che glicoconiugati di superficie cellulare svolgono un ruolo essenziale in eventi di riconoscimento. sonde lectine sono tipicamente utilizzati per rilevare glicoconiugati di superficie cellulare, perché lectine sono definiti come vincolanti carboidrati proteine diverse da enzimi o anticorpi (Abs) [9]. Essi sono coinvolti in diversi processi biologici in molte specie, come la clearance di glicoproteine dal sistema circolatorio, l'adesione di agenti infettivi per ospitare le cellule, di reclutamento dei leucociti ai siti infiammatori, e le interazioni delle cellule del sistema immunitario in collaborazione con tumori maligni e metastasi [ ,,,0],9]. Il legame lectina viene modificata durante il processo di differenziazione epiteliale e la stimolazione lesioni della pelle e della mucosa orale [10-13]. Tra tali lectine, Lens culinaris
lectina (LCA), noto come legante mannosio (Man), possiede specificità di legame unici, con un nucleo biantennary di 1,6-fucosylated oligosaccaridi e glicani di transferrina siero umano e α-fetoproteina [ ,,,0],14]. superficie cellulare L'uomo è anche un ligando per il mannosio-binding protein (MBP), che funziona in opsonizzazione di microrganismi per fagociti e cellulo-mediata attività citotossicità-antitumorale [14, 15]. Questi studi hanno portato all'ipotesi che i cambiamenti determinanti espressione Man on KCs di aiuto nella comprensione della patogenesi della GVHD mucosa orale. Il nostro approccio a questa premessa è stata quella di concentrarsi su Man espressione sulla superficie cellulare da KC e la sua interazione con il MBP nel ratto della mucosa orale GVHD dei ratti. Il nostro studio ha avuto tre obiettivi: (1) per determinare Man espressione sulla superficie cellulare da KC con Man-specifici LCA, (2) per verificare se CD8 + cellule, cellule effettrici in GVHD mucosa orale, la migrazione a un uomo contenenti media, e (3) per determinare se l'uomo l'espressione da KC media legame di MBP-esprimono CD8 + cellule a KC. I risultati indicano che, durante lo sviluppo di GVHD mucosa orale nel ratto, aumentata espressione di Man KCs porta alla migrazione e /o adesione di CD8 + cellule nell'epitelio superficiale, mediato in parte dal MBP /Man-binding percorso.
Metodi
Ratti
femmina adulta inbred Lewis (Lew, RT1 l) e Lewis × Brown Norvegia F 1 ibrido (LBNF 1, RTL 1 /n) i ratti del peso di 250 a 350 grammi sono stati acquistati da Kyudo Co. (Saga, Giappone). Gli studi su animali sono stati condotti secondo protocolli approvati dal Comitato di cura e l'uso di animali di Fukuoka Dental College.
Induzione di GVHD
milze rimosse da ratti LEW sono stati sezionati in soluzione Hanks ', forzato attraverso un setaccio in acciaio inox, e filtrata attraverso una rete di nylon (Filtri in cella, BD Biosciences, CA, USA). Le cellule sono state lavate tre volte in soluzione Hanks 'e risospese in 10 8 /ml in mezzo RPMI-1640 con 10% di siero fetale di vitello. La vitalità cellulare è stata determinata mediante trypan analisi esclusione blu. GVHD è stato indotto da un'iniezione intraperitoneale 3 ml di 3 × 10 8 celle in LBNF 1 ratti. Non trattati LBNF 1 ratti e LBNF 1 ratti iniettati con un numero uguale di singenici LBNF 1 splenociti sono stati utilizzati come controlli. Tutti i ratti sono stati pesati tutti i giorni e attentamente osservati per i segni clinici della malattia
. Valutazione della GVHD
La valutazione clinica di GVHD è stato determinato dalla perdita di peso e lo sviluppo dell'eritema cutaneo o delle mucose, in particolare sulle orecchie, mucosa nasale, piede -pads, e labbra. Entrambe le condizioni cliniche apparse il giorno 10 dopo l'iniezione e sono diventati gravi in seguito. Un saggio di peso della milza è stata eseguita presso l'autopsia per confermare la valutazione immunologica di GVHD. Dopo il giorno 10, i topi sperimentali hanno dimostrato notevole splenomegalia come una sovraespressione della risposta immunitaria GVHD legati [16]. Tutti gli animali di controllo sono sopravvissuti e sono apparsi in buona salute.
Preparazione dei tessuti
tutta la lingua è stato asportato 1-21 giorni dopo l'iniezione da cinque animali in ciascun gruppo di trattamento. Metà dei campioni lingua sono stati fissati in paraformaldeide al 4% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). sezioni di paraffina (4 micron) sono state poi colorate con ematossilina e eosina (H & amp; E) per esaminare i cambiamenti istopatologici. L'altra metà è stato immediatamente congelato in azoto liquido, e sezioni congelate di serie sono stati utilizzati per immunostaining, lectina istochimica, e in vitro
saggi di adesione
. Lectina istochimica
LCA, Ulex europaeus
I (UEA- 1), e Archis hypogaea
(arachidi: PNA) sono stati utilizzati per il rilevamento di α-D-Man, α-L-fucosio, e galattosio β1,3galactosamine, rispettivamente (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, stati Uniti d'America ). vincolanti LCA è stato rilevato utilizzando la Alexa Fluor 568 - metodo biotina streptavidina etichettati. sezioni congelate fissate in acetone sono state incubate con LCA biotinilato (25 mg /ml; Vector Laboratories) per 30 minuti e Alexa Fluor streptavidina 568-marcato (1: 400; Molecular Probes, Eugene, OR, USA) per 30 minuti a temperatura ambiente. controlli istochimiche sostituiti LCA non coniugato per il coniugato LCA-biotina e reazione con LCA biotinilato inattivato dal suo inibitore zuccheri specifici (D-mannosio, 2 mm, EY Laboratories, Inc., San Mateo, CA, USA)
immunoistochimica Abs utilizzati in questo studio sono stati i seguenti: (a) un anticorpo policlonale di coniglio Ab contro ALG11, reattivo con mannosyltransferase (1: 300; Novus Biologicals, Littleton, CO, USA), (b) un coniglio policlonale Ab contro LMAN2, reattivo con MBP 2 (1: 100; Aviva Systems Biology, San Diego, CA, USA), (c) un anticorpo monoclonale del mouse Ab contro 1A29, reattivo con ICAM-1 (1: 100; Cederlane Lab, Ontario, Canada.), e ( d) un anticorpo monoclonale del mouse Ab contro OX-8, reattivo con CD8 (1:. 100; Cederlane Lab). sezioni congelate fissate in acetone sono stati incubati con siero di coniglio normale per ridurre il legame non specifico e poi fatto reagire con una delle Abs, overnight a 4 ° C. Le sezioni sono state poi incubate con fosfatasi alcalina coniugato anti-coniglio Ab o anti-topo Ab (1: 150 diluizione; Dako, Tokyo, Giappone) per 45 min a temperatura ambiente. reazioni immunoistochimiche sono state visualizzate usando 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato /nitro blu tetrazolio soluzione di cloruro (soluzione BCIP /NBT; Dako). Come controllo, le sezioni sono stati trattati con IgG di coniglio normale al posto della prima serie di Abs.
Western blotting
proteina totale è stato estratto da milza e lingua esemplari in ratti di controllo o GVHD utilizzando tampone di lisi cellulare ghiacciata (20 m m Tris-HCl, pH 7.5; 150 mMNaCl; 1 mM acido etilendiamminotetraacetico [EDTA]; 1 mM Na 2EDTA; 1 mM acido glicole etilenico tetraacetico; 1% [v /v] Triton-X 100; 2,5 mM di sodio pirofosfato; 1 mMβ-glicerofosfato; 1 mM Na 3VO 4; e 1 mg /ml leupeptina e phenylmethylsulfonyl fluoro). La stessa quantità di proteine (20 mg) erano separati da dodecil solfato di sodio-SDS-PAGE (SDS-PAGE; 12% di separazione gel). Dopo l'elettroforesi, le proteine sono state trasferite alle membrane difluoruro di polivinilidene (Bio-Rad Laboratories, Tokyo, Giappone). I blot sono state bloccate con 1% di caseina in soluzione salina tamponata con Tris (TBS) contenente 0,1% Tween-20 (TBS-T) per 1 ora a temperatura ambiente e poi incubate con anticorpi primari notte a 4 ° C. Abs primaria contro LMAN2 (descritta in precedenza) e β-actina (Sigma-Aldrich) sono stati utilizzati. Le membrane sono state lavate in TBS-T e incubate con rafano secondario marcato con perossidasi Ab per 1 ha temperatura ambiente. complessi Ab Bound sono stati rilevati da chemiluminescenza (Bio-RadLaboratories).
Isolamento di cellule CD8 + dalla milza di GVHD-mediata ratti
CD8 + cellule di ratto GVHD sono stati utilizzati nei test di migrazione transwell e Stamper- Woodruff vincolante saggi. I linfociti sono stati presi in giro dalla milza, esibendo splenomegalia, di ratti GVHD e sospese in un mezzo RPMI-1640 a 4 ° C. Le cellule sono state disperse dalla rapida, pipettaggio in-out, ed i grumi di cellule sono stati rimossi dal passaggio attraverso una rete di nylon (Setacci cellulare; BD Biosciences). La cella singola sospensione risultante è stato lavato tre volte nello stesso mezzo e risospese ad una concentrazione di 3 × 10 7mononuclear cellule /ml. CD8 + cellule dalla sospensione sono state isolate dalla purificazione perla magnetica utilizzando microsfere Miltenyi CD8a secondo il protocollo del produttore (Miltenyi Biotec, Tokyo, Giappone).
Transwell test di migrazione per le cellule effettrici
migrazione di CD8 + dalla GVHD-milza sono stati valutati in un sistema di inserimento transwell® in cui i pozzi superiore e inferiore sono stati separati da una membrana di policarbonato (dimensione dei pori a 3 micron, Corning, NY, USA). CD8 + cellule, pre-incubati o meno con anti-MBP Ab (50 ug /ml), sono state seminate ad una densità di 5 × 10 4 cellule /pozzetto su 3 micron inserti transwell. La camera inferiore è stato riempito con 500 microlitri terreno RPMI solo o medium contenente Man (2 mM), una miscela di Man e LCA (50 ug /ml), o galattosio (Gal, 2 mM; EY Laboratories). Le cellule sono state incubate per 4 ore a 37 ° C (5% CO 2) e quindi colorate con Diff-Quick (Sysmex Corp., Hyogo, Giappone). attività migrazione è stata valutata come la migrazione percentuale di cellule dalla camera superiore del transwell inserire alla camera inferiore in tre campi ad alta potenza (100x) per pozzetto. L'esperimento è stato condotto in triplicato.
Stamper-Woodruff binding assay (SWBA)
Stamper-Woodruff-tipo saggi congelato sezioni sono state eseguite come descritto in precedenza [3]. In breve, aliquote contenente 2,5 × 10 sono stati aggiunti 5 isolate cellule CD8 + in 200 ml di RPMI-1640 per tagliare fresco (8 micron) sezioni congelate della lingua ottenuto da ratti nei gruppi di controllo e di GVHD. Le sezioni sono state agitate in un agitatore rotativo (60 rpm) per 60 min a temperatura ambiente. Successivamente, la sospensione cellulare è stato accuratamente decantato, e le cellule aderenti alle sezioni sono stati fissati con glutaraldeide al 2,5% in PBS per 5 min. I vetrini sono stati poi lavati in PBS e colorate con blu di toluidina 0,5%. Il numero di cellule + aderenti CD8 è stata determinata dalla luce l'esame al microscopio dei campi a 200 × ingrandimenti (Ogni campo ad alta potenza rappresenta circa 400 micron dell'epitelio orale). Il numero di CD8 + cellule attaccate direttamente sopra KC (ma non nello strato corneo) è stato contato. Parecchi esperimenti di blocco sono state effettuate come segue: (a) sezioni congelate di lingua di ratti GVHD sono state incubate con 25 ug /ml di LCA, PNA o UEA-I per 30 minuti a temperatura ambiente dopo una breve lavaggio con PBS, e quindi aggiunto linfociti; (B) cellule CD8 + sono state preincubate con 50 ug /ml di MBP Ab per 30 minuti a temperatura ambiente, prima che l'intera miscela di reazione viene trasferito su sezioni congelate dei GVHD-lingue; (C) i due approcci sono stati utilizzati contemporaneamente, vale a dire, CD8 + cellule sono state trattate con MBP Ab e le sezioni di tessuto sono stati trattati con MBP. I risultati sono calcolati come la percentuale di rispetto per controllare linfociti e sezioni di tessuto esposti per tamponare solo vincolante.
Analisi statistica
analisi statistica è stata eseguita con analisi della varianza ad una via (ANOVA) e test per confronti multipli di Scheffé per determinare statistico differenze tra i campioni. I dati sono presentati come media ± deviazione standard (SD) e P
valori di & lt; 0,05 sono stati
considerato statisticamente significativo. Risultati
orale GVHD mucosa è caratterizzata da ICAM-1 e CD8 + cellule T si infiltra
In primo luogo abbiamo esaminato se le caratteristiche di immunoistochimica potrebbe essere rilevato nella mucosa orale durante lo sviluppo di GVHD . In lingue di controllo non trattati, non cambiamenti istologici sono stati osservati con H & amp; E colorazione (Figura 1a). ICAM-1 è stato limitato a endoteliali e cellule perivascolari dei vasi sanguigni (Figura 1c). Solo sono state osservate alcune cellule CD8 + nella lamina propria e l'epitelio orale (Figura 1e). I risultati erano gli stessi in sezioni di tessuto prelevati da ratti sperimentali 8 giorni dopo l'iniezione. Tuttavia, 10 giorni dopo l'induzione di GVHD in LBNF 1 ratti, sono stati osservati cambiamenti sia istologici e immunoistochimici nelle lingue. H & amp; E colorazione rivelato lesioni tipiche di GVHD acuta muco-cutanea, indicando eosinofila degenerazione citoplasmatica e necrosi di epiteliale KC (il cosiddetto satellitosi) derivante dalla infiltrazione di linfociti intraepiteliali (Figura 1b). ICAM-1 è stata osservata nel basale strato spinoso dell'epitelio (Figura 1d) e il numero di CD8 + cellule aumentato nella lamina propria della lingua (Figura 1f). Inoltre, queste cellule sono state infiltrate nella epitelio di superficie in cui KC epiteliali sono state colorate con anti-ICAM-1 Ab. Figura 1 espressione immunoistochimica della molecola di adesione intercellulare-1 (ICAM-1) e CD8 + in graft-versus-host disease (GVHD) -related mucosa orale. A e B: sono osservati cambiamenti evidenti in ematossilina ed eosina (H & amp; E) -stained sezioni di controllo della lingua (a). In sezioni di tessuto linguetta di ratti GVHD, si osserva la distruzione epiteliale (b). ced: In lingua provini da ratti di controllo, ICAM-1 è espresso solo nelle fessure vascolari (frecce) (c). Epiteliale ICAM-1 è osservata nel basale strato spinoso della mucosa orale ratti GVHD (d). e ed f: cellule Solo pochi CD8 + si trovano nel controllo (e). Nei ratti GVHD, aumento del numero di cellule CD8 + sono osservati sia lamina propria e la superficie dell'epitelio (f). La linea tratteggiata indica una giunzione tra l'epitelio superficiale e lamina propria della lingua. Bar = 100 micron.
Alterazioni nel legame LCA in mucosa orale GVHD
Per chiarire se l'espressione istochimiche di superficie cellulare L'uomo sul epiteliale KC è influenzata dallo sviluppo di GVHD, abbiamo esaminato LCA colorazione nelle lingue di controllo e ratti GVHD. vincolante LCA era limitato alla superficie cellulare del basale parabasal KCs nell'epitelio superficie delle alette da ratti di controllo (Figura 2a). Lo stesso pattern di colorazione è stato mostrato in sezioni di tessuto prelevati da topi sperimentali otto giorni dopo l'iniezione. Al contrario, il livello di LCA colorazione esteso agli strati spinosi dell'epitelio superficie di 10 giorni dopo l'iniezione, indicando che oligosaccaridi su KCs potrebbero essere modificati durante lo sviluppo di GVHD (Figura 2b). Inoltre, il modello estensione del LCA colorazione era identico a quello di ICAM-1. Figura 2 Lens culinaris lectina (LCA) vincolanti nella malattia del trapianto contro l'ospite (GVHD) mucosa orale. LCA vincolante si verifica sulla superficie cellulare delle cellule basali di parabasali in lingue controllo (a). Colorazione estende agli strati spinosi dell'epitelio superficie ratti GVHD (b). La linea tratteggiata bianca circoscrive lo strato epiteliale superficie della lingua. Bar = 100 micron.
Aumentata espressione di complesso mannosyltransferase in GVHD mucosa orale
Abbiamo poi esaminato l'espressione immunoistochimica del complesso mannosyltransferase, utilizzando ALG11 Ab, in lingue da entrambi i ratti di controllo e GVHD, di chiarire se la mannosyltransferase potrebbe essere responsabile della somma dell'uomo sulla oligosaccaridi KCs durante lo sviluppo di GVHD. In lingua normale, ALG11 legato debolmente e /o debolmente al basale e parabasali KC dell'epitelio di superficie (Figura 3a). siti reattivi con ALG11 estese al citoplasma delle KC negli strati spinosi dell'epitelio di superficie nelle lingue di ratti GVHD (Figura 3b). La gamma reattivo con ALG11 sembrava essere identico a quello del LCA vincolanti, suggerendo che l'aumentata espressione di mannosyltransferase negli strati epiteliali può essere correlata alla vasta legame di LCA. Figura 3 rilevazione immunoistochimica del complesso mannosyltransferase in graft-versus-host disease (GVHD) -affected mucosa orale. ALG11, anticorpi (Ab) del complesso mannosyltransferase, è debolmente e debolmente reattivo in basali e cellule epiteliali parabasali delle lingue di controllo (a). In contrasto, colorazione con ALG11 estende ai cheratinociti (KC) negli strati spinosi di lingue di ratti GVHD (b). Bar = 100 micron.
MBP /Man vincolante percorso induce migrazione CD8 + cellule in vitro
per chiarire se la migrazione di CD8 + cellule è mediata dal pathway MBP /Man-binding, abbiamo esaminato l'espressione MBP in le lingue di ratti GVHD e il test di migrazione transwell per CD8 + cellule. In primo luogo, abbiamo esaminato la rilevazione immunoistochimica di MBP in sezioni di tessuto della lingua dalle GVHD-ratti. MBP + cells infiltranti sono stati osservati sia nel superiore lamina propria e la superficie dell'epitelio delle lingue (figura 4a). Abbiamo inoltre esaminato l'espressione della proteina di MBP nelle lingue e milza di controllo e di GVHD ratti mediante analisi Western Blot. Come mostrato in figura 4b, la quantità di accumulo MBP era marcatamente aumentato sia la lingua e milza di topi GVHD. In contrasto, l'espressione di proteine MBP era debole o negativo sia nella lingua e milza di ratti di controllo (Figura 4b). Questi risultati suggeriscono che MBP può essere indotto sulle cellule effettrici GVHD legate all'alimentazione e MBP sulle cellule effettrici possono reagire contro superficie cellulare Man of KC nelle lingue di ratti GVHD. Per verificare questa ipotesi, abbiamo eseguito la prossima transwell test di migrazione per le cellule effettrici. Come mostrato in figura 5, la migrazione cento di CD8 + cellule a Man aumentato drasticamente (77,9 ± 4,6) rispetto al controllo (1,7 ± 0,6). La percentuale migrazione di CD8 + cellule divenne più bassa nella camera inferiore contenente Man e LCA (8,3 ± 0,7) e Gal (1,5 ± 0,7). Inoltre, il CD8 migrazione + cella di Man è diminuita drasticamente (5,6 ± 0,4) quando le cellule sono state pre-incubate con anti-MBP Ab. Questi risultati indicano che la migrazione di CD8 + cellule per l'uomo è mediata dalla via MBP /Man vincolante. Figura 4 proteine mannosio-binding (MBP) espressione in lingua e milza esemplari di malattia del trapianto contro l'ospite (GVHD) ratti. cellule infiltranti sono espressi immunoistochimica con anticorpo anti-MBP (Ab) (a). Analisi Western Blot dei livelli MBP della lingua e della milza dal controllo e ratti GVHD (B). Sia lingua e la milza dai topi GVHD-mediata mostrano notevole reazione con MBP. β-actina (ACTB) è stato analizzato anch'esso come controllo di caricamento. Bar = 100 micron.
Figura 5 induzione di mannosio (Man) per la migrazione delle cellule CD8 +. la migrazione delle cellule CD8 + è stata esaminata dal saggio di migrazione transwell. L'uomo, uomo con Lens culinaris
lectina (LCA), o galattosio è stata posta nella camera inferiore bene. I pozzetti della camera superiore ricevono isolato CD8 + cellule, pretrattati o meno con anti-mannosio-binding protein (MBP) anticorpo (Ab). RPMI è stato utilizzato come controllo negativo. La figura rappresenta i risultati di tre diversi esperimenti espressi come media ± deviazione standard. Gli stessi simboli indicano differenze statisticamente significative. Altri, significativamente diversi in P
& lt; 0.05.
Anti-MBP Ab e LCA inibire l'adesione delle cellule CD8 + a KC in campioni lingua di ratti con GVHD
Nel modello di ratto GVHD, cellule effettrici possono legarsi a lesionali KC dalla ICAM-1 /LFA-1 percorso [3]. Abbiamo eseguito SWBA utilizzando cellule CD8 + e /o cellule epiteliali orali prelevati da topi con GVHD, di fornire la prova di un ruolo diretto della via MBP /Man-binding nel legame di CD8 cellule + per epiteliale KC . Pretrattamento delle sezioni di tessuto preparate dalla mucosa orale con PNA e UEA-I non ha avuto effetto, considerando LCA diminuita adesione dei linfociti del 42,3% del valore di controllo (Figura 6). Quando i linfociti da ratti con GVHD sono stati incubati con anti-MBP Ab, l'adesione dei linfociti per epiteliale KC è stata del 42,7% del valore di controllo (Figura 6). Quando i due approcci sono stati applicati simultaneamente, cioè, quando i linfociti sono stati trattati con anti-MBP Ab e le sezioni di tessuto sono stati trattati con LCA, l'adesione dei linfociti è stata diminuita a & lt; 40% del valore di controllo (Figura 6). Questi risultati indicano che l'adesione di CD8 + cellule per epiteliale KC è mediata in parte dal percorso MBP /Man vincolante. Figura 6 Effetto delle lectine e anticorpi proteina anti-mannosio-binding (MBP) (Ab) su adesione delle cellule CD8 + per l'epitelio orale in GVHD. Adesione delle cellule CD8 + per i cheratinociti orali (KCS) sono stati studiati da Stamper-Woodruff saggio (SWBA) vincolante. Il legame di cellule CD8 + era significativamente diminuito, quando le cellule sono state pretrattate con anticorpi anti-MBP Ab, così come quando epiteli sono stati pretrattati con Lens culinaris
lectina (LCA). La figura rappresenta i risultati di tre diversi esperimenti ed espresso come media ± deviazione standard. Gli stessi simboli indicano differenze statisticamente significative. Altri, significativamente diversi in P
& lt; 0.05.
Discussione
In questo studio abbiamo utilizzare il aploidentico allogenico F 1 ibrido modello di ratto per chiarire il ruolo di espressione sulla superficie cellulare dei residui di Man da KC in GVHD. Anche se questo modello non rappresenta direttamente il trapianto di cellule ematopoietiche in clinica umana, fornisce un sistema conveniente e geneticamente ben definite da cui partire per acquisire conoscenze sui meccanismi alla base dei danni tissutali immunomediate di tessuto epiteliale di accoglienza attraverso lo studio in vivo
interazioni tra KC e linfociti [17]. Presentiamo tre linee di prova a sostegno della conclusione che l'espressione sulla superficie cellulare di Man di KC svolge un ruolo nella migrazione e /o adesione di CD8 + cellule dell'epitelio durante lo sviluppo di GVHD. In primo luogo, un approccio istochimico lectina confermato che l'espressione sulla superficie cellulare di Man di KC è up-regolata nello sviluppo di GVHD. In secondo luogo, l'espressione della proteina e risultati della migrazione transwell hanno indicato che la migrazione CD8 + cella per l'uomo era legato ad una interazione tra MBP e l'uomo. In terzo luogo, CD8 adesione cellulare + dell'epitelio superficie della mucosa è stata mediata dal pathway MBP /Man vincolante come rivelato utilizzando SWBA.
Un up-regolazione di LCA vincolante sulla superficie cellulare di KC indica che la cellulo espressione di superficie di Man viene modificata durante lo sviluppo di GVHD mucosa orale. In GVHD mucocutanea, cambiamenti molecolari specifici verificano in KC per consentire la migrazione dei linfociti nello strato superficie epiteliale [7, 8, 18]. Un precedente studio ha segnalato che l'induzione di ICAM-1 espressione KCs porta alla migrazione di CD8 + cellule in epitelio e che questo processo è mediato in parte dal ICAM-1 /LFA-1 pathway [3] . I risultati qui presentati forniscono supporto aggiuntivo per i cambiamenti molecolari nel KC durante lo sviluppo di GVHD mucsal orale. Lo studio immunoistochimico di anti-ALG11 Ab ha riportato qui dimostra che Ab siti reattivi si espandono anche uno strato spinoso nell'epitelio superficie nella lingua GVHD. ALG11 è noto come alfa-1,2-mannosyltransferase in glicoproteina N-linked ed è localizzata al lato citosolico del reticolo endoplasmatico in cellule basali normale epiteli squamose [19]. Questi risultati suggeriscono che la vasta espressione del complesso mannosyltransferase può essere indirettamente responsabile per l'up-regolazione dell'espressione dell'uomo sulla superficie delle cellule del KC in lingua GVHD. I lavori futuri affronterà il motivo per cui l'espressione di mannosyltransferase complesso e uomo espandere durante lo sviluppo di GVHD.
Blot immunoistochimica e occidentale analisi presentate qui rivelano che le cellule effettrici della GVHD mostrano l'espressione di MBP utilizzando LMAN2 Ab, oltre a CD8. MBP, chiamato anche mannano-binding protein o lectina mannano vincolante, è un Ca2 + - dipendente (tipo C) animale lectina [20-22]. Un recente studio ha rivelato che questa proteina può visualizzare un effetto specifico sulla attivazione delle cellule T [23]. MBP si lega preferenzialmente ai carboidrati terminati con l'uomo, N-acetilglucosamina, fucosio o [24]. Pertanto, i linfociti MBP-esprimono sembrano interagire con KC uomo che esprimono in GVHD mucosa orale. I risultati del test di migrazione transwell indicano che la migrazione del CD8 MBP-esprimenti + cellule è accelerato dal mezzo contenente Man. CD8 migrazione + cella è stata inibita da una miscela di uomo e di LCA e pretrattamento delle cellule con LMAN2 Ab, indicando che MBP su CD8 + cellule riconosciuti uomo in particolare. Questi risultati suggeriscono che la migrazione delle cellule effettrici, CD8 + linfociti, per l'uomo che esprimono KC può essere mediato da una interazione tra MBP e l'Uomo.
CD8 + cell-adesione dell'epitelio macchiato con Man- specifica LCA è stata dimostrata utilizzando SWBA. Così, il legame di CD8 + cellule sulla superficie epiteliale durante lo sviluppo di aumenti di GVHD insieme con l'espressione uomo e correla con la progressione della malattia. Questi risultati sono coerenti con in vivo
osservazioni di KC che esprimono specifici Man LCA di aderire a CD8 + cellule durante la progressione della GVHD. In un processo di adesione, MBP su CD8 cellule + svolge un ruolo importante come fattore collante di Man che esprimono KC durante lo sviluppo di GVHD. Inoltre, i risultati del LCA ed esperimenti Ab-bloccanti sostenuto l'idea che le interazioni MBP /MAN rappresentano il legame di CD8 + cellule. Così, LMAN2 Ab, LCA, o LMAN2 Ab insieme a LCA, bloccate tutto CD8 + cella vincolante rispetto a lecitns riconoscere residui di Man non correlati. Il nostro precedente studio ha rivelato che l'induzione di ICAM-1 espressione KCs portato alla adesione di CD8 + cellule alla superficie dell'epitelio e che questo è stato mediato in parte dal ICAM-1 /LFA-1 pathway [3]. Le interazioni /Man MBP qui presentati appartengono ad un altro percorso adesivo per la migrazione e l'adesione delle cellule effettrici nell'epitelio superficie durante lo sviluppo di GVHD mucosa orale.
In sintesi, questi risultati definiscono il ruolo di espressione Uomo sulla KCs durante la sviluppo di GVHD come indurre la migrazione di cellule MBP-esprimono CD8 + nell'epitelio orale in cui si attengono al KC. L'up-regolazione dell'espressione Man on KC è indubbiamente un passo fondamentale nella patogenesi della GVHD mucosa orale.
Conclusione
un aumento dell'espressione di Man on KC porta alla migrazione e /o adesione di CD8 + cellule in l'epitelio di superficie e questo è mediata in parte dal percorso MBP /Man durante lo sviluppo di GVHD mucosa orale
Abbreviazioni
ACTB:.
β-actina
Ab:
anticorpo
GVHD:
malattia del trapianto contro l'ospite
H & amp; e:
