cellule squamose orale
Abstract
sfondo
carcinoma a cellule squamose orale (OSCC) è associato ad un povero tasso di sopravvivenza a 5 anni. In generale, i pazienti con diagnosi di tumori di piccole dimensioni hanno una abbastanza buona prognosi, ma alcuni piccoli tumori hanno un comportamento aggressivo che porta a morte precoce. Non ci sono attualmente non biomarcatori prognostici affidabili per tumori del cavo orale. Così, per ottimizzare il trattamento per il singolo paziente, non vi è la necessità di biomarcatori in grado di predire il comportamento del tumore
. Metodo
Nel presente studio il potenziale valore prognostico di plectina è stata valutata da un microarray tissutale (TMA) immunoistochimica base analisi del tessuto tumorale primaria ottenuto da un nord norvegese coorte di 115 pazienti con diagnosi di OSCC. L'espressione di plectina è stato confrontato con le variabili clinico-patologiche e sopravvivenza a 5 anni.
Risultati
L'analisi statistica ha rivelato che bassa espressione di plectina nelle cellule tumorali previsto un esito favorevole per i pazienti con malattia non metastatico (p
= 0,008). Inoltre, l'espressione di plectina è stato trovato di correlare (p
= 0,01) con l'espressione di uPAR, che abbiamo già trovato per essere un potenziale marker prognostico per i tumori T1N0.
Conclusioni
nostri risultati indicano che bassa espressione di plectina prevede un esito favorevole per i pazienti con OSCC non metastatico e il livello di espressione di plectina può quindi essere utilizzato nella stratificazione trattamento per i pazienti con malattia in stadio precoce.
Sfondo
conti carcinoma a cellule squamose (SCC) più del 90% dei tumori maligni della testa e del collo regione [1, 2]. Testa e collo SCC (HNSCC) hanno un tasso di sopravvivenza a 5 anni di circa il 50%, [3, 4] e sono classificati come la principale causa di morte per cancro ottava in tutto il mondo [5].
Dell'OSCC comprende tumori situati nella telefonia mobile lingua, pavimento della bocca, mucosa buccale, bordo gengivale e il palato duro e morbido. La classificazione di sistema più utilizzato del dell'OSCC è il TNM-sistema da parte dell'Unione per il controllo internazionale Cancer [6]. Questo sistema è utilizzato per descrivere l'estensione anatomica della malattia al momento della diagnosi basata sulla dimensione del tumore primario e l'entità della crescita tumorale (T), regionale metastasi linfonodali (N) e metastasi a distanza (M), ed è la base per la fase di raggruppamento questi pazienti [7, 8]. Con la valutazione morfologica, i tumori sono classificati come pure, moderata e scarsamente differenziate [1]. Il TNM classificazione, e, in misura minore, il grado di differenziazione, sono spesso utilizzati come predittori per outcome. Tuttavia, OSCCs sono molecolarmente eterogenei e tumori con identica TNM-classificazione e grado di differenziazione possono differire in aggressività e risposta al trattamento [7, 9]. Questo comportamento imprevedibile pone la necessità di uno strumento diagnostico che può fornire informazioni prognostiche più affidabile.
Un modello di rischio basato su analisi istologica dei tumori è stato proposto [10-12]. Tuttavia, in un recente studio questo modello non ha predetto l'esito dei pazienti con SCC lingua [13]. Diversi rapporti precedenti hanno proposto diversi biomarcatori, come p53, EGFR, Ki67 e E-caderina come marcatori prognostici per OSCC, [14-16] anche se nessuno è stato implementato nella pratica clinica. Nel tentativo di trovare nuovi e migliori marcatori prognostici abbiamo in questo studio si è concentrato su plectina plectina è una grande proteina intracellulare del citoscheletro linker (& gt; 500-kDa) che è stato trovato per essere importante nella organizzazione della rete del citoscheletro. È espressa in pelle normale e nel rivestimento epiteliale della gastrointestinale tratto, cellule muscolari e le cellule endoteliali dei vasi, [17] e nel cancro derivante in esofago, stomaco, polmone, pancreas e la cavità orale [17, 18]. Plectina è localizzato sul lato interno della membrana plasmatica dove è associato con filamenti intermedi (IF), microtubuli e microfilamenti [19]. In emidesmosomi, plectina interagisce con la coda citoplasmatica della subunità delle integrine β4. Difetti nel gene plectina sono stati trovati nella grave, ereditaria, la pelle vesciche ereditaria malattia epidermolisi bollosa semplice, sottolineando l'importanza della proteina nelle cellule epiteliali normali [20]. Plectina influisce sulle proprietà meccaniche, nonché dinamiche del citoscheletro, e (almeno in cheratinociti) ha dimostrato plectina carenza di provocare tassi di migrazione aumento probabilmente attraverso l'attivazione del pathway Erk1 /2 [21]. In uno studio che ha valutato HNSCC, Katada et al. ha rilevato che il tasso di sopravvivenza dei pazienti con elevata espressione plectina nelle loro cellule tumorali era significativamente diminuito, e la frequenza delle recidive significativamente aumentata, rispetto ai pazienti con espressione plectina basso [22].
In un recente studio abbiamo dimostrato che l'urokinase recettore attivatore del plasminogeno (uPAR) e inibitore dell'attivatore del plasminogeno-1 (PAI-1) può essere marcatori prognostici in dell'OSCC fase iniziale [23]. uPAR è un costituente del sistema attivatore del plasminogeno (PA), ed entrambi plasminogeno urochinasi (uPA) e uPAR sono legati a una maggiore attività proteolitica e migrazione delle cellule tumorali. uPA converte plasminogeno in plasmina attiva serina proteasi, un ampio spettro di proteasi che possono degradare molti diversi tipi di proteine della matrice extracellulare, oltre ad attivare latente fattori di crescita e metalloproteasi di matrice [24, 25]. Legandosi di uPA a uPAR, le cellule tumorali possono dirigere l'attività proteolitica alla superficie delle cellule [26]. Come con plectina, l'aumentata espressione di uPAR è stato collegato alla transizione epitelio-mesenchimale fenomeno (EMT) [27-29].
In questo studio TMA-based, bassa espressione di plectina è risultato essere un marker per un prognosi favorevole in OSCC non metastatico. Plectina e uPAR hanno mostrato pattern di colorazione simili nei tumori e c'era una correlazione significativa tra plectina ed espressione uPAR.
Metodi
campioni
Questo era uno studio retrospettivo utilizzando fissati in formalina, inclusi in paraffina campioni tumorali provenienti da 115 pazienti con istologicamente verificato OSCC primaria nel periodo 1986-2002 raccolti dagli archivi del Dipartimento di Patologia clinica, Ospedale Universitario di Norvegia settentrionale. Per garantire una coorte omogeneo, sono stati esclusi i tumori con modelli di crescita verrucoso, nonché tumori da pazienti con cancro precedente, o precedente radioterapia alla testa e del collo. Tutti i pazienti presentati con malattia primaria situata nella cavità orale, tra cui lingua mobili, pavimento della bocca, mucosa buccale, gengiva e palato duro e morbido. dati clinici rilevanti e TNM classificazione sono stati recuperati da file dei pazienti, comprese le relazioni di patologia, Statistica di Norvegia e la causa della morte del Registro di sistema. I N e M stati sono stati determinati da un esame clinico e radiologico. Il tessuto normale lingua mucosa è stato ottenuto da tessuto adiacente al tessuto tumorale. Lo studio è stato approvato dai Comitati regionali per ricerca medica e sanitaria Etica, Norvegia settentrionale (n ° 22/2007). Le informazioni paziente è stata de-identificato prima dell'analisi. Il comitato etico ha ritenuto necessario ottenere il consenso scritto o orale dai pazienti partecipanti.
Tissue microarray (TMA)
Una regione morfologicamente rappresentante di ogni tumore è stato identificato su un ematossilina e eosina (HE) slitta -stained, e core per la TMA sono state raccolte dal blocco tissutale corrispondente utilizzando un tessuto Arrayer Beecher Instruments Micro. Otto core di 0,6 mm sono stati prelevati dalle regioni selezionate del blocco dei donatori di ciascun tumore e inserite in blocchi di microarray destinatario di paraffina. Quattro sezioni micron di spessore del, paraffina tessuto TMA fisso sono stati tagliati con un microtomo e poste su vetrini SuperFrost. HE-colorazione immunoistochimica e citocheratina-colorazione è stato eseguito per verificare la presenza di tessuto tumorale.
Abbiamo sperimentato una perdita del 16,5% dei nuclei durante la preparazione, e dei nuclei conservati, 8,4% conteneva troppo poche cellule tumorali da valutare . Questa perdita a causa di problemi tecnici è moderato rispetto ad altri rapporti [30, 31]. Da ogni paziente un numero medio di 3,82 nuclei macchiati e valutati per l'espressione plectina.
Valutato di ciascun paziente è stato 3,82.
Immunoistochimica (IHC)
Tutti i vetrini sono stati deparaffinised e reidratati. Il recupero dell'antigene plectina è stato migliorato facendo bollire in un sistema pressurizzato con 10 mM tampone citrato (pH 7,0). Inoltre, i vetrini sono stati incubati 30 minuti con 3% H
2O 2 per bloccare l'attività perossidasica endogena, e incubate un'ora con 10% siero di capra (Dako, Glostrup, Danimarca) in tampone fosfato isotonico (PBS) ( Dako, Glostrup, Danimarca) per ridurre la colorazione aspecifica. Coniglio primaria anticorpo monoclonale contro plectina (ab32528, Abcam, Cambridge, MA) è stato diluito 1: 200 in Dako diluente (S3022, Dako, Glostrup, Danimarca), e incubato overnight a 4 ° C. Successivamente, gli anticorpi legati sono state visualizzate utilizzando l'anti-coniglio Envision System Plus (K4011, Dako, Glostrup, Danimarca). I vetrini sono stati lavati in PBS w /0.1% Tween-20 con elevate concentrazioni di sale (0,4 M NaCl) e pH 6,0 (PBSTS6) dopo incubazione con anticorpi primari e secondari.
L'anticorpo anti-plectina (ab32528 ) è stato precedentemente descritto e validato come un buon marcatore per adenocarcinoma pancreatico [18]. Come controllo negativo, tessuto carcinoma pancreatico è stato trattato secondo lo stesso protocollo di colorazione, ma l'anticorpo primario è stato omesso. Nessuna colorazione è stato visto che indica che l'anticorpo secondario dava colorazione non specifica nel tessuto (dati non mostrati).
Colorazione di mucosa orale mostrava colorazione specifica e forte del tessuto muscolare nei vasi sanguigni, che serve come controllo positivo.
la colorazione uPAR è stata eseguita secondo precedente descrive i protocolli [23].
immunoistochimica punteggio
tutti i core sono stati esaminati da un esperto patologo (SES) e una testa e del collo chirurgo qualificato (OR), senza la conoscenza del risultato clinico. Il punteggio era semi-quantitativa, [32, 33] e l'indice di colorazione (SI) calcolato come prodotto di intensità di colorazione (none (0) debole (1), moderato (2) o forte (3)) e la proporzione di cellule tumorali positive (senza colorazione (0), e lt; 10% (1), 10-50% (2), 51-80% (3) o & gt; 80% (4)). Così, il SI per ogni core differiva da un valore minimo di zero ad un massimo di 12, e il punteggio finale del paziente era la media SI di tutti i core valutati. I tumori con punteggio al di sopra del valore mediano sono stati classificati come alti expressers ', mentre quelli con il punteggio di sotto del valore medio sono stati classificati come aventi una bassa espressione del biomarcatore
. Immunofluorescenza (IF)
Per Se l'analisi i vetrini sono stati pretrattati come descritto nel protocollo IHC per plectina. Un coniglio policlonale anticorpo anti-plectina (ab83497, Abcam, Cambridge, MA) consigliato per Se è stato utilizzato. L'anticorpo è stato diluito 1:10 in Dako Antibody Diluent (S3022, Dako, Glostrup, Danimarca) e incubato per 3 ore a temperatura ambiente. Dopo le diapositive erano stati lavati con PBSTS6, sono state incubate overnight a 4 ° C con il mouse anticorpo monoclonale uPAR anti-umano (# 3936, Sekisui Diagnostica, Stamford, CT, USA) in una diluizione 1:10 in un buffer di 10 siero% di capra (Dako Nord America, Carpintera, CA, USA) in PBS con BSA 1% e lo 0,3% di Tween-20, pH 6,0. Dopo incubazione i vetrini sono stati lavati con PBSTS6. Gli anticorpi secondari (Alexa Fluor 488, il coniglio di capra anti-, A11034 e Alexa Fluor 647, mouse di capra anti, A21236, Invitrogen, Carlsbad, CA) sono stati mescolati e diluiti 1: 200 in PBS. I vetrini sono stati montati e di contrasto con DAPI Antifade (DAPI in Fluorgard, 0,5 g /ml, Insitus, Albuquerque, NM) e sigillati con smalto. I vetrini sono stati osservati e fotografati con Leica TCS SP5 microscopio confocale laser con il software Leica Application Suite avanzata fluorescenza (Leica Microsystems AG, Wetzlar, Germania).
La specificità dell'anticorpo anti-plectina policlonale (ab83497) utilizzato nella colorazione immunofluorescenza è stato testato dalla colorazione adenocarcinoma pancreatico. Simile al anticorpo anti-plectina monoclonale, l'anticorpo anti-plectina policlonale specifico macchiati cellule tumorali pancreatiche. Inoltre, Western blotting dell'intero lisato cellule muscolari mostrato che l'anticorpo ha dato una banda di circa 500 kDa corrispondente alla dimensione di plectina (dati non mostrati).
Statistiche
Tutti i dati sono stati tabulati ed analizzati con il IMB SPSS Statistiche (Chicago, iL), versione 21. le associazioni tra diverse variabili categoriche sono state valutate con il test chi-quadrato Pearson`s. analisi univariata di influenza delle diverse variabili 'in tempo per la sopravvivenza specifica malattia sono state eseguite utilizzando il metodo di Kaplan-Meier, e significatività statistica tra le categorie è stato stimato il log-rank test. I valori statisticamente significativi da COX analisi univariata sono stati inseriti in una analisi multivariata utilizzando il graduale modello di regressione di Cox all'indietro. morte specifica malattia (DSD) è stata definita come pazienti che muoiono forma OSCC e non da condizioni non correlate. Questi dati sono stati ottenuti dal "Causa del Registro di morte in Norvegia. Correlazione tra bivariates è stato calcolato con rho di Spearman. Il cut-off per la bassa e alta espressione per ogni biomarcatore è stato fissato al valore mediano del punteggio finale del paziente, ed è stato 5,60 per plectina e 5,63 per uPAR. Tutti i risultati sono stati considerati significativi se p
& lt; 0,05, e segnalati secondo le linee guida osservazione di McShane et al. [34] Il punto di partenza è stato definito come il tempo della diagnosi, e l'ultimo giorno di follow-up è stato 1 gennaio st, 2012.
Risultati
Nel presente studio il valore prognostico di plectina in OSCC è stata valutata da una analisi immunoistochimica TMA-based del tessuto tumorale primario ottenuto da un North Norwegian coorte di 115 pazienti. La coorte era costituito da 64 uomini e 51 donne, con un'età media di 65,2 anni (uomini 64,4 /66,0 delle donne) al momento della diagnosi [23]. La maggior parte dei casi presentati con piccoli tumori (T1, 34% o T2, 37%), senza metastasi linfonodali (N0, 63%) e un tumore ben o moderatamente differenziato (90%). Come previsto, le dimensioni del tumore (T) e la presenza di metastasi linfonodali (N +) correlata significativamente con la morte malattia specifica (DSD), mentre il grado di differenziazione non ha
. Pattern di colorazione immunoistologiche
plectina scarsamente macchiata lingua normale mucosa che serviva come materiale di controllo, mentre i vasi sanguigni nello stroma sottostante visualizzati forte colorazione (Fig. 1a). In plectina-positive OSSC tumori colorazione era relativamente omogenea in tutto il tumore (Fig. 1b). Le cellule tumorali sono stati molto positivi, mentre la matrice extracellulare adiacente mostrato meno reattività. La colorazione delle cellule tumorali è stata limitata principalmente alla membrana plasmatica (Fig. 2), ma colorazione citoplasmatica è stata anche osservata in una percentuale relativamente alta delle anime. Figura. 1 colorazione immunoistochimica per plectina della mucosa della lingua (a) e carcinoma a cellule squamose orale (b). La mucosa normale ha mostrato solo debole colorazione mentre i vasi sanguigni nello stroma erano fortemente macchiati. La colorazione delle cellule tumorali positive plectina era forte, e lo stroma ha mostrato quasi nessun colorazione
Fig. 2 Immunhistochemical pattern di colorazione in TMA nuclei di carcinoma a cellule squamose orale. Plectina colorazione è principalmente a livello della membrana plasmatica, ma anche un po 'di colorazione citoplasmatica è stato visto
sopravvivenza
Per i pazienti senza metastasi linfonodali (N0), in qualsiasi T-fase, il rischio di morire di malattia entro 5 anni è stato significativamente diminuita nei pazienti con basse tumori plectina esprimendo rispetto a quelli con l'espressione plectina alta (p = 0,008
) (Tabella 1 e Figura 3). Inoltre, per i pazienti con tumori T1-, indipendenti di N-stato, le analisi statistiche hanno rivelato un rischio significativamente ridotto per DSD in coloro che avevano tumori con espressione plectina basso (p = 0,031
). Come previsto, visti i risultati precedenti, i pazienti con tumori T1N0 con l'espressione basso plectina ha avuto un ottimo risultato come tutti questi pazienti erano ancora vivi dopo 5 anni (p
& lt; 0,001). In un'analisi multivariata dei N0-casi compresi plectina e le dimensioni del tumore (T1 vs T2-4), unica espressione alta plectina è stato un significativo fattore predittivo indipendente di aumento della DSD (p = 0,014
, HR 3.674, IC 95% 1.305- 10,344) .table 1 Espressione del plectina in tutta la coorte, N0, T1 e pazienti T1N0 al momento della diagnosi. Il numero di pazienti con malattia 5 anni morte specifica (DSD) è data in numeri e anche come percentuale del totale in ciascun gruppo del totale in ciascun gruppo
plectina
bassa espressione
alta espressione
DSDP
Tutti pazientia
N (% del totale)
55
56
5 anni DSD
19 (35%)
25 (45%)
0,198
N0-casesb
N (% del totale)
36
32
5 anni DSD
5 (14%)
13 (41%)
0.008 *
T1 -casesc
N (% del totale)
23
16
5 anni DSD
2 (9%)
6 (38%)
0,031 *
T1N0-casesd
N (% del totale)
19
9
5 anni DSD
0
4 (44%)
& lt; 0,001 *
numero atotal di pazienti inclusi nell'analisi era 111
numero di btotal di pazienti inclusi nell'analisi è stata 68
numero di cTotal di pazienti inclusi nell'analisi è stata 39
numero di dtotal di pazienti inclusi nell'analisi era 28
* p
& lt; 0.05 è stato considerato come statisticamente significativo, e evidenziato in boldsface quando presente
Fig. 3 curva di Kaplan-Meier. La figura illustra la differenza nella sopravvivenza tra i pazienti con N0-alta e bassa espressione di plectina rispettivamente
Correlazione di plectina e di espressione uPAR
Abbiamo recentemente dimostrato che i pazienti con tumori T1N0 che esprimono bassi livelli di uPAR avere una significativa riduzione del DSD rispetto a quelli con una più alta espressione uPAR. Per studiare la distribuzione di espressione di uPAR e plectina nei tumori abbiamo fatto un test chi-quadrato, e abbiamo scoperto che un numero significativo di tumori che erano alte expressers di dell'uPAR anche erano alti expressers di plectina, e quelli con bassa espressione di uPAR erano generalmente bassi expressers di plectina. Questa correlazione è stata significativa, con un coefficiente di correlazione di 0,769 (p
= 0,01), come mostrato in un grafico a dispersione in Fig. 4. colorazione doppia immunofluorescenza è stata effettuata su alcuni tumori selezionati per indagare se plectina e uPAR sono stati co-situati all'interno delle stesse cellule, co-espressi dalle stesse cellule, o trova alle stesse regioni tumorali. L'immunofluorescenza ha mostrato che la plectina e uPAR colorazione è stato localizzato alle stesse aree del tumore (Fig. 5). Come previsto, la colorazione immunofluorescenza ha confermato che plectina è stato trovato principalmente a livello della membrana plasmatica, mentre uPAR è stata localizzata principalmente nel citoplasma. Figura. lotto 4 Scatter di uPAR e punteggio plectina per tutta la coorte. C'è stata una correlazione significativa (p
= 0,01) tra il plectina e il punteggio uPAR. Le linee grigio chiaro nella figura rappresentano l'intervallo di confidenza 95%
Fig. 5 immunofluorescenza colorazione dei tessuti squamose carcinoma orale. La maggior parte delle cellule sono stati positivi sia per plectina e uPAR. Plectina (verde) si trova principalmente a livello della membrana plasmatica e la periferia della cellula, mentre uPAR (rosso) è più evidente nella parte citoplasmatica delle cellule. Plectina è altamente espresso nella parete dei vasi sanguigni (asterisco
)
Discussione
La chirurgia è il trattamento primario per il cancro nella cavità orale, ed è spesso combinato con la radioterapia, mentre la chemioterapia è più spesso applicato come trattamento palliativo a fine fase del trattamento [35-37]. Gli effetti collaterali del trattamento per il cancro orale può essere devastante per la qualità di vita del paziente, [38], e quindi è importante evitare overtreatment dannose con la radioterapia dei pazienti con tumori di piccole dimensioni con prognosi favorevole. Le decisioni riguardanti l'estensione del trattamento di pazienti con i primi OSCC fase sono spesso difficili. Ancora, la scelta del trattamento si basa principalmente sulla TNM stadi che non discrimina tra tumori aggressivi e più indolenti. Diversi studi sui potenziali biomarcatori per la stratificazione di trattamento hanno mostrato risultati promettenti, ma finora nessuna di tali biomarcatori sono stati attuati nella pratica clinica. In questo studio abbiamo studiato il ruolo potenziale di plectina come biomarker prognostico. A nostra conoscenza, il valore prognostico della plectina in OSCCs in precedenza solo stato studiato da Katada et al. che ha studiato una coorte di 62 HNSCC, tra i quali 23 dalla cavità orale [22]. Anche se la coorte era piccolo ed eterogeneo, hanno scoperto che la sopravvivenza è stata significativamente ridotta quando le cellule tumorali esprimono alti livelli di plectina. La nostra coorte è più grande e composta solo da tumori della cavità orale e quindi più omogenea. In accordo con i risultati di Katada et al., Abbiamo scoperto che bassa espressione di plectina nelle cellule tumorali predice un esito favorevole, ma solo nei pazienti con malattia in stadio precoce.
Abbiamo già scoperto che una bassa espressione di uPAR correlata con ridotto DSD per i pazienti con tumori OSCC T1N0, e che uPAR quindi potrebbe essere un marcatore prognostico adatto per questo sottogruppo di pazienti [23]. Nel presente studio abbiamo trovato una correlazione altamente significativa tra l'espressione di plectina e uPAR. Tuttavia, a differenza di uPAR, elevata espressione di plectina correlata significativamente con DSD in tutti i pazienti con malattia non metastatica, e non solo il sottogruppo T1N0.
Maggior parte delle cellule tumorali che esprimono plectina espresso anche uPAR. E 'stato precedentemente suggerito che aumentata espressione di uPAR nelle cellule tumorali è associato EMT [27, 29, 39]. Poco si sa circa plectina e EMT, ma la formazione di podosomes plectina contenenti è stata proposta come un primo passo verso EMT in OSCC [40].
Conclusione
Il presente studio ha dimostrato che una bassa espressione di plectina prevedere un esito favorevole per i pazienti con malattia non metastatico. Inoltre, tutti i pazienti con malattia T1N0 e bassa espressione di plectina, sono sopravvissuti per più di 5 anni. Anche se i risultati devono essere convalidati nelle coorti più grandi, essi suggeriscono plectina come biomarker prognostico promettente, che può essere usato per guidare la stratificazione di trattamento per i pazienti con OSCC non metastatico
Abbreviazioni
DSD:.
morte specifica malattia di
EMT:.
transizione epitelio-mesenchimale
HNSCC:
Testa e collo carcinoma squamoso
dell'OSCC:
orale carcinoma a cellule squamose
TMA:
Tissue microarray
TNM:
sistema di classificazione per valutare l'estensione del tumore primitivo metastasi nei linfonodi regionali e metastasi a distanza
uPAR:
urochinasi recettore attivatore del plasminogeno
Dichiarazione
Ringraziamenti
ringraziamo Bente Mortensen, Eli Berg e Magnus Persson per un'eccellente assistenza tecnica, e Inger Sperstad per aiutare con la progettazione del database. Inoltre ringraziamo Bodil Fadnes per l'assistenza con immunofluorescenza e problemi tecnici. Questo lavoro è stato supportato The North norvegesi regionali autorità sanitarie e UIT L'Artic Università di Norvegia, entrambe le organizzazioni senza scopo di lucro che sono
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concorrenti. interessi
Gli autori dichiarano di non avere interessi in gioco.
contributi degli autori
OGR raccolto il materiale, effettuato immunoistochimica e immunofluorescenza, interpretati i dati, eseguite analisi statistiche, e redatto il manoscritto. SNM effettuata colorazione immunoistochimica, interpretato i dati e ha redatto il manoscritto. GS e EHO hanno partecipato al disegno dello studio, hanno contribuito alla interpretazione dei dati, e criticamente rivisti il manoscritto. LUH concepito il disegno dello studio, ha contribuito alla interpretazione dei dati, e criticamente revisionato il manoscritto. SES ha partecipato alla progettazione dello studio, ha contribuito alla interpretazione dei dati, effettuato analisi statistiche, e rivisto il manoscritto in modo critico. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.
