Abstract
sfondo
studi preclinici supporta l'ipotesi che innesti di tessuto connettivo preservano l'osso alveolare da riassorbimento; i meccanismi cellulari alla base, tuttavia, rimangono sconosciute. I meccanismi cellulari possono essere attribuiti all'attività paracrina dei fibroblasti palatali. E 'stato quindi ragionevole ipotizzare che le palatali innesti di tessuto connettivo riducono la formazione degli osteoclasti.
Metodi
Per verificare questa ipotesi, i fibroblasti umani palatali sono stati esaminati per la loro capacità di modulare la formazione di osteoclasti in colture di midollo osseo di topo esposti a RANKL, M-CSF e TGF-β1. Osteoclastogenesi è stata determinata dalla fosfatasi tartrato-resistente agli acidi (TRAP) colorazione e analisi di espressione genica. La formazione di cellule presentanti l'antigene si basava sulla espressione di CD14 e molecole costimmulatory di cellule presentanti l'antigene. L'interazione paracrino dei fibroblasti e il midollo osseo è stato modellato in vitro con inserti di membrane cellulari-occlusiva.
Risultati
in co-colture senza contatto cellula-cellula, palatali fibroblasti hanno causato una diminuzione della espressione del marcatore osteoclasti geni nelle cellule del midollo osseo; recettore della calcitonina, catepsina K, TRAP, e dei recettori degli osteoclasti associate. Anche il numero di TRAP cellule multinucleate positive è stata diminuita in presenza di fibroblasti. In particolare, i fibroblasti palatali aumentato l'espressione di CD14 e le proteine co-stimolatorie CD40, CD80, CD86 e nelle cellule del midollo osseo. cellule del midollo osseo non hanno avuto un impatto sulla vitalità dei fibroblasti e marcatori della proliferazione geni. Per quanto riguarda la distribuzione delle celle, osteoclasti erano più prominente nel centro delle membrane, mentre i fibroblasti accumulati immediatamente adiacente al bordo dell'inserto formando una struttura ad anello sulla superficie della piastra di coltura.
Conclusione
L' i dati suggeriscono che i fibroblasti palatali offrono un ambiente paracrino che riduce osteoclastogenesi e aumenta marcatori di cellule presentanti l'antigene. Senza dimenticare che il modello paracrina rivelato un'attività congiunta tra i fibroblasti palatali e le cellule del midollo osseo visualizzati dalla distribuzione delle cellule caratteristica due compartimenti separati.
Parole
fibroblasti palatali Osteoclasta macrofagi Co-cultura Inserisce murino ossee culture osseo Sfondo
palatali innesti di tessuto connettivo sono utilizzati in parodontologia per la copertura della radice e per il trattamento di difetti di recessione gengivale [1]. Palatali innesti di tessuto connettivo sono stati anche proposti per migliorare i parametri estetici quando l'osso buccale è sottile o riassorbito in implantologia e protesi [2-6]. A seconda della tecnica utilizzata, palatali innesti di tessuto connettivo possono essere collocati a diretto contatto con l'osso alveolare. La questione si pone per il possibile impatto degli innesti di tessuto connettivo palatale con l'osso alveolare. Vi è il supporto di almeno debole per un potenziale ruolo di innesti di tessuto connettivo nel preservare l'osso sottostante. Connettivo innesto di tessuto messo a vestibolare della parete ossea, subito dopo l'estrazione del dente, ha prodotto un ragionevole conservazione dei tessuti duri [7]. Inoltre, gengivali innesti connettivali possono ridurre il riassorbimento della cresta marginale modelli canini [8]. Presi insieme, entrambi gli studi preclinici sostengono l'ipotesi che innesti di tessuto connettivo possono preservare l'osso alveolare; il meccanismo cellulare sottostante tuttavia rimane sconosciuta.
Il meccanismo cellulare può essere attribuito all'attività paracrina dei fibroblasti palatali. Questa ipotesi è supportata da esperimenti in vitro con fibroblasti gengivali isolati e la loro capacità di influenzare osteoclastogenesis, la formazione di cellule ossee-riassorbono. Ad esempio, mezzo condizionato ottenuto da fibroblasti gengivali e fibroblasti del legamento parodontale inibire la formazione di cellule osteoclasti-come nel topo osso culture midollo [9-11]. E 'quindi probabile che i fattori paracrini rilasciati da fibroblasti palatali in grado di ridurre il processo di osteoclastogenesis. Più interessante è quello di comprendere il meccanismo molecolare come i fattori paracrini rilasciati da fibroblasti palatali cambiare l'espressione di geni che rappresentano osteoclasti, ma anche il cellule presentanti l'antigene, sia di origine cellule precursori FOM ematopoietiche.
Osteoclastogenesi in colture di midollo osseo di topo richiede le presenze di recettore attivatore del fattore nucleare kappa-B ligando (RANKL), M-CSF, ei rispettivi recettori [12]. Gli osteoclasti sono tipicamente multinucleate ed esprimono fosfatasi tartrato-resistente agli acidi (TRAP), catepsina K (CatK) e il recettore calcitonina (CTR). Osteoclasti anche esprimono molecole co-stimolatorie attivando il motivo di attivazione a base di tirosina immunoreceptor (ITAM) percorso -dipendente [13]. recettore degli osteoclasti-associato (OSCAR) e del recettore innescando espresso in cellule mieloidi (TREM2) sono recettori che sono associati con le rispettive molecole adattatore Fc catena del recettore comune gamma (FcRγ) e DNAX-attivando proteina 12 kDa (DAP12), rispettivamente, [13] . Quando la differenziazione sposta verso un fenotipo macrofagi, l'espressione di CD14, un co-recettore per segnalazione lipopolisaccaride, e le proteine co-stimolatorie CD40, CD80 e CD86, comunemente espressa in cellule presentanti l'antigene quali monociti e macrofagi, fanno [14, 15].
Scopo di questo studio pilota presente era di studiare l'impatto ambientale paracrina dei fibroblasti palatali su osteoclastogenesi dai precursori del midollo osseo utilizzando un modello in vitro in cui entrambe le fonti di cellule sono separate da membrane delle cellule occlusivi.
Metodi
fibroblasti palatale umana
fibroblasti umani palatali sono stati preparati dalle culture espianto di tre donatori indipendenti dopo l'approvazione del comitato etico della Medical University di Vienna (EK Nr. 631/2007). I fibroblasti che crescevano fuori dalle espianti e non erano stati sottoposti a più di cinque passaggi sono stati utilizzati. I fibroblasti sono stati coltivati in Dubeccos Modified Eagle Medium (DMEM) con antibiotici (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA)) e placcato a 100.000 cellule /cm
2 nelle rispettive piastre da 12 pozzetti (Greiner-Bio-One GmbH) . Dopo il periodo di coltivazione, la colorazione del fibroblasti è stata eseguita con DiffQuik (Sistemi di diagnosi Roche, Basilea, Svizzera). Osseo culture
murino ossee
cellule del midollo osseo sono state preparate da vampate di calore femore e tibia di 4-8 settimane di vita femminile topi BALB /c (BE76 /12 Veterinärdienst des Kantons Berna) e testa di serie in inserti di coltura cellulare ThinCert ™ (12 formato bene con dimensioni dei pori nominali di 0,4, micron; Greiner-Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germania) a un milione di cellule per cm 2 in Minimum Essential medio-Alpha modifica di Eagle (αMEM) supplementato con 10% di vitello siero fetale (FCS), antibiotici, M-CSF a 25 mg /ml, TGF-β1 a 10 mcg /ml, e RANKL a 25 ug /ml. colture di midollo osseo sono state poi trasferite alle piastre che contenevano i fibroblasti. proteine ricombinanti sono stati acquistati da Prospec (Ness-Ziona, Israele). cellule del midollo osseo sono state coltivate con e senza l'fibroblasti. Entrambi i tipi di cellule rimangono separate dalla membrana cellulare occlusiva degli inserti colture cellulari ThinCert ™. Colorazione per TRAP (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) è stato eseguito al giorno cinque. Le cellule sono state prese in considerazione quando osteoclasti positivo per TRAP e avere tre o più nuclei come osservato al microscopio ottico.
Espressione di geni marcatori nelle colture di midollo osseo di topo
RNA è stato isolato dalle culture di midollo osseo e fibroblasti palatali con l'Alto Pure Isolation Kit RNA (Roche Applied Science, Rotkreuz, Svizzera). trascrizione inversa (RT) è stato eseguito con Transcriptor universale cDNA Maestro, e la PCR analisi sono state fatte in triplicato utilizzando TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) o il FastStart Universale Sonda Maestro Rox su un Real-Time PCR (7500 Roche). cellule del midollo osseo sono stati analizzati per i seguenti geni: SybrGreen: RANK, C-FMS, TRAF6, C-FOS, MITF, PU1, NFATc-1, DC-STAMP, ATP6V0D2, CD14, CD40, CD80, CD86, CD11c; TaqMan (Applied Biosystems, Carlsbad, CA): CTR, CATK, TRAP, OSCAR, TREM2, DAP12, FCRγ. I fibroblasti sono stati analizzati per i seguenti geni: BCL2, Plk1, CCNB1, CCNE1, CCND1, MYBL2, GAPDH, BAD, BAX e BCL-XL. I dati sono stati normalizzati per β-actina con il metodo ΔΔCt (Tabelle 1 e 2) .table 1 SybrGreen Primer per RT-PCR
Gene
Forward Primer
Reverse Primer
m 18 s
tccagcacattttgcgagta
cagtgatggcgaaggctatt
m βactin
ctaaggccaaccgtgaaaag
accagaggcatacagggaca
m RANK
gtgctgctcgttccactg
agatgctcataatgcctctcct
m c-fms
gaccatggtgaatggtaggg
ggataacgttgaatcccactg
m TRAF6
ttgcacattcagtgtttttgg
tgcaagtgtcgtgccaag
m c-fos
gcaactttctatgacactgaaacac
tctctctagggctgcattgg
m MITF
gacaccagccataaacgtca
ttttccaggtgggtctgc
m PU1
ggagaagctgatggcttgg
caggcgaatctttttcttgc
m NFATc-1
ccgttgcttccagaaaataaca
tgtgggatgtgaactcggaa
m DC-Stamp
aagctccttgagaaacgatca
caggactggaaaccagaaatg
m Atp6vOd2
aagcctttgtttgacgctgt
gccagcacattcatctgtacc
m CD14
aaagaaactgaagcctttctcg
agcaacaagccaagcacac
m CD40
gagtcagactaatgtcatctgtggtt
accccgaaaatggtgatg
m CD80
tcgtctttcacaagtgtcttcag
ttgccagtagattcggtcttc
m CD86
gaagccgaatcagcctagc
cagcgttactatcccgctct
m CD11c
gagccagaacttcccaactg
tcaggaacacgatgtcttgg
h βactin
ccaaccgcgagaagatga
ccagaggcgtacagggatag
h BCL2
caggagaatggataaggcaaa
ccagccagatttaggttcaaa
h Plk1
aaccgagttattcatcgagacc
ttggttgccagtccaaaatc
h CCNB1
cctccggtgttctgcttc
ttcagcattaattttcgagttcc
h CCNE1
ggccaaaatcgacaggac
gggtctgcacagactgcat
h CCND1
gccgagaagctgtgcatc
ccacttgagcttgttcacca
h MYBL2
gtcaaatggacccatgagga
gtcagtgcggttagggaagt
h GAPDH
agccacatcgctcagacac
gcccaatacgaccaaatc
h BAD
cgagtttgtggactcctttaaga
caccaggactggaagactcg
h BAX
agcaaactggtgctcaagg
tcttggatccagcccaac
h BCL XL
agccttggatccaggagaa
agcggttgaagcgttcct
Tabella 2 TaqMan Primer Assay ID per RT-PCR
m CTR
Mm 00432282_m1
m CatK
Mm 00484039_m1
m TRAP
Mm 00475698_m1
m Oscar
Mm 00558665_m1
m TREM2
Mm 04209424_g1
m DAP12
Mm 00449152_m1
m FcRγ
Mm 02343757_m1
analisi statistica
Le colture cellulari sono stati fatti utilizzando almeno albero diverso donatori di fibroblasti. I due gruppi sono stati confrontati con il T-accoppiato
test con α & lt; 5%.
Risultati
fibroblasti palatali inibiscono le cellule osteoclasti-come
percorso Per determinare l'impatto del palato fibroblasti su osteoclastogenesi, è stato eseguito un modello di co-coltura paracrino sulla base di inserti. Un risultato principale è che la presenza di fibroblasti palatali nella camera inferiore diminuito l'espressione dei geni marcatori tipici degli osteoclasti CTR, CATK, TRAP e Oscar di circa il 30% (p & lt;
0.05), ma non l'altro co molecole stimolante del osteoclastogenesi. RANK e c-fms anche rimasti invariati. Inoltre, TRAP colorazione era visibilmente ridotto in presenza di fibroblasti palatina. numero di osteoclasti in co-coltura con fibroblasti per regione di interesse significa, selezionati a caso in ogni pozzetto: 11.7 (SD 6.7). numero degli osteoclasti senza fibroblasti per regione di interesse medio è stato di 53.0 (SD 12.8; p & lt;
0,05). È importante sottolineare che la presenza di fibroblasti palatali aumentato l'espressione di CD14 e le proteine co-stimolatorie CD40, CD80 e CD86 di circa 2-4 volte (p & lt;
0.05) rispetto ai rispettivi controlli senza la presenza di fibroblasti palatali (Tabella 3). Così, i dati supportano il concetto che i fibroblasti palatali favoriscono lo sviluppo delle cellule presentanti l'antigene piuttosto che un fenotipo osteoclasti. cellule del midollo osseo non influenzano la vitalità o la proliferazione dei fibroblasti palatali, come indicato dalla analisi di espressione di geni correlati ciclo apoptosi e di cella (dati non mostrati) .table 3 RT-PCR di cellule osteoclasti-simili (OCL) in co -Culture con fibroblasti palato (PF) utilizzando M-CSF, RANKL e TGF-β1 rispetto al co-culture senza PF, con valori medi e deviazione standard
destinazione genes
CD14
CD40
CD80
CD86
CTR
CatK
TRAP
OSCAR
Mean
3.13
2.48
1.57
4.31
0.63
0.71
0.75
0.62
Standard Deviation
0.66
0.82
0.53
1.42
0.31
0.34
0.31
0.30
I geni sono stati cluster di differenziazione 14, 40, 80 e 86 (CD), calcitonina recettore (CTR), catepsina K (CatK), tartrato-resistente fosfatasi acida 5 (TRAP), immunoglobuline-like receptor osteoclasti-associato (OSCAR). La tabella rappresenta la media e deviazione standard di n = 6
derivante da due esperimenti indipendenti con fibroblasti da tre diversi donatori. Tutti i valori medi erano diversi rispetto ai controlli senza fibroblasti (p & lt;
0.05)
distribuzione Caratteristica degli osteoclasti e palatale fibroblasti nell'inserto culture di fibroblasti
palatale hanno avuto un forte impatto sulla distribuzione degli osteoclasti. TRAP osteoclasti positivi erano prominenti nel centro dell'inserto (Fig. 1). Un altro fenomeno avvenuto verso la distribuzione dei fibroblasti palatali. I fibroblasti accumulati immediatamente adiacente al bordo dell'inserto, formando un anello di elevata densità cellulare (Fig. 1). Queste osservazioni essenzialmente sostengono che palatale fibroblasti riducono la formazione degli osteoclasti in un modo paracrino d'azione, ma anche che le cellule del midollo osseo possono ottenere fibroblasti in vitro. Pertanto, il modello paracrina basato su membrane occlusive cellulare con cellule di midollo osseo negli inserti e fibroblasti nel vano inferiore della piastra di coltura rivelato un'attività reciproca visualizzata dalla distribuzione cella differenziale. Figura. 1 La colorazione dei fibroblasti nei pozzi e le cellule osteoclasti simile a inserti dopo incubazione cellule del midollo osseo di topo per 5 giorni con M-CSF, RANKL e TGF-β1 (MRT). culture combinati con fibroblasti e osteoclasti (a1) hanno mostrato un accumulo di fibroblasti immediatamente adiacenti al bordo dell'inserto, formando un anello di fibroblasti ad alta densità di cella (a2, a3). Inoltre, fibroblasti palatale avuto un forte impatto sulla distribuzione degli osteoclasti: osteoclasti erano prominenti nel centro dell'inserto (a4, a5). In colture erano fibroblasti erano presenti (b1, b2, b3), il TRAP-colorazione delle cellule osteoclasti-simili hanno mostrato una riduzione del numero ed erano più uniformemente distribuite rispetto al osteoclasti cellule che avevano interazione con fibroblasti (b4, b5)
Discussione
il risultato principale di questo studio è che i fibroblasti palatali creato un ambiente paracrino che moderatamente soppresso osteoclastogenesi mentre spostando la differenziazione verso un fenotipo dei macrofagi. master geni osteoclasti sono stati inibiti in presenza di fibroblasti, mentre i geni caratteristici per le cellule presentanti l'antigene sono stati upregulated. RANK e c-fms rimasti invariati suggerendo che il passaggio differenziazione non può essere spiegato da una diminuzione della reattività ai rispettivi ligandi, con M-CSF essere critico anche per lo sviluppo monociti. Inoltre, abbiamo osservato una caratteristica distribuzione delle celle vitro, con osteoclasti rimanenti nei centri degli inserti, mentre i fibroblasti accumulati in una struttura ad anello.
Questi risultati in vitro sono interessanti perché essenzialmente sostengono le osservazioni da studi preclinici che innesti di tessuto connettivo riducono il riassorbimento della parete ossea buccale [7, 8]. Non è sorprendente che ridotto osteoclastogenesi va di pari passo con uno spostamento verso le cellule presentanti l'antigene. Osservazioni simili sono state fatte con la saliva [15], e anche doxiciclina e minociclina indotto l'espressione di marcatori di cellule dendritiche, CD11c e CD86, in cellule del midollo osseo in presenza di RANKL [14]. Presi insieme, i dati forniscono intuizioni un possibile meccanismo paracrino su come fibroblasti palatale può ridurre osteoclastogenesis visualizzando contemporaneamente immunità innata indicato dall'espressione di marcatori di cellule presentanti l'antigene, almeno in vitro. Chiaramente questo non è una conclusione, piuttosto un suggerimento supportato essere i nostri dati preliminari. Pertanto, i dati in vitro e particularily la possibile rilevanza clinica devono essere interpretati con cautela.
Lo studio pilota ha ulteriori limitazioni. Questo è uno studio osservazionale che mostra un fenomeno, mentre i meccanismi molecolari alla base rimangono poco chiari. I fattori rilasciati dai fibroblasti palatali che sono responsabili per il passaggio osservata dal osteoclastogenesis verso la formazione di cellule presentanti l'antigene non ancora ulteriormente definita rimane da determinare. Un probabile candidato è osteoprotegerina, un decoy-recettore per RANKL [12]. Osteoprotegerina è prodotto da fibroblasti, ma che si estendono e, se non del tutto, questo fattore ha causato l'inibizione della osteoclastogenesis è ancora chiaro. Inoltre, abbiamo usato un sistema di xenogenico, che potrebbero aver influenzato il risultato globale; fibroblasti palatali umani e di cellule di midollo osseo di topo. Tuttavia, le molecole che svolgono un ruolo nella differenziazione degli osteoclasti sono evolutiva conservati e quindi funzionano inter-specie [16]. Pertanto, l'uso di cellule del midollo osseo del mouse in combinazione con fibroblasti umani è appropriato come un esperimento di prova di principi che possono essere raffinato per il futuro utilizzo di interspecie in modelli in vitro.
Conclusioni
Nel loro insieme, il presente studio pilota è una base scientifica per la ricerca futura con l'obiettivo di rivelare l'impatto dell'ambiente paracrina dei fibroblasti palatali sulla osteoclastogenesi e il relativo impatto sul sistema immunitario innato. Il presente studio è anche un primer per studiare ulteriormente la dinamica del movimento delle cellule create dall'ambiente paracrino reciproco.
Disponibilità di dati e materiali
I set di dati a sostegno delle conclusioni di questo articolo sono compresi all'interno dell'articolo.
dichiarazioni
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare Catherine Solioz per la sua assistenza. Lo studio è stato sostenuto da un ITI di Grant 852_2012
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autori
VV eseguito gli esperimenti e scritto insieme a RG il manoscritto.; RG prevede il disegno dello studio, JCS ha contribuito a stabilire le modalità e workted sulle figure. AS ha contribuito a redigere e rivedere il manoscritto. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.
