Abstract
sfondo
rigenerazione dei tessuti parodontali è un importante obiettivo della terapia parodontale. Le cellule staminali polpa dentale (DPSCs) mostrano proprietà delle celle mesenchimali con il potenziale per l'ingegneria dei tessuti dentali. Smalto matrice derivata (EMD) e il fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) sono esempi di materiali che agiscono come molecole di segnalazione per migliorare la rigenerazione parodontale. Mineral triossido di aggregazione (MTA) ha dimostrato di essere biocompatibile e sembra avere alcune proprietà osteoconduttive. L'obiettivo di questo studio era di valutare gli effetti di EMD, MTA, e PDGF su DPSC differenziazione osteogenica
. Metodi
DPSCs umani sono state coltivate in terreno contenente EMD, MTA, o PDGF. I gruppi di controllo sono stati istituiti. Valutazione della osteogenesi raggiunto è stata effettuata attraverso l'analisi del computer di fosfatasi alcalina (ALP) -stained camere, e analisi spettrofotometrica di rosso alizarina noduli mineralizzati S-macchiato.
Risultati
EMD ha aumentato significativamente la quantità di espressione ALP e mineralizzazione rispetto a tutti gli altri gruppi (P
& lt; 0,05). Nel frattempo, MTA ha dato risultati variabili con lievi incrementi alcuni parametri differenziazione e PDGF ha mostrato alcun aumento significativo del differenziamento raggiunto.
Conclusioni
EMD ha mostrato una forte capacità osteogenica rispetto PDGF e MTA, e gli attuali risultati forniscono il supporto per il suo utilizzo nella rigenerazione parodontale.
Parole
dentale cellule staminali polpa Osteogenesi MTA EMD PDG Sfondo
Il principale obiettivo della terapia parodontale è quello di rigenerare strutture del dente di supporto distrutte dalla malattia parodontale [1]. ingegneria tissutale parodontale comporta complesse interazioni tra le diverse cellule e molecole di segnalazione, così come ponteggi biologici [2].
Nel tentativo di imitare gli eventi evolutivi originali, l'uso integrato di popolazioni di cellule precursore con specifiche stimolanti biologici è sotto inchiesta [ ,,,0],3, 4]. Le cellule staminali rappresentano le cellule primitive non specializzate con ampie funzionalità per la differenziazione e la rigenerazione dei tessuti. Fino ad oggi, le cellule staminali mesenchimali sono state isolate con successo da diversi organi del corpo [5], tra cui molteplici tessuti con origini dentali [6-9]. Tali cellule staminali derivate dal tessuto dentale sono stati trovati per mantenere la capacità potente per la specifica differenziazione nelle cellule del tessuto formante dentali [6, 10, 11]. Gronthos e colleghi hanno isolato con successo le cellule staminali dentali umane polpa (DPSCs), e si è dimostrato sia la loro multipotenza e di auto-rinnovamento capacità [11, 12]. Ulteriori studi hanno confermato i loro risultati [13, 14]. Questo multipotenza, oltre alla loro relativa accessibilità, fatta DPSCs una fonte interessante di celle per applicazioni in medicina rigenerativa [15-18]. Infatti, numerosi lavori hanno dimostrato la loro superiorità in diversi aspetti, quali la differenziazione osteogenica [19, 20], che ha sostenuto il loro uso per la rigenerazione di difetti craniofacciali [21, 22], nonché difetti ossei alveolari [23, 24]. Inoltre, i simili origini embrionali delle cellule della polpa dentale e cellule parodontali [25] e la loro presenza all'interno di strati protettivi di struttura del dente hanno incoraggiato il loro utilizzo per la rigenerazione dei tessuti parodontali [26, 27].
Studi sull'ingegneria tissutale hanno utilizzato mediatori biologici per migliorare selettivamente il reclutamento di popolazioni cellulari in ferite parodontali [28]. Smalto matrice derivata (EMD) è una proteina raccolto da sviluppare denti suina che è stato segnalato per indurre la formazione di cemento e rigenerazione parodontale [29]. A livello cellulare, EMD è stato dimostrato di avere effetti regolatori su più tipi di cellule parodontali [28, 30].
Fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) è un fattore normativo molto potente che inizia quasi tutti gli eventi della ferita di guarigione. La funzione principale del PDGF è quello di stimolare la replicazione cellulare (mitogenesi) di cellule staminali di guarigione-grado e cellule osteoprogenitrici parzialmente differenziate, che fanno parte del tessuto connettivo-guarigione ossea cellulare make-up [31]. Aumenti significativi in osso e la formazione di cemento sono stati riportati istologicamente [32]. A livello cellulare, PDGF aumentato il numero di cellule collagene sintesi [33] e stimolato osso sialoproteina trascrizione [34].
Un altro materiale con la capacità di indurre la rigenerazione è triossido minerale aggregata (MTA). MTA è una miscela di silicato bicalcico, silicato tricalcico, alluminato tricalcico, gesso, e tetracalcium aluminoferrite [35]. Torabinejad et al. [36] hanno riportato un favorevole prestazione biologica di MTA a diretto contatto con l'osso, attraverso la deposizione e la formazione di idrossiapatite sulla sua superficie. Il materiale è stato anche trovato per migliorare la produzione cellulare di collagene di tipo I, osteocalcina, fosfatasi alcalina (ALP), sialoproteina osso, e osteopontina [37]. Una revisione sistematica sulle risposte istologiche del parodonto al materiale concluso che MTA ha promosso la guarigione verso la rigenerazione [38].
Le conclusioni di cui sopra suggeriscono prestazioni cliniche simili per i tre materiali senza precedenti tentativi per confronti diretti. Di conseguenza, lo scopo del presente studio era di esaminare e confrontare gli effetti di EMD, PDGF, e MTA sulla differenziazione osteogenica di DPSCs.
Risultati
isolamento delle cellule e la caratterizzazione
cellule staminali polpa dentale nel primario culture hanno iniziato ad apparire in 5-14 giorni e divenne attaccato alle superfici delle piastre (Fig. 1a). Le cellule del secondo passaggio formate correttamente più colonie, con circa 50 cellule per colonia (Fig. 1b). Flusso espressioni positive citometria analisi hanno confermato di marcatori di cellule stromali associate, con espressioni negative di marcatori emopoietici ed endoteliali (Fig. 1 g). Le cellule che hanno subito induzione osteogenico dimostrarono aumentato ALP colorazione rispetto alle cellule negative di controllo (Fig. 1c, d), mentre le cellule coltivate in mezzo adipogenico esposte diverse olio rosso O-positive granuli lipidici (Fig. 1e, f). Figura. 1 immagini microscopiche invertito la luce che mostrano un dentali cellule staminali mesenchimali polpa in colture primarie, ingrandimento 5 ×. b unità formanti colonia Fibroblast (CFU-F) ingrandimento 5 ×, c, d colorazione fosfatasi alcalina per DPSCs 14 giorni dopo osteoinduzione (c) rispetto controllo negativo (d), ingrandimento 10 × e O colorazione rossa olio per DPSCs 14 giorni dopo induzione adipogenico (e) rispetto al controllo negativo (f), ingrandimento 40 ×. g FACS i risultati delle analisi di una linea cellulare polpa dentale rappresentante
Materiale applicazione
ALP colorazione
I campioni hanno mostrato diversi gradi di colorazione ALP (Fig. 2). One-way ANOVA ha rivelato differenze significative tra i gruppi a confronto (p & lt; 0,0001) (Tabella 1). Figura. 2 immagini Scanoscope per ALP macchiati diversi gruppi sperimentali di DPSCs. L'immagine interna rappresenta il campo valutata, che rende circa 1/4 ° dell'immagine. ingrandimento originale × 1.4. bar Scala 1 mm. un controllo negativo, controllo b Riferimento (OT), c EMD, d MTA, e PDGF
Tabella 1 rappresenta i risultati dell'analisi della fosfatasi alcalina per tutti i gruppi
Materiale /Gruppo
media
deviazione standard (SD)
post hoc test di Tukey per importanza tra i gruppi
Percentuale totale positivo
controllo negativo
16.29
4.95
OT *
EMD *
MTA *
PDGF *
OT
72.92
9.24
negative control*
EMD*
MTA*
PDGF*
EMD
95.59
4.69
Negative control*
OT*
MTA*
PDGF*
MTA
64.19
9.95
-ve control*
OT*
EMD*
PDGF*
PDGF
48.80
12.62
Negative Controllo *
OT *
EMD *
MTA *
media densità ottica
negativo control
0.18
0.01
OT*
EMD*
MTA*
PDGF*
OT
0.26
0.02
Negative control*
EMD*
MTA
PDGF*
EMD
0.35
0.03
Negative control*
OT*
MTA*
PDGF*
MTA
0.26
0.02
Negative control*
OT
EMD*
PDGF
PDGF
0.24
0.03
Negative Controllo *
OT *
EMD *
MTA
istologica Score
negativo control
20.633
7.034
OT*
EMD*
MTA*
PDGF*
OT
132.974
22.944
Negative control*
EMD*
MTA
PDGF*
EMD
221.992
23.818
Negative control*
OT*
MTA*
PDGF*
MTA
114.340
20.914
Negative control*
OT
EMD*
PDGF*
PDGF
82.330
28.254
Negative Controllo *
OT *
EMD *
MTA *
confronto NBIntergroup era statisticamente significativa utilizzando il test ANOVA, P
& lt; 0,0001
* Indica significatività statistica con P
& lt; 0.05
per tutti i parametri esaminati, EMD è stata significativamente superiore a quello di tutti gli altri gruppi (p & lt; 0,05). EMD ha rivelato significativamente più alto per cento dell'area totale colorazione positiva, densità ottica media, e punteggi istologici (95,6 ± 4,7%, 0,35 ± 0,03, 221.99 ± 23.8) di MTA (64.19%, 0,26 ± 0,02, 114.34 ± 20.90; P & lt; 0,05) PDGF (48,8% ± 12.62, 0.24 ± 0.02, 82.33 ± 28,3; P & lt; 0.05). e controllo riferimento
al contrario, MTA dato risultati inconsistenti, anche se ha aumentato l'attività ALP in modo simile al controllo riferimento quando valutate dalla densità ottica, il materiale portato riduzioni degli altri parametri rispetto al controllo di riferimento, anche se tali riduzioni non erano sempre significativa (P
& gt; 0,05)
per quanto riguarda PDGF, espressione ALP generalmente. ha rivelato i risultati inferiori rispetto al controllo di riferimento per i tre parametri, rispettivamente, e queste riduzioni sono state costantemente significativa (P & lt; 0,05; Tabella 1)
alizarina rosso S colorazione
ci sono state differenze evidenti nelle quantità di mineralizzazione tra. i gruppi (Fig. 3). One-way ANOVA ha rivelato queste differenze per essere significativa (P
& lt; 0,0001) (Tabella 2). Figura. 3 invertito immagine al microscopio luce presentando alizarina rossa S colorazione per le diverse DPSCs gruppi sperimentali. ingrandimento originale × 10. barra della scala di 200 micron. un controllo negativo, controllo b Riferimento (OT), c EMD, d MTA, e PDGF
Tabella 2 Rappresenta il tasso medio di assorbanza per alizarina rosso S camere colorate di tutti i gruppi
Materiale /Gruppo
media
deviazione standard (SD) prova
post hoc di Tukey per importanza tra i gruppi
negativi control
0.079
0.007
OT
EMD*
MTA*
PDGF
OT
0.107
0.016
Negative control
EMD*
MTA
PDGF
EMD
1.197
0.132
Negative control*
OT*
MTA*
PDGF*
MTA
0.163
0.117
Negative control*
OT
EMD*
PDGF*
PDGF
0.097
0.010
Negative Controllo
OT
EMD *
MTA *
OT
controllo di riferimento per osteoinduzione , EMD
Emdogain, MTA
minerale triossido di aggregazione, PDGF
piastrine di crescita derivato fattore-BB
confronto NBIntergroup è risultata statisticamente significativa utilizzando il test ANOVA, P
& lt; 0,0001
* Indica significatività statistica con P
& lt; 0.05
Il gruppo EMD ha avuto un aumento significativo del numero di formazione di noduli mineralizzata rispetto a tutti gli altri gruppi, dando una assorbanza media di 1.2 ± 0.13 (P
& lt; 0,05).
Il gruppo MTA significativamente maggiore quantità di mineralizzazione (assorbanza: 0.16 ± 0.12)., rispetto al gruppo di controllo negativo (0,08 ± 0,01), e il gruppo PDGF (0,09 ± 0,01)
Anche se l'assorbanza del gruppo PDGF media (0,09 ± 0,01) sembrava essere un po ' diverso rispetto agli altri gruppi, queste differenze erano statisticamente non significativa (P
& gt; 0,05; Tabella 2).
Discussione
In questo studio, di successo isolamento delle cellule polpa dentale è stato raggiunto attraverso l'applicazione di enzimatica digestione con alcune modifiche al protocollo di Gronthos et al. [11]. Le cellule ottenute hanno subito numerose indagini per valutare le loro proprietà. Secondo l'International Society for Cellular Therapy [39], i criteri minimi per la definizione di cellule multipotenti mesenchimali stromali includono: (1) l'adesione a piatti di plastica; (2) potenziale di differenziazione multipotenti; e (3) espressione di specifici marcatori di superficie stromale (CD73, CD90, CD105) con la mancanza di espressioni di marcatori ematopoietici (CD45, CD34, CD14 e /o CD11b, CD19, CD79α) e il marcatore HLA-DR. Le cellule isolate in questo studio hanno presentato tutte le caratteristiche di cui sopra.
Concentrazioni materiali differenti sono stati valutati, e sono state selezionate le concentrazioni con la migliore differenziazione. Queste concentrazioni erano 200 ug /ml per EMD, 5 ng /ml per PDGF, e 0,05 mg /ml per MTA. Le stesse concentrazioni erano già stati utilizzati in altri studi [34, 40, 41]. In questo studio, l'analisi del computer per l'attività ALP e una tecnica di valutazione semiquantitativa per alizarin S colorazione rosso sono stati selezionati, come queste due tecniche sono stati segnalati per fornire risultati con sensibilità relativa, e sono stati applicati in studi precedenti [42, 43].
Per EMD, i risultati hanno rivelato un aumento significativo di espressione ALP e abbondante valorizzazione mineralizzazione seguenti sua applicazione. Questi risultati sono in accordo con molti altri studi per valutare gli effetti di questo materiale su più linee cellulari [40, 44-48]. Duan et al. [44] ha rilevato che EMD migliorato la differenziazione osteogenico di cellule staminali pluripotenti indotte, come evidenziato da un aumento di espressione RUNX2 mRNA. KEMOUN et al. [45, 46] hanno valutato gli effetti della EMD sulle cellule follicolari [45] e le cellule staminali del legamento parodontale [46]. In entrambi gli studi, EMD è stato trovato per migliorare il rilascio ALP e deposizione di calcio, oltre alla elevazione di diversi marcatori di mineralizzazione. Un altro studio condotto da Guven et al. [47] ha rilevato che Emdogain è stato il materiale più efficace per accrescere sia la proliferazione e la differenziazione odontogena delle cellule staminali germinali del dente umano attraverso la valutazione dell'attività ALP, Von Kossa colorazione, e RT-PCR analisi per la dentina sialophosphoprotein (DSPP), e immunocolorazione per collagene di tipo I e DSPP. Uno studio di Wang et al. [48] ha rilevato che Emdogain migliorato la mineralizzazione delle DPSCs così come la loro osteogenic /espressione marcatore odontogenic. Tuttavia, gli studi con risultati contraddittori sono disponibili anche [49, 50]. E 'stato riferito che EMD potrebbe non avere effetti apprezzabili sulla differenziazione degli osteoblasti in cellule parodontali legamento [49] o cellule di midollo osseo di ratto [50]. Anche se il meccanismo di controllo esatto rimane poco chiaro, questi effetti sono stati spiegati da differenze nei livelli di immaturità cellulare, vale a dire il materiale è stato pensato per migliorare la proliferazione cellulare delle cellule più immature, ma la differenziazione delle cellule in fasi successive di maturità [51].
Nel presente studio, MTA ha dato risultati inconsistenti. Il materiale ha rivelato miglioramento mineralizzazione in confronto con il controllo di riferimento, la riduzione di alcuni parametri ALP (per cento dell'area totale colorazione positiva e punteggio istologico), e la manutenzione di altri parametri (densità ottica media). Sebbene Yasuda et al. [52] e Lee et al. [53] hanno riportato che la MTA ha aumentato la produzione di ALP e /o formazione di noduli mineralizzati rispetto alle cellule di controllo, sia Koh et al. [54] e Nakayama et al. [55] hanno riportato espressione ALP simile tra le cellule MTA-trattati e le cellule di controllo negativo. Queste incongruenze suggeriscono che ulteriori valutazione dei diversi parametri di guida e che influenzano le prestazioni di questo materiale è giustificata.
Quanto riguarda PDGF nel presente studio, è stato osservato che l'espressione ALP generalmente rivelato risultati inferiori rispetto al gruppo di controllo negativo così come tutti gli altri gruppi di materiali, e le differenze erano sempre significative. Indipendentemente azione del materiale in enhancement proliferativa, PDGF-BB sembrava avere alcun ulteriore vantaggio per la differenziazione osteogenico, secondo i parametri valutati in questo studio. Molti altri autori hanno osservato risultati simili [33, 56]. In realtà, PDGF migliorato degradazione del collagene osseo [33], e interrotto o la formazione di matrice ossea inibito [56]. Nakashima et al. [57] ha rilevato che PDGF aumento della sintesi del DNA, mentre provocando 40-65% inibizione dell'attività ALP. Tanaka e Liang [58] hanno riferito che il materiale ha esercitato alcun effetto sulle attività ALP cellulare o la sintesi del collagene. Yokose et al. [59] hanno riportato che PDGF-BB ha ridotto significativamente l'attività ALP di DPSCs.
Conclusioni sono state dimostrate favorevoli
interazioni cellula-superficie con EMD, compresa l'espressione ALP e abbondante mineralizzazione. EMD ha dato risultati superiori rispetto al MTA e PDGF per quanto riguarda la differenziazione delle osteogenico DPSCs. Gli effetti della MTA osteogenesi di DPSCs sono stati inconcludenti e sono necessari ulteriori studi. Inoltre, i nostri dati su PDGF non hanno sostenuto la sua capacità di indurre la differenziazione osteogenica di DPSCs. Tuttavia, PDGF fatto facilitare l'adesione cellulare e la crescita, suggerendo un diverso meccanismo di azione che merita ulteriori indagini.
Metodi
isolamento di cellule staminali
DPSCs umani sono stati isolati e caratterizzati dalla a l'Unità Stem Cell gli autori, king Saud University, Regno dell'Arabia Saudita (dati non pubblicati). I denti sono stati raccolti da pazienti dopo hanno fornito firmate consenso informato, secondo un protocollo approvato dal Comitato Etico istituzionale (College of Dentistry Research Center-CDRC).
In breve, il contenuto di polpa dei denti molari appena estratti sono stati combinati e sottoposti a 20-40 minuti di digestione enzimatica con collagenasi di tipo I (1 mg /ml) e dispasi (5000 unità caseinolitica). Successivamente, le cellule sono state lasciate crescere in condizioni di coltura cellulare regolari (37 ° C, 5% CO
2), utilizzando modificata mezzo di Eagle Dulbecco (DMEM) supplementato con siero 20% bovino fetale (FBS), 1% penicillina streptomicina (Pen-Strept), e 1% di aminoacidi non essenziali (tutti acquistati da Gibco-Invitrogen, USA).
caratterizzazione di cellule staminali
formanti colonia di quote fibroblasti (CFU-F)
CFU -F sono stati valutati da coltura 2,5 × 10 3 celle al secondo passaggio in piatti della cultura 6 cm. Al giorno 14, le cellule sono state fissate con 1% paraformaldeide, colorate con violetto di cristallo 0,5%, e sottoposti a valutazione microscopica utilizzando un microscopio a contrasto di fase luce invertita (Zeiss, Leica, Germania).
Citometria di flusso
Quarto cellule passaggio (1,5 × 10 6) sono state lavate con FACS tampone (1 × phosphate-buffered saline, 5% FBS, 0,1% di sodio azide) e diluiti in 1,5 ml di soluzione salina tamponata con fosfato. Successivamente, il mouse PE-coniugato anti-umano CD146, CD73, CD29 e HLA-DR, FITC topo coniugato CD34, mouse CD90, CD45, CD13, CD31 e, e APC-coniugato anti-umano anti-umano CD105, CD14, e gli anticorpi CD44 sono stati preparati in scuro (il tutto da BD Biosciences, stati Uniti d'America, tranne che per l'anticorpo monoclonale contro CD105 umano, che è stato acquistato da R & amp; D Systems, USA) e utilizzati. In ogni tubo FACS, 100 ml di cellule sono stati mescolati con 10 ml di corrispondenti anticorpi, e incubate per 30 minuti al buio a 4 ° C. Le espressioni di marcatori cellulari sono stati valutati utilizzando un Becton Dickinson FACSCalibur Citofluorimetro (BD Biosciences, Stati Uniti d'America), ei dati risultanti sono stati analizzati utilizzando Cell Quest Pro Software versione 3.3, BD Bioscience, Stati Uniti d'America).
Osteogenico e la differenziazione adipogenico
celle al quarto passaggio sono state coltivate su piastre da 6 pozzetti. Al 60-70% di confluenza, differenziazione osteogenico è stato indotto usando media osteoinduzione preparato secondo il protocollo di Vishnubalaji et al. [60], e composto da DMEM supplementato con 10% FBS, 1% Pen-Strept, /ml di acido L-ascorbico 50 mg (Wako Chemicals GmbH, Germania), 10 mM glicerofosfato sale disodico (β-glicerofosfato), 10 nM desametasone e 10 nM calcitriolo (1α, 25-diidrossivitamina D3) (Sigma, UK). Le cellule mantenute in mezzo di coltura normale serviti come controlli. L'osteogenesi risultante è stata valutata dopo 14 giorni attraverso colorazione citochimica per ALP.
Differenziazione adipogenico è stata anche indotta utilizzando media adipogenico di riferimento [60], composto da DMEM supplementato con 10% FBS, 10% di siero di cavallo, 1% Pen-Strept, 100 nM desametasone, 0,45 mm isobutil metil xantina, 3 mg /ml di insulina (tutti acquistati da Sigma, UK), e 1 mM rosiglitazone (BRL49653, Novo Nordisk, Danimarca). La differenziazione risultante è stata valutata a 14 giorni attraverso l'uso del rosso O colorazione olio.
Applicazione Materiale
Inizialmente, è stato effettuato uno studio pilota per valutare tre differenti concentrazioni per ciascun materiale, e le concentrazioni ottiene il maggior numero di differenziazione sono stati selezionati per i confronti (Fig. 4). Successivamente, le cellule al quarto passaggio sono stati coltivati e divisi in cinque gruppi come illustrato di seguito. Figura. 4 immagini Scanoscope per ALP macchiati diversi gruppi sperimentali di DPSCs. ingrandimento originale × 1.4. bar Scala 1 mm. a, b, c EMD a concentrazioni di 50, 100, 200 ug /ml rispettivamente. d, e, f PDGF a concentrazioni di 5, 10, 20 ng /ml, rispettivamente. g, h, i MTA a concentrazioni di 0,02, 0,2, 2,0 mg /ml rispettivamente. j Percent superficie totale positività per diverse concentrazioni di ciascun esaminato materiali
1. negativi controllo: cellule mantenute in mezzo di coltura cellulare per regolare l'intero esperimento (DMEM con 20% FBS, 1% Pen-Strept, 1% non- aminoacidi essenziali).
2. Controllo di riferimento (OT): cellule in coltura nel mezzo osteoinduzione, preparato secondo il protocollo di Vishnubalaji et al. [60].
3. Gruppo Merck: cellule coltivate in mezzo osteoinduzione integrato con 200 mg /ml EMD (Straumann, USA)
4.. PDGF Gruppo: cellule coltivate in mezzo osteoinduzione integrato con 5 ng /ml PDGF-BB (Osteohealth, USA)
5.. MTA Gruppo:. Cellule coltivate in mezzo osteoinduzione integrato con 0,02 mg /ml MTA (Dentsply, USA)
La differenziazione ottenuto è stato analizzato dalla valutazione dell'espressione ALP attraverso ALP colorazione e la deposizione di ioni calcio attraverso alizarin rosso S colorazione.
attività ALP
le cellule sono state seminate su vetrini 8-camera alla densità di 0,02 × 10 6 celle /camera e ha permesso di collegare e far crescere al 50% di confluenza. Successivamente, i vetrini sono stati divisi in cinque diversi gruppi summenzionati e medie regolare o osteogenico è stato applicato conseguenza. Il giorno 5, le cellule sono state fissate e colorate per ALP con soluzione naftolo-AS-TR-fosfato (Sigma, UK). Successivamente, le camere sono state valutate sotto un microscopio digitale ad alta risoluzione in cui l'intero camere colorate sono stati scansionati con uno scanner di diapositive ScanScope (Aperio Technologies Inc., Stati Uniti d'America) a 40 × ingrandimento dell'obiettivo. Le immagini digitali di sei diverse camere da ogni prova sono stati visualizzati e analizzati utilizzando gli strumenti di visualizzazione e analisi delle immagini di Aperio software Immagine Portata (Version 10.2.2.2352; Aperio Technologies Inc.). L'intero esperimento è stato ripetuto tre volte in modo indipendente, per un totale di 18 camere /gruppo per l'analisi. I risultati di output di analisi sono stati esportati in fogli Excel, concentrandosi principalmente sulla zona percentuale totale colorazione positiva, densità ottica media, e il punteggio istologico come parametri per l'analisi statistica e di confronto.
Alizarina rosso S colorazione
Allo stesso modo , le cellule sono state coltivate in piastre da 24 pozzetti e le cinque gruppi diversi stati stabiliti. Media sono stati sostituiti due volte alla settimana con i media regolari o osteogeniche preparati al momento. Il giorno 12, le cellule sono state colorate con 40 mM AR-S Alizarina Red (Sigma, UK), e sottoposti a valutazione spettrofotometrica secondo il protocollo di Gregory et al. [61] utilizzando un lettore per micropiastre (Gen5 ™, versione 1.10; BioTek Instruments Inc., USA) per misurare la densità ottica a 405 nm. Lo stesso protocollo è stato ripetuto tre volte in modo indipendente, dando nove letture diverse per ogni prova
L'analisi statistica dei dati
è stato analizzato utilizzando il software statistico SPSS. (Versione 16.0, SPSS, Stati Uniti d'America). Statistiche descrittive (media e deviazione standard) sono stati usati per descrivere le variabili di risultato quantitative. analisi della varianza ad una via (ANOVA) è stato utilizzato per confrontare i valori medi delle variabili di risultato attraverso le variabili categoriali (gruppi), seguito da un test post-hoc Tukey per confronti a coppie. I valori di P
& lt; 0,05 sono stati considerati per indicare la significatività statistica
Abbreviazioni
ALP:.
Fosfatasi alcalina
AR-S:
rosso alizarina S macchia
BRL:
Rosiglitazone
° C:
gradi Celsius o gradi centigradi
CD:
cluster di differenziazione
CFU-F:
formanti colonia unit-fibroblasti
DMEM:
aquile Dulbecco modificato medie (con alti livelli di glucosio, pyrovate sodio e L-glutammina)
DNA:
acido Deoxy-ribionucleic
DPSCs :
cellule staminali della polpa dentale
EMD:
derivati della matrice dello smalto
FACS:
cellule fluorescenza-attivato l'ordinamento (analisi di citometria di flusso)
FBS:
siero fetale bovino
FITC:
fluorescenza iso thioocyanide
Mg:
milligrammi
ml:
Milliliter
ml:
litri Micro
mRNA:
acido ribonucleico messaggero
MTA:
minerale triossido aggregato
< DFN> PBS:
fosfato tamponata salina
penna /Strept:
penicillina /streptomicina
PDGF:
piastrinica fattore di crescita derivato
mRNA:
acido ribonucleico
Dichiarazioni
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da grant No. 09-BIO740 -20 dal Piano nazionale per le Scienze e Technology Program, Regno dell'Arabia Saudita. Ringraziamo tutto il personale presso l'Unità di Stem Cell, Dipartimento di Anatomia, King Saud University, Riyadh per fornire loro supporto tecnico in questo studio.
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concorrenti. intereste Gli autori dichiarano di non avere interessi in gioco.
autori contributi
SA partecipato diversi aspetti degli studi di laboratorio, tra cui la caratterizzazione delle cellule, e l'applicazione materiale, oltre a preparare del progetto principale per questo articolo. NA aiutato nello sviluppo dell'idea principale di ricerca, preparato il disegno di base di studio, e fornito critica per la scrittura di tutta carta. Inoltre, ha organizzato per ottenere i materiali di prova dentali. AD ha fornito supporto tecnico generale soprattutto nella caratterizzazione delle cellule e l'analisi di differenziazione, oltre al suo ruolo a ottenere tutti i materiali di laboratorio di base. MN hanno aiutato in osteogenico cellulare e studi di differenziazione adipogenici, e supervisionato la stesura della parte tecnica dello studio (materiali e metodi). Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.
