Abstract
sfondo
L'Amazzonia rappresenta un'area di 61% del territorio brasiliano e sta subendo grandi cambiamenti derivanti dalla disordinata lo sviluppo economico, in particolare l'avanzata del settore agroalimentare. Composizione dell'atmosfera è controllata da diversi processi naturali e antropici, e le emissioni da combustione di biomassa è un tutt'uno con il maggiore impatto sulla salute umana. Lo scopo di questo studio era di valutare il potenziale genotossico di inquinanti atmosferici generati dalla combustione di biomassa attraverso test del micronucleo in cellule buccali esfoliate di scolari della regione amazzonica brasiliana.
Metodi
Lo studio è stato condotto durante le stagioni secche in due regioni dell'Amazzonia brasiliana. Il test è stato effettuato su cellule epiteliali buccali di 574 scolari tra i 6-16 anni.
Risultati
I risultati mostrano una differenza significativa tra le frequenze micronuclei nei bambini esposti a combustione di biomasse rispetto a quelli in una zona di controllo.
Conclusioni
Il presente studio ha dimostrato che nel biomonitoraggio situ usando un test costo sensibile e basso (test del micronucleo buccale) può essere un importante strumento per il monitoraggio della qualità dell'aria in regioni remote. È difficile attribuire l'aumento della frequenza micronuclei osservata nel nostro studio a qualsiasi elemento tossico specifico integrato nel particolato. Tuttavia, il contributo di questo studio sta nella prova che ha aumentato l'esposizione al particolato fine genera un aumento della frequenza di micronuclei nelle cellule epiteliali orali di scolari
materiale supplementare elettronica
La versione online di questo articolo (doi:. 10 . 1186 /1472-6831-12-6) contiene materiale supplementare, che è disponibile per gli utenti autorizzati.
Sfondo
l'Amazzonia si estende dall'Oceano Atlantico alle pendici orientali delle Ande, con il 61% di l'area appartenente al Brasile, dove è chiamato brasiliana. La regione è stata colpita da ambientalmente e dello sviluppo economico, in particolare agroalimentare e allevamento. Questo ha provocato cambiamenti di uso del suolo, con conseguente aumento della deforestazione e una maggiore combustione di biomasse in entrambe le aree forestali e pascoli nativi [1, 2]. Diversi studi dimostrano che la formazione di pascolo è l'uso principale del suolo nelle regioni recentemente deforestate [3]. La canna da zucchero è un esempio di agroalimentare che è in rapida espansione nel bioma Amazzonia, guidato da l'incentivo politico per produrre e consumare biocarburanti sia a livello nazionale che internazionale. Il Brasile è uno dei maggiori produttori di biocarburanti in tutto il mondo, con la maggior parte della produzione concentrata nella regione del Midwest. La canna da zucchero bagassa che brucia al momento del raccolto è ampiamente praticata in produzione brasiliana per facilitare la raccolta e aumentare la resa di taglio manuale; Tuttavia, questa procedura arcaiche provoca un aumento delle concentrazioni di inquinanti nell'atmosfera [4-7]
. combustione biomassa è un processo di combustione di materiale organico che è caratterizzata da una composizione multielemental e distribuzione dimensionale [8, 9], che rappresenta un esposizione combinata a diversi inquinanti e effetti sulla salute associati all'esposizione multipla. PM ha la capacità di assorbire molti composti mutagenici presenti nell'ambiente e trasportarli attraverso i rami respiratorie alla membrana basale dei capillari alveolari [10]. polveri sottili sottili e ultra sono particolarmente tossici per le cellule [11]. La presenza di una miscela complessa di sostanze inquinanti può essere in grado, ad alte concentrazioni o dopo l'esposizione a lungo termine, per indurre un danno genotossico nelle cellule umane [12]. Il principale danno genotossico generata dall'esposizione a inquinanti da combustione di biomasse sono tipi ossidativi di danni. (Per esempio: 8-oxodG) e la formazione di addotti del DNA, che, se non riparati possono provocare mutazioni nel DNA [13-15]
Tra i saggi biologici utilizzati per valutare l'impatto dei fattori ambientali, genetici e stile di vita sulla stabilità genomica negli esseri umani, il test del micronucleo (MN-test) è stato messo in evidenza per la sua facilità d'uso, e richiedendo minori investimenti di capitale associato con precisione ottenuta segnando più grande numero di cellule [16]. L'uso di cellule epiteliali orali come bioindicatore di danno genotossico derivante dall'esposizione ad agenti cancerogeni ambientali inalazione e il tratto digerente può essere spiegato con la capacità delle cellule di metabolizzare sostanze cancerogene e per essere la prima barriera fisica di questi tratti, con conseguente maggiore incidenza di tumori umani nelle cellule epiteliali [17]. Micronuclei (MN) sono strutture risultanti da cromosomi interi o frammenti cromosomici che restano indietro in anafase durante la divisione nucleare, che ci permette di rilevare l'azione di agenti clastogeni e aneugenico [17-19].
I bambini sono più sensibili agli effetti di l'esposizione all'inquinamento atmosferico, malattie respiratorie soprattutto in termini di danno alla salute umana associati all'esposizione a combustione di biomasse inquinanti [20-23]. Uno studio condotto da Huen et al. [24] nei bambini e negli adulti attraverso test del micronucleo orale suggerito una maggiore vulnerabilità alle atmosferico dovuto al traffico in bambini. Questa sensibilità dei bambini all'inquinamento atmosferico può essere spiegato da un più alto livello di attività fisica e trascorrere più tempo fuori e quindi sono più esposti ad inquinamento aria esterna [25], così come l'immaturità del polmone e del sistema immunitario [26]. studi di biomonitoraggio nei bambini sono colpiti in misura minore da fattori confondenti come il fumo di sigaretta e abitudini di bere alcolici, esposizione professionale e lo stile di vita (ad es .: tipo di dieta), che sono fattori di grande preoccupazione negli adulti [16]. La relazione tra l'esposizione a inquinanti atmosferici e formazione di micronuclei in cellule buccali di bambini è stata descritta da Huen et al. [24] negli Stati State of America, Iurchenko et al. [27] e Maimulov et al. [28] in Russia, Sycheva et al. [29] in Vietnam e Lahiri et al. [30] in India.
Lo scopo di questo studio era di valutare il potenziale genotossicità delle sostanze inquinanti attraverso la combustione della biomassa test del micronucleo in cellule buccali esfoliate di scolari della regione amazzonica brasiliana.
Metodi portale di Studio
Lo studio è stato condotto in due aree test (Tangará da Serra (TS) e Porto Velho (PV)) ed una zona di controllo (Chapada dos Guimarães (CH)). Tangará da Serra (TS) ha una popolazione di 83,431 abitanti distribuiti su una superficie di 11,391.314 km
2, che si trova in una zona di transizione tra i biomi Amazon e Cerrado e ha le caratteristiche di una zona urbana all'interno regione amazzonica; la regione ha la più grande produzione di canna da zucchero e contiene i due più grandi fabbriche nel sud brasiliana [31-33]. Porto Velho (PV) ha una popolazione di 428,527 abitanti distribuiti su una superficie di 34,096.429 km 2, situato in una zona rurale sulle rive del fiume Madeira nel bioma Amazzonia; la popolazione ha caratteristiche tipiche degli abitanti argine amazzoniche [33]. Le due aree test sono in una regione con cicli tipici della siccità e della pioggia che alterano i livelli di inquinamento atmosferico, e si trova nel percorso di dispersione del pennacchio di inquinamento derivante da incendi in Amazzonia Legale e l'inquinamento dai paesi vicini, impattando così la salute respiratoria del popolazione esposta, in particolare la morbilità in età scolare [6, 34, 35]
. Chapada dos Guimarães (CH) ha una popolazione di 17.821 abitanti distribuiti su una superficie di 5,983.595 km 2 e, è stato selezionato come zona di controllo a causa la sua migliore qualità dell'aria. Non vi è alcuna produzione o zucchero di canna combustione industriale e traffico automobilistico è leggero, rispetto agli altri comuni coinvolti. E 'stato scelto anche per le somiglianze a variabili meteorologiche (pioggia, temperatura e umidità) rispetto ad altri comuni coinvolti in questo studio [6, 32, 33]. Sono mostrati
di latitudine e longitudine coordinate di tutti i punti raccolti nelle aree di studio in Figura 1. Figura 1 posizione geografica dei siti di studio, che delimita la regione dell'Amazzonia brasiliana
. test del micronucleo in cellule buccali esfoliate
il MN-test è stato condotto su cellule epiteliali buccali di 574 bambini tra i 6 -16 anni (446 bambini esposti direttamente alla combustione di biomassa e 128 bambini che vivono nella zona di controllo). campioni di cellule buccali sono stati raccolti durante la combustione (a secco) stagione nella regione, che si verifica tra i mesi di maggio e ottobre. I campioni di TS e CH sono stati raccolti nell'agosto 2008, e campioni provenienti da fotovoltaico sono stati raccolti nel mese di agosto 2009. I campioni sono stati ottenuti sfregando la parte interna delle guance di soggetti dello studio con un cytobrush. Le cellule sono state raccolte in bottiglie per campioni contenenti 5 ml di soluzione tampone (0,1 M EDTA, 0,01 Tris-HCl e 0,02 M NaCl, pH 7) e trasportati al laboratorio. I campioni sono stati trattati secondo il protocollo descritto da Heuser et al. [36], e le diapositive sono stati valutati secondo i criteri stabiliti dalla Tolbert et al. [37]. Un totale di 2.000 cellule /figlio sono stati analizzati utilizzando un microscopio ottico con un ingrandimento pari a 1000 X.
Al fine di ridurre i fattori di confondimento, lo studio ha escluso fumatori, alcolisti, malati o persone con eventuali malformazioni genetiche. L'influenza del potere economico come fattore di confusione è stata valutata con la raccolta di cellule buccali in scuole pubbliche e private, quando possibile. sono stati valutati anche altri fattori come l'età e il sesso. Tutte le diapositive sono stati analizzati in modo codificato dalla stessa persona.
Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico della Scuola nazionale di sanità pubblica (ENSP) /Fondazione Oswaldo Cruz (Fiocruz) sotto CAAE il numero 0054.0.031.000-08. Tutti i genitori /tutori dei bambini sono stati informati circa lo scopo dello studio, così come hanno firmato un documento di partecipazione ed il consenso con lo studio.
Raccolta di dati ambientali
I mezzi quotidiani di particelle sottili (PM 2.5) e delle variabili meteorologiche (umidità e temperatura) nella regione sotto l'influenza diretta di incendi e nella zona di controllo, durante la stagione secca, sono stati ottenuti da CATT-Brams (Coupled modello Aerosol e Tracer Trasporti della regione atmosferica brasiliano Modeling System) accessibile tramite il informazione ambientale integrato al sistema Salute ambientale (http:... //sisam CPTEC INPE br /msaude /). Una descrizione più dettagliata di questo modello è stato presentato da Freitas et al. Analisi statistica
I dati della frequenza micronuclei (MN ‰) [38].
sono state valutate mediante analisi della varianza (ANOVA), seguita da test di confronto di Tukey. I dati di PM 2.5 sono stati valutati con il test di Mann-Whitney. La significatività è stata determinata rispetto ai dati ottenuti in zona di controllo. Tutti i dati sono stati analizzati utilizzando SPSS 16.0.
Risultati
La figura 1 mostra l'Amazzonia regione e comuni legali coinvolti in questo studio, oltre alla georeferenziazione di tutti i punti campionati nel test del micronucleo orale.
Tabella 1 mostra la concentrazione media di variabili modellati da CATT-Brams in tutti i comuni studiati ambientale (PM 2.5) e meteorologici (temperatura e umidità). In relazione alle variabili meteorologiche, abbiamo osservato che i profili di temperatura e umidità erano molto simili nelle zone valutati. Punto fotovoltaico ha mostrato più elevato contenuto di umidità (68 e 72%), in entrambi i periodi modellate (2008 e 2009) rispetto agli altri punti (CH e TS). Con riferimento alla variabile ambientale, abbiamo trovato che PM 2.5 presenta un profilo in cui modellate concentrazioni nelle aree test erano significativamente superiori (TS = 21 e 22 g /m 3; PV = 19 e 16 mg /m 3) di quelle che si trovano nell'area di controllo (10 e 12 ug /m 3), sia in fase di periods.Table 1 distribuzione dei dati ambientali e meteorologici dei siti di studio negli anni 2008 e 2009.
dati ambientali
Temperatura (° C)
Umidità (%)
PM2.5 (mg /m3)
2008
2009
2008
2009
2008
2009
Chapada dos Guimarães (CH)
26
25
51
62
10
12
Tangará da Serra (TS)
25
24
57
68
21 ##
22 ##
Porto Velho (PV)
28
27
68
72
19 ##
16 ##
dati ottenuti nella stagione secca (maggio-ottobre). ## P
& lt; 0.01 da test di Mann-Whitney.
I risultati presentati nella tabella 2 mostrano una differenza statisticamente significativa tra MN ‰ ottenuti nelle aree test (TS = 1,43 ± 0,84 e PV = 1.13 ± 0.63) rispetto con la zona di controllo (CH = 0,29 ± 0,41). Risultati da TS e PV mostrato un accumulo di frequenza micronuclei di 4,9 e 3,8 volte maggiore di quella osservata nella zona di controllo, rispettivamente. Lo studio ha anche valutato l'influenza di altri parametri come il tipo di scuola, sesso ed età (anni) su MN ‰. I risultati mostrano che la frequenza micronuclei ottenuto in scolari esposti a combustione di biomasse era significativamente più alta (TS = Scuola privata: 1.30 ± 0.4 e la scuola pubblica: 1,46 ± 0,9; PV = scuola pubblica: 1.13 ± 0.63) rispetto a quello osservato nella zona di controllo ( CH = scuola privata: 0,27 ± 0,36 e la scuola pubblica: 0,3 ± 0,44). Per quanto riguarda il tipo di scuola, i risultati hanno mostrato alcuna differenza significativa (p & gt; 0,05
) tra i risultati da scuole pubbliche in relazione alle scuole private. Quando si confrontano MN ‰ ottenuto nelle scuole pubbliche in TS e PV, si vede che la frequenza dei micronuclei di studenti di TS (1,46 ± 0,9) è stato leggermente superiore a quello del fotovoltaico (1,13 ± 0,63), ma non in modo significativo. Per quanto riguarda genere, non vi era alcuna differenza significativa tra MN ‰ di studenti di sesso maschile e femminile in tutte le aree studiate. Nessuna differenza per quanto riguarda il parametro di età è stata osservata quando si confrontano le età in ogni sito. In generale, differenze significative sono state osservate quando si confrontano i dati ottenuti nei siti TS e PV rispetto a CH in tutti i parametri, eccetto tra MN ‰ nei bambini sotto i 07 anni da fotovoltaico che non era significativa rispetto al controllo (p & gt; 0.05
). Tabella 2 frequenza micronucleo di cellule buccali esfoliate nei bambini.
micronuclei frequenza (MN ‰)
Chapada dos Guimarães (CH)
Tangará da Serra (TS)
Porto Velho (PV)
|
N
Mean
SD
N
Mean
SD
N
Mean
SD
Con sito
128
0,29
± 0.41
245
1,43 **
± 0.84
201
1.13 **
± 0.63
Altri
|
|
|
|
|
|
|
|
|
parametri:
|
|
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|
|
|
|
|
|
Tipo di scuola
|
|
|
|
|
< td>
|
|
|
scuola privata
57
0.27
± 0,36
42
1,30 **
± 0,40 sull'oggetto - sull'oggetto - - Wooel.com
pubblici scolastici
71
0.30
± 0.44
203
1,46 **
± 0.90
201
1.13 **
± 0.63
genere
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Maschio
54
0.27
± 0,36
110
1,50 **
± 0.82
108
1,08 **
± 0.61
femminile
74
0.30
± 0.44
135
1.39 **
± 0,85
93
1.18 **
± 0.65
Età (anni)
|
|
|
|
|
< td>
|
|
|
≤ 7
18
0,19
± 0.31
46
1,20 **
± 0.83
14
0.89
± 0,56
8-9
28
0,29
± 0.46
55
1.33 **
± 0.87
27
1.06 *
± 0.54
10-11
28
0.27
± 0,40
59
1,57 **
± 0.83
32
1,11 * *
± 0.74
12-13
27
0.31
± 0,40
57
1.54 **
± 0.92
49
1.10 **
± 0,69
≥ 14
27
0.35
± 0.43
28
1.54 **
± 0.51
79
1,22 **
± 0.58
* p
& lt; 0.05 e ** p
& lt; 0,01 per il test di Tukey. N = Numero di bambini esaminati. SD = Deviazione Standard
. Discussione
Tra i pochi studi che valutano il danno genetico in scolari esposti all'inquinamento atmosferico, nessuno ha valutato il danno generato dall'esposizione a inquinanti emessi attraverso la combustione della biomassa nella regione amazzonica.
Uno studio condotto da Sisenando et al. [6] nella stessa regione dell'Amazzonia legale ha mostrato una delimitazione delle due periodi climatici ben definiti (a secco e pioggia). Questa concentrazione fatto influenze e la dispersione di sostanze inquinanti, dato che l'inquinamento generato dalla combustione di biomasse in Amazzonia raggiunge il suo picco durante la stagione secca (maggio-ottobre). I risultati di PM 2,5 modellato nella regione studio mostrano che TS e le aree fotovoltaici presentati valori di particolato molto più alti rispetto alla zona di controllo, questo convalidare la scelta di CH come controllo in questo studio e corrobora con lo studio di valutazione della tossicità di Sisenando et al. [6] che ha anche scelto questa stessa area come controllo. Con riferimento alle variabili meteorologiche, risultati presentati mostrano alcuna differenza significativa tra le temperature medie modellate tra le zone. Maggiore umidità a Porto Velho in confronto ad altri punti è giustificata dal fatto che la zona fa parte del bioma Amazon e soffre di conseguenza una maggiore influenza da umidità proveniente dalla foresta amazzonica [39, 40].
Frequenza di base MN ottenuto in CH (area di controllo) è in accordo con i valori osservati da Holland et al. [17] nella revisione articolo del micronucleo progetto umano su cellule esfoliate buccali (HUMN XL) per quanto riguarda la linea di base osservato in articoli che hanno valutato gli inquinanti ambientali. Confronto tra aree esposte e non esposte ad inquinamento ha dimostrato che i bambini esposti ad inquinamento hanno una maggiore frequenza di micronuclei. Questi risultati confermano studi di Maimulov et al. [28] in Russia, Lahiri et al. [30] India, Huen et al. [24] e Chen et al. [41] negli Stati Uniti che ha valutato l'influenza di inquinamento atmosferico in formazione di micronuclei nei bambini. Il più alto ‰ MN osservato in TS in relazione a PV anche se non significativa conferma i risultati di materiale particolato sul modello che TS era l'area più esposta in entrambi i periodi analizzati. Questa differenza di concentrazione di particolato osservata in TS può essere associato con la combustione della canna da zucchero nella zona. Sisenando et al. [6] e Alves et al. [9] ha mostrato la capacità genotossico delle sostanze inquinanti generate dalla combustione della canna da zucchero nella regione TS utilizzando il bioindicatore Tradescantia pallida in situ
ed ex situ esperimenti
. Alves et al. [9] anche rilevato la presenza di IPA con alto potenziale mutageno (ad esempio: benzo [e] pirene) e n-alcani nel campionato attraverso i filtri di teflon nella troposfera di Tangará da Serra durante la stagione secca
In Brasile,. consumo di proteine vegetali, frutta e animali è associata a valori culturali, e il consumo di supplementazione di vitamina è costoso e limitato a soggetti con maggior potere d'acquisto. Bonassi et al. [42] in un articolo di rassegna del HUMN progetto XL dimostra che i fattori legati allo stile di vita e la dieta può influenzare la frequenza di micronuclei. In questo studio, il fattore di alcol e di tabacco è stato minimizzato al momento della raccolta e fattore culturale è stato minimizzato scegliendo aree (test e controllo) con valori culturali simili. Anche se nella regione di studio vi è una chiara differenza economica tra gli utenti di scuole pubbliche e private, questo fatto non ha fornito differenze significative tra i due gruppi.
Più recente pubblicazione HUMN progetto XL ha dimostrato che le persone che mangiano pesce regolarmente hanno una frequenza di MN linea di riferimento inferiore rispetto ai non consumatori di pesce [42].
Quando si confrontano domestici consumo pro capite di pesce tra le due aree test, abbiamo scoperto che il consumo di pesce nel fotovoltaico è 2,31 volte superiore a quello del TS [43 ]. Questo può aiutare a spiegare la bassa frequenza di micronuclei osservati nel fotovoltaico. Per quanto riguarda i sessi, i risultati non hanno mostrato differenze significative tra maschi e femmine. Questo risultato avvalora gli articoli di revisione di Neri et al. [16] e Bonassi et al. [42] e non corroborare studio della Maimulov et al. [28] che ha dimostrato che i bambini di sesso femminile sono più sensibili all'inquinamento ambientale a San Pietroburgo. In relazione all'età, i risultati hanno mostrato un aumento lieve ma non significativo nella frequenza di MN in tutti i settori. Questa osservazione è in accordo con Bonassi et al. [42] che ha dimostrato che la frequenza di micronuclei aumenta costantemente con l'età. In generale, differenze significative sono state osservate quando si confrontano i dati ottenuti nei siti TS e PV con quelli di CH in tutti i parametri, eccetto tra MN ‰ nei bambini sotto i 07 anni da fotovoltaico che non era significativa rispetto al controllo (p & gt; 0,05
). Questo fatto può essere spiegato con la dimensione del campione piccolo in questa fascia di età.
Un fatto che potrebbe essere considerato un limite di questo studio è stato il piccolo numero di bambini che partecipano allo studio nella scuola pubblica di Chapada dos Guimarães e la incapacità di condurre lo studio nella scuola privata di Porto Velho. Tuttavia, questo studio è segnata dal carattere pionieristico nella valutazione della genotossicità in una zona di difficile accesso e con poche stazioni di monitoraggio ambientale.
Conclusioni
In conclusione, questo studio ha dimostrato che in situ biomonitoraggio con un sensibile e test a basso costo (buccale MN-test) può essere un importante strumento per il monitoraggio della qualità dell'aria nelle regioni remote o che non è possibile avere una stazione di monitoraggio della qualità dell'aria. Considerando che l'inquinamento generato dalla combustione di biomasse è una miscela complessa, è difficile attribuire l'aumento MN ‰ osservato nel nostro studio a qualsiasi elemento tossico specifico all'interno nelle materie di particolato. Tuttavia, il contributo di questo studio sta il fatto che abbiamo trovato prove significative che ha aumentato l'esposizione a PM 2.5 genera una frequenza di micronuclei aumentata nelle cellule epiteliali orali da scolari
Abbreviazioni
PM:.
particolato
IPA:
idrocarburi policiclici aromatici
DNA:
acido desossiribonucleico
MCN-test:
micronucleo Assay
MN:
micronuclei
TS:
Tangará da Serra
PV:
Porto Velho
CH:
Chapada dos Guimarães
PM2,5:
fine particolato
CATT-Brams:
Coupled Aerosol e Tracer Trasporti modello del sistema atmosferica Modeling brasiliano regionale
SISAM:
informazione ambientale integrato del sistema Environmental Health
SPSS:
pacchetto statistico per le scienze sociali
ANOVA:
analisi della varianza
MN ‰:
medio micronucleo Frequenza
HUMNXL:
Progetto micronuclei umano su cellule esfoliate buccali
buccale MCN-test:
buccale micronucleo Assay
Dichiarazioni
Ringraziamenti
Questo lavoro. ricevuto un sostegno finanziario da Fiocruz e MCT-CNPq /CT-18, così come il supporto logistico da UNEMAT e CESTEH /Fiocruz. Gli autori sono grati ai ricercatori Eliane Ignotti, Maurecilne L. S. Carvalho, Ilio F. Carvalho e Dionei J. Silva; così come gli studenti Adrielle S. de Cruz, Suzan L. S. Perreira, Viviane L. Hunhoff e Ruth Ferreira per il loro supporto nello sviluppo di questo progetto. Gli autori sono grati per il supporto logistico da tirocinanti e Prof. Dr. Rivanildo Dallacort di UNEMAT.
Autori fascicoli presentati originali per
di seguito sono riportati i link ai file degli autori originali inviati per le immagini. 12903_2011_209_MOESM1_ESM.bmp Autori file originale per la figura 1 interessi in competizione
Gli autori dichiarano di non avere interessi in competizione
autori. 'Contributi
ha partecipato a disegno dello studio, le analisi condotte, e redatto il manoscritto; SRBM partecipato disegno dello studio, analisi di genotossicità guidato, e rivisto le bozze del manoscritto; PA è stato coinvolto nella revisione e preparazione del manoscritto per la pubblicazione; PHNS è stato coinvolto nella revisione e preparazione del manoscritto per la pubblicazione; SSH ha concepito lo studio, ha partecipato alla sua progettazione e coordinamento e ha contribuito alla stesura del manoscritto. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.
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