Abstract
sfondo
cellule squamose carcinoma è la più importante tumore maligno con il sito primario nel cavità orale e, data la grande esposizione delle mucose e delle labbra ai fattori eziologici di questa neoplasia, la sua incidenza è alta. Indagine dei determinanti prognostici è significativo per le aspettative di proposta trattamento e la cura del paziente. La risposta immunitaria locale rappresentata dal peritumorale infiltrato infiammatorio è un possibile fattore prognostico.
Metodi
In questo studio, sono stati analizzati campioni di mucosa orale di cellule carcinoma squamoso, separati in base alla loro classificazione istologica nonché il profilo fenotipico della cellule che compongono l'infiltrato infiammatorio peritumorale è stata studiata con il metodo di immunoistochimica, in dipendenza, l'indice di proliferazione cellulare tramite la proteina espressione Ki67 è stato determinato.
Risultati
I linfociti T composte da più di questo infiltrato infiammatorio, e tra queste cellule, ci era una predominanza di linfociti T CD8 rispetto ai linfociti T CD4. I lymhocytes B sono stati il secondo tipo di cellule leucociti più visualizzato seguito da macrofagi e neutrofili. La valutazione immunoistochimica di Ki-67 cellule positive rivelato una maggiore espressione di questa proteina in campioni di indifferenziata cellule squamose carcinoma.
Conclusione
I risultati suggeriscono che la risposta immunitaria cellulare è il meccanismo di difesa principale di cellule squamose carcinoma orale mucosa, espressa dal gran numero di linfociti T e macrofagi, e che la maggiore intensità di risposta locale può essere associato con la prognosi migliore
materiale supplementare elettronica
la versione online di questo articolo (doi:. 10. 1186 /1472-6831-8-25) contiene materiale supplementare, che è disponibile per gli utenti autorizzati.
Sfondo
tumori maligni della bocca comprendono un gruppo eterogeneo di lesioni che si differenziano tra di loro come ai fattori di rischio, clinici aspetti, e l'origine istologica. Tra i diversi tumori di questo gruppo, cellule squamose carcinoma è il tipo istologico più diffuso e rappresenta maggior parte dei casi di cancro orale diagnosticati [1-4]. Nonostante le campagne di prevenzione di diversi programmi di assistenza sanitaria governative e ampliamento della rete di professionisti specializzati che diano la priorità alla diagnosi delle lesioni precancerose del cavo orale nei diversi servizi di assistenza sanitaria attualmente attivi, il 7% della popolazione mondiale è affetto da cancro orale, e è, quindi, un problema di salute in tutto il mondo [4].
squamose origine cellule di carcinoma nell'epitelio che riveste la bocca. Questo fatto è estremamente importante quando si considera l'esposizione costante della cavità orale stimoli intrinseci locali associati con l'aumento del rischio di questo tipo di tumore. Tra i principali fattori di rischio, fumo, consumo di bevanda alcolica cronica e traumi meccanici croniche - come protesi dentarie disadattati e denti fratturati - distinguersi. Inoltre, tra cui il cancro primario delle labbra, in particolare della porzione inferiore, dovremmo considerare continua esposizione alla radiazione solare come fattore estrinseco significativo, soprattutto in soggetti leukodermic. Oltre a fattori intrinseci locali e fattori estrinseci, la predisposizione genetica del paziente e della risposta immunitaria sono fattori determinanti del rischio di cancro [2, 4-10].
Oltre all'intensificazione delle attività di prevenzione, sono stati sviluppati diversi studi per stabilire fattori determinanti la prognosi di queste lesioni con l'obiettivo di minimizzare morbilità e mortalità causata dalla lesione maligna esistente. Molti autori hanno studiato una possibile correlazione tra la risposta del paziente immunitario, comportamento neoplastica e la prognosi [5, 11, 12].
Meneses et al., (1998) hanno dimostrato, in cellule squamose campioni di carcinoma orale, una possibile associazione tra le dimensioni del tumore, zona d'invasione, angiogenesi, e la caratterizzazione fenotipica del infiltrato infiammatorio peritumorale prevalentemente costituito da linfociti T e linfociti B. Coussens et al., (1999) trovato anche in carcinomi di mucosa orale un'associazione tra la predominanza di mastociti nell'infiltrato peritumorale e un maggiore sviluppo della angiogenesi stromale, che fornirebbe un adeguato apporto di sangue per la nutrizione neoplastica, e di conseguenza, un peggiore prognosi.
Insieme con la valutazione dell'infiltrato infiammatorio peritumorale ei suoi prodotti, lo studio della cinetica cellulari tumorali, i meccanismi di regolazione e la sua interrelazione con fattori di crescita, oncogeni e anti-oncogeni è stato anche il bersaglio di vari studi [8, 15-19]. Con gli eventi cellulari che determinano direttamente il progresso clinico del tumore, proliferazione cellulare è significativa, ossia, disturbi nel numero di cellule derivanti dalle disfunzioni del ciclo mitotico [20, 21].
l'attività proliferativa di qualsiasi tessuto o tumore può essere determinato dal suo tasso di crescita utilizzando anticorpi diretti contro antigeni specifici espressi da cellule proliferanti neoplastiche, consentendo l'analisi simultanea di proliferazione cellulare ed istologia [13, 22, 23]. La molecola Ki67 è il marcatore antigenico di scelta, poiché non soffre molto influenza di fattori interni ed esterni, e la sua espressione nucleare durante un determinato periodo di ciclo della cellula rappresenta un vantaggio nel suo utilizzo come marker biologico di attività mitotica [ ,,,0],24-27].
Recentemente è stato dimostrato che Ki-67 gene soffre "over espressione" in cellule epiteliali di lesioni orali pre-maligne e maligne.
in questo studio, l'indice di proliferazione cellulare è stata valutata mediante la espressione della proteina Ki67 e il profilo fenotipica di cellule che compongono l'infiltrato infiammatorio peritumorale in campioni di cellule squamose carcinoma della mucosa orale. I risultati hanno dimostrato una partecipazione vitale della popolazione di linfociti T nella composizione dell'infiltrato infiammatorio associato all'area neoplastica. Questi risultati suggeriscono anche una correlazione tra l'intensità della reazione infiammatoria peritumorale e la proliferazione delle cellule tumorali.
Metodi
Campioni di mucosa orale cellule squamose carcinoma dal trattamento di pazienti naive sottoposti a biopsie incisionali diagnostici. campioni di paraffina-bloccato (n = 30) sono stati ottenuti da archivi del Laboratorio di Anatomia Patologica della Facoltà di Medicina della Dom André Arcoverde Fondazione -. Valença /RJ
I blocchi sono stati elaborati istologicamente per ottenere fette di 4 micron di spessore e colorate con ematossilina routine e eosina (HE).
vetrini sono stati valutati da due esaminatori differenti, ed i tumori sono stati classificati istologicamente secondo la Classificazione Internazionale delle Malattie per l'Oncologia (ICD-O /2000). I campioni sono stati suddivisi nei seguenti gruppi: Gruppo 1
: ben differenziato cellule squamose carcinoma della mucosa orale (n = 10)
Gruppo 2: moderatamente differenziato cellule squamose carcinoma della mucosa orale (n = 10)
Gruppo 3:. cellule squamose indifferenziate di carcinoma della mucosa orale (n = 10)
Istomorfometria del infiammatoria infiltrato
al fine di quantificare l'infiltrato infiammatorio peritumorale, software immagine Scion e software FotoScan sono stati utilizzati per la cattura e morfometria di immagine l'infiltrato infiammatorio. Tutti i campioni sono stati catturati in piena estensione e campi (ingrandimento originale × 100) con zone infiammate attorno al tumore sono stati misurati semi-automatico, con selezione manuale della regione infiammata e analisi computerizzata dell'area selezionata.
Base all'analisi di ogni campione, semplice aritmetica: la zona infiammata per campo microscopico sono stati ottenuti ei risultati sono stati espressi in percentuale del infiammata zona peritumorale per gruppo
immunoistochimica Analisi
Fette di 4 micron di spessore disposte su vetrini silanizzati (3 amminopropiltrietossisilano.; Sigma Chemical, Co, USA), sono stati deparaffinate in una camera 60 ° C, e sequenzialmente idratata in passaggi attraverso xilolo, alcol assoluto, 70% di alcol, e acqua distillata
Il classico avidina-biotina perossidasi metodo complesso anti-perossidasi. è stato utilizzato nello studio dei campioni. I campioni sono stati sottoposti a recupero dell'antigene con immersione dei frammenti in 0.001 tampone citrato M, pH 6.0, e blocco perossidasi con perossido di idrogeno al 3% e in seguito incubate per 1 ora con anticorpi primari specificati nella Tabella 1. Successivamente, sono stati incubati con secondaria anticorpi biotinilati per 30 minuti e sottoposti ad una reazione con il complesso avidina-biotina per altri 30 minuti. La colorazione è stata eseguita con l'aggiunta del cromogeno diaminobenzidina (DAB) substrato per circa 1 minute.Table 1 Anticorpi per l'analisi immunoistochimica anticorpi marchio a
Anti CD20
Linfociti B
Dako
anti CD3
Linfociti T
Dako
anti CD8
Regulatory Linfociti T
Dako
anti CD4
Helper Linfociti T
Dako
anti CD15
neutrofili
Dako
anti CD68
macrofagi
Dako
Anti Ki67
proliferazione cellulare
Dako
controllo negativo della reazione immunoistochimica è stata eseguita omettendo l'incubazione con l'anticorpo primario per alcune fette. Fette sono stati analizzati e microfotografie sono stati realizzati con il sistema Nikon Microphot (Tokyo, Giappone).
Conta delle cellule reattiva per ogni anticorpo è stato fatto attraverso la scansione l'intero campione, con 400 × ingrandimento, con un conteggio di cellule positive in tutti i campi. I risultati sono stati ottenuti dalla media aritmetica semplice ed espressi in percentuale di cellule positive per campo microscopico Analisi statistica
analisi statistica è stata effettuata utilizzando
Mann-Whitney con un p & lt.; livello 0,05 importanza per valutare comparativamente mezzo dei parametri analizzati nei diversi gruppi dell'esperimento.
Risultati
L'analisi istopatologia delle fette colorate con ematossilina ed eosina (HE) e sottoposti ad analisi morfometrica rivelato che il significa percentuale di peritumorale zona infiammata per campo microscopico è stata del 24,7% nel gruppo 1 (campioni di ben differenziato cellule squamose carcinoma della mucosa orale) (Figura 1a), il 33,2% nel gruppo 2 (campioni moderatamente differenziato cellule squamose carcinoma orale mucosa) (Figura 1b), e 42,6% nel gruppo 3 (campioni di indifferenziate cellule squamose carcinoma della mucosa orale) (Figura 1c). Dopo la valutazione statistica, la quantità di area infiammata peritumorale mostrato una differenza statisticamente significativa quando gruppi 1 e 3 sono stati confrontati (p & lt; 0,05) (Figura 2). Figura 1 morfologica di classificazione delle cellule squamose della mucosa buccale. A: ben differenziato carcinoma a cellule squamose della mucosa buccale. N = 10. HE macchia. ingrandimento originale × 200. B: moderatamente differenziato carcinoma a cellule squamose della mucosa buccale. N = 10. HE macchia. ingrandimento originale × 400. C: indifferenziato carcinoma a cellule squamose della mucosa buccale. N = 10. HE macchia. ingrandimento originale × 400.
Figura 2 Intensità di peritumorale infiltrato infiammatorio. I valori sono espressi in modo semplice aritmetica significa sd ±. differenza statisticamente significativa è stata osservata rispetto gruppi 1 e 3. p ≤ 0,05.
In tutti i campioni valutati in questo studio, la prevalenza quantitativa dell'infiltrato infiammatorio è direttamente associato con aree di maggiore penetrazione nei tessuti soggiacente al parenchima tumorale .
la valutazione fenotipica dell'infiltrato peritumorale è stata effettuata mediante individuazione di positività cellule infiammatorie, caratterizzato dalla visualizzazione di colorazione intracellulare marrone chiaro, contro uno sfondo contro-colorati con ematossilina in ciascuna delle reazioni di anticorpi usati.
In tutti i gruppi, analisi dell'analisi immunoistochimica ha mostrato la presenza di una reazione infiammatoria costituito prevalentemente da cellule infiammatorie mononucleate. I linfociti T composte maggior parte di questo infiltrato infiammatorio, e tra queste cellule, c'era una predominanza di linfociti T CD8 rispetto ai linfociti T CD4 (Figura 3a). I linfociti B sono stati il secondo più visualizzato tipo cellulare leucocitaria (Figura 3b), seguita da macrofagi (Figura 3d) e neutrofili (Figura 3c). Figura 3 immunoistochimica per la caratterizzazione fenotipica di peritumorale infiltrato infiammatorio. A: linfociti T (+ cellule CD3). ingrandimento originale × 400. B. A: linfociti B (CD20 + cellule). ingrandimento originale × 400 C. A: I neutrofili (CD15 + cellule). ingrandimento originale × 400 D. A: I macrofagi (CD68 + cellule). . ingrandimento originale × 400
era alcuna differenza significativa quando i tipi di leucociti dei tre gruppi sono stati confrontati (p & gt; 0,05) (Figura 4). Figura 4 profilo cellulare della infiltrato infiammatorio peritumorale. I valori sono espressi come media aritmetica semplice ± SD. Nessuna differenza statisticamente significativa è stata osservata quando confrontato i gruppi. p ≤ 0,05.
In campioni di pazienti di gruppo 1, la valutazione immunoistochimica di proteine Ki-67 rivelato cellule tumorali scarsa immunoreattive (20% ± 3,2) (Figura 5), mentre nei campioni di pazienti di gruppo 2, cellule con positività erano più abbondanti (47% ± 6,3). Nei campioni di Gruppo 3 pazienti, le cellule marcate positivamente rappresentato 60,3% ± 2,8 delle cellule tumorali maligne. Il confronto tra le percentuali di cellule tumorali positive per Ki-67 espressione per campo microscopico nei campioni di mucosa orale dei tre gruppi ha evidenziato differenze statisticamente significative (p & lt; 0,05) (Figura 6). Tumori dal Gruppo 3 mostrano una maggiore espressione della proteina Ki-67 rispetto ai tumori dai gruppi 1 e 2. Figura 5 immunoistochimica dimostrando espressione della proteina Ki67 in cellule tumorali maligne di campioni di mucosa orale cellule squamose carcinoma. A: Il carcinoma ben differenziato. ingrandimento originale × 400. B: il carcinoma moderatamente differenziato. ingrandimento originale × 400. C: carcinoma indifferenziato. ingrandimento originale × 400.
Figura 6 espressione della proteina Ki67 per gruppo. I valori sono espressi in modo semplice aritmetica significa sd ±. differenza statisticamente significativa è stata osservata quando confrontato i gruppi. p ≤ 0,05.
Discussione
cellule squamose carcinoma è il tipo più comune di cancro della mucosa orale, e rappresenta il 91% dei casi diagnosticati di tumori maligni della bocca [2, 6-8].
Oltre l'eziologia multifattoriale che coinvolge fattori estrinseci ed intrinseci, stato immunitario del paziente è anche considerato influenzare il rischio di cancro e determinare molti aspetti della progressione [4, 9, 10]. Nel 1980, Scully C. (1983) aveva già riconosciuto il coinvolgimento della risposta immunitaria nello sviluppo di tumori maligni della bocca, e aveva sottolineato che il futuro trattamento del cancro sarebbe basata su immunoterapia attraverso immunomodulazione. Con gli eventi che direttamente determinare progressione clinica del tumore, quelli di primaria importanza includono disturbi del numero di cellule derivanti da disfunzioni ciclo mitotico e possibili guasti "in immunitario evasione dell'ospite dei tumori - valutati dalla intensità dell'infiltrato infiammatorio peritumorale, composizione di cellule infiammatorie, la produzione di citochine da parte infiltrarsi cellule, e la presenza di angiogenesi [11, 12, 14, 20, 21].
Secondo Costa L. et al., (2005) in uno studio clinico retrospettivo con 38 campioni orale cellule squamose carcinoma, la TNM (stadiazione tumorale determinata dalle dimensioni del tumore primario e la presenza di metastasi) classificazione correla con le caratteristiche istopatologiche principali della classificazione tumorale - grado di cheratinizzazione, pleomorfismo nucleari, e l'intensità di peritumorale infiltrazione linfocitaria, e il legame tra questi dati è importante nel determinare la prognosi e scegliendo trattamento.
Questi risultati hanno mostrato una correlazione inversa tra il grado di differenziazione del tumore e il tasso di proliferazione cellulare ottenuta mediante l'espressione di proteine Ki67. Risultati simili a quelli trovati in questo studio sono anche suggerite da Costa et al., (2005) nel carcinoma orale, Glen et al., (2006) nelle lesioni pancreatiche maligne, Deans et al., (2006) nei tumori gastro-esofageo e Cai et al., (2006) nel carcinoma a cellule transizionali della vescica. I tumori indifferenziati hanno mostrato l'espressione di proteine accentuato KI-67. Aguiar (1996) hanno dimostrato che l'indice mitotico aumenta progressivamente da mucosa orale peritumorale verso aree tumorali, così come nelle aree di maggiore invasione tissutale [7]. . Pich et al, (2004), in uno studio retrospettivo con lesioni maligne della cavità orale, ghiandole salivari, faringe e laringe, ha osservato che l'attività proliferativa di indagine da diversi metodi - come ad esempio la determinazione Index AgNORs e MIB-1 e Ki67 espressione immunoistochimica - è clinicamente rilevante e valido per proporre il trattamento e definire la prognosi. In questo documento, le caratteristiche istologiche esibite dal tumore maligno sono stati associati con l'aggressività clinica dall'analisi del grado maligno correlato a possibili determinanti della lesione prognosi -. Profilo immunologico locale e proliferazione delle cellule maligne
Secondo i risultati ottenuti dal morfometria dell'infiltrato peritumorale, la percentuale media di zona infiammata per campo microscopico è stata maggiore nei tumori indifferenziati (Gruppo 3) rispetto alle medie dei campioni di tumore moderatamente differenziati (Gruppo 2), seguiti dai campioni tumorali ben differenziati ( Gruppo 1). Nel valutare questi dati, abbiamo notato che esiste una correlazione tra il più alto grado di malignità e la massima intensità infiammatoria.
La caratterizzazione della composizione dell'infiltrato peritumorale non ha rivelato una differenza tra i tipi di leucociti dei tre gruppi, determinate dal i loro gradi, ma è interessante notare, i quantitativi di ciascun tipo di cellula erano ugualmente proporzionale in questi gruppi. Notiamo che in tutti i campioni, il numero totale di linfociti T e macrofagi predominante sulla quantificazione di plasmacellule, caratterizzando reazione locale del paziente come una risposta immunitaria prevalentemente tipo cellulare.
Oltre alla valutazione dell'intensità infiltrato infiammatorio peritumorale e i suoi componenti cellulari, alcuni dei principali determinanti della aggressività del tumore e le possibili predittori di prognosi sono alterazioni nella proliferazione cellulare, cioè anomalie nel numero di cellule derivanti da disfunzioni del ciclo mitotico. Questa attività proliferativa neoplastica può essere determinato dal tasso di crescita mediante espressione Ki67 [18-21, 28-31].
Il confronto tra le percentuali di cellule tumorali positive per l'espressione di Ki-67 per campo microscopico in campioni di mucosa orale dei tre gruppi hanno mostrato differenze statisticamente significative. I campioni di Gruppo 3 (indifferenziate cellule squamose carcinoma della mucosa orale) visualizzate una maggiore espressione di cellule marcate positivamente, seguito dai campioni di pazienti di Gruppo 2 (moderatamente differenziato cellule squamose carcinoma della mucosa orale), e dal gruppo 1 ( ben differenziato cellule squamose carcinoma della mucosa orale).
per quanto riguarda leucociti caratterizzazione, Sica et al., (2006) ha riportato prove associato al predominio della popolazione di macrofagi nel infiltrato peritumorale e una maggiore promozione dell'angiogenesi tumorale, attribuendo a queste cellule un ruolo pro-tumorale, e di conseguenza, una prognosi infausta.
nei campioni studiati del carcinoma orale, la valutazione di cellule infiammatorie peritumorali dimostrato l'importanza dell'immunità cellulare nella risposta antineoplastico locale a causa della presenza di un frazione prevalentemente costituita da linfociti T e macrofagi, pur senza differenze pertinenti alla composizione infiltrato base al grado istologico.
Recentemente, in campioni di carcinoma mammario invasivo, abbiamo indagato la possibile correlazione tra l'intensità dell'infiltrato infiammatorio peritumorale e il grado di differenziazione del tumore [32]. Si precisa che, quando abbiamo analizzato i pazienti con tumori maligni dello stesso grado, chi ha progredito in modo soddisfacente hanno mostrato una risposta infiammatoria peritumorale più intenso, mentre coloro che hanno sperimentato recidive tumorali e la diffusione metastatica ha sviluppato una risposta infiammatoria peritumorale meno intenso.
Conclusione
In questo studio, il parallelo tra l'intensità dell'infiammazione e la prognosi del paziente non è stata ancora completamente chiarita, e sono necessarie ulteriori ricerche. La distribuzione dei campioni di carcinoma mucosa orale in gruppi è stata fatta secondo grading istologico. I risultati suggeriscono una correlazione positiva tra intensità risposta infiammatoria e il grado di differenziazione del tumore. Pertanto, tumori indifferenziati presentano un maggiore sviluppo del processo infiammatorio peritumorale rispetto al differenziati moderatamente e tumori ben differenziati. Tuttavia, al fine di definire questa variabile dell'intensità risposta infiammatoria come fattore prognostico nel cancro orale, altri studi devono essere eseguite in modo che l'intensità della risposta locale e la proliferazione delle cellule maligne nei tumori della stessa classificazione istopatologica associati ai pazienti ' decorso clinico può essere valutato.
Infine, i risultati presentati in questo studio suggeriscono che la risposta immunitaria cellulare è il meccanismo principale difesa nella mucosa orale cellule squamose carcinoma, espressa dal gran numero di linfociti T e macrofagi.
Noi inoltre sottolineare che Ki-67 l'espressione è legata alla indice mitotico e, di conseguenza, per la proliferazione cellulare e la classificazione maligno della neoplasia.
Ringraziamenti
Rede Mineira de bioterismo. 2824/05 - FAPEMIG; Rede Mineira "TOXIFAR". 2827/05 - FAPEMIG; CNPq
Dichiarazioni
autori fascicoli presentati originali per
di seguito sono riportati i link ai file degli autori originali presentati per immagini. 'file originale per la figura 1 12903_2008_100_MOESM2_ESM.pdf Autori 12903_2008_100_MOESM1_ESM.pdf autori file originale per la figura 2 12903_2008_100_MOESM3_ESM.pdf Autori file originale per la figura 3 12903_2008_100_MOESM4_ESM.pdf Autori file originale per la figura 4 file originale 12903_2008_100_MOESM5_ESM.pdf degli autori per la figura 5 12903_2008_100_MOESM6_ESM.pdf autori file originale per la figura 6 Conflitto di interessi
Gli autori dichiarano di non avere interessi in gioco.
autori contributi
FLDV e BJV partecipato alla progettata dello studio, studio immunoistochimico e lo studio istopatologico . FMA e MAMG hanno partecipato alla progettazione e coordinamento.
