Abstract
sfondo
placca dentale formata sulla superficie dei denti è un ecosistema complesso composto da diversi batteri orali e componenti salivari. L'accumulo di placca dentale è un fattore di rischio per carie e malattie parodontali. L-arginina è stato segnalato per diminuire il rischio di carie dentale elevando pH della placca attraverso l'attività di arginina deiminasi in batteri orali. Qui abbiamo valutato il potenziale di L-arginina per rimuovere i biofilm orali stabiliti.
Metodi
biofilm si sono formati utilizzando saliva umana mescolato con brodo Brain Heart Infusion integrato con 1% di saccarosio in piastre multi-pozzetto o su dischi di plastica. Dopo aver lavato i biofilm con soluzione salina, citrato (10 mM, pH3.5), o L-arginina (0,5 M, pH3.5), i biofilm trattenuti sono stati analizzati mediante colorazione cristallo viola, microscopia elettronica a scansione, e Illumina a base di 16S rDNA sequenziamento.
Risultati
lavaggio con acido L-arginina biofilm orali staccate più efficiente di soluzione salina e ha ridotto significativamente la massa di biofilm conservati in piastre multi-pozzetto o su dischi di plastica. Analisi microbiota Illumina basata ha mostrato che citrato (pH3.5) preferenzialmente lavato fuori Streptococcus
da maturo biofilm orale, mentre acido L-arginina preparata con 10 mM tampone citrato (pH3.5) non specificamente rimosso componenti microbici del orale biofilm.
Conclusioni
acido L-arginina preparata con tampone citrato (pH3.5) in modo efficace destabilizzate e rimossi biofilm orali maturi. La soluzione L-arginina acida qui descritto potrebbe essere utilizzato come additivo che migliora l'efficacia di collutori utilizzato in igiene orale.
Chiave
L-arginina biofilm sciacquare la bocca Oral microbiome saliva elettronico materiale supplementare
La linea versione di questo articolo (doi:. 10 1186 /s12903-016-0194-z). contiene materiale supplementare, che è disponibile per gli utenti autorizzati
Sfondo
ci sono prove accumulando che il deterioramento di igiene orale è associato con malattia parodontale [1], nonché un aumento del rischio di malattie cardiovascolari [2, 3], sindrome metabolica [4, 5], e la nascita pre-termine [6]. Orale cura l'igiene è anche riconosciuto come una misura fondamentale che riduce i rischi per la polmonite associati all'assistenza sanitaria (HCAP). biofilm orali possono fungere da serbatoi per polmonite batterica legate, come suggerito dalla somiglianza tra il microbiota orale e campioni HCAP clinici [7-9]. Molti studi clinici che hanno indagato l'efficacia della cura dell'igiene orale sulla profilassi per HCAP, tra cui la polmonite derivanti dalla ventilazione meccanica, sono stati segnalati. Questi studi hanno trovato: (i) le misure meccaniche e chimiche di igiene orale ha ridotto il tasso di respirazione di colonizzazione patogeno in microbiota orale [10, 11]; (Ii) cura l'igiene orale sia con clorexidina collutorio o gel è stato associato ad una riduzione del 40% in polmonite associata a ventilazione negli adulti in condizioni critiche [12]; e (iii) la pulizia meccanica orale ha ridotto in modo significativo il rischio di polmonite fatale [13].
cavità orale contengono diverse microbiota che i numeri quasi 700 specie [14]. Questo ecosistema comprende batteri biofilm che formano quali Streptococcus mutans
, Fusobacterium nucleatum
, Porphyromonas gingivalis
, e Aggregatibacter actinomycetemcomitans
. Anche se il microbiota varia tra gli individui, all'interno di un dato individuo microbioma orale è relativamente stabile [15]. Tuttavia, la composizione microbica orale può cambiare rapidamente in condizioni compromessi che possono verificarsi durante ricoveri [16]. Pertanto, la cura dell'igiene orale per i pazienti critici è particolarmente importante per prevenire la colonizzazione di batteri resistenti a più farmaci o crescita eccessiva di patogeni respiratori. Inadeguata igiene orale può causare la formazione della placca dentale matura sulla superficie dei denti o cellule epiteliali orali, e questa placca può essere resistenti alla pulizia risciacquando con acqua o anche con spazzolatura dei denti manuale, che evidenzia la necessità di strategie efficaci che sopprimono biofilm orale formazione. Vari studi clinici per testare la capacità di estratti di erbe [17], disinfettanti [18, 19], inibitori della produzione di polisaccaridi [20, 21], e gli zuccheri rari [22] per ridurre la formazione di biofilm orali sono stati condotti.
Recentemente , agenti alcalini generatrici quali L-arginina e urea sono stati previsti per inibire la crescita di batteri acidogeni o aciduric innalzando il pH dell'ambiente orale [23]. Il metabolismo di L-arginina e urea arginina deiminasi e ureasi rispettivamente, produce ammoniaca. Molti batteri orali possiedono un sistema arginina deiminasi, che metabolizza L-arginina a produrre ornitina e ammoniaca che aumenta il pH del biofilm orali. Studi clinici indagando L-arginina contenenti dentifrici o collutori hanno mostrato un effetto protettivo contro lo sviluppo della carie dentale nei soggetti giovani [24, 25]. Inoltre, L-arginina e fluoro sinergicamente soppressi S. mutans
crescita e biofilm formazione [26].
L-arginina è un amminoacido basico contenente un gruppo guanidina. Come guanidina cloridrato, L-arginina può aumentare la solubilità delle proteine e sopprimere l'aggregazione di proteine [27]. Anche se il meccanismo preciso per l'inibizione L-arginina-mediata di interazioni proteina-proteina rimane poco chiaro, L-arginina può cambiare le tensioni superficiali delle proteine interagendo con proteine o l'acqua che li circonda senza l'allegato stretto visto con altri agenti come guanidina cloridrato [28]. Poiché questa interazione lieve conserva proteina funzioni, L-arginina è stata utilizzata per la solubilizzazione delle proteine espresse exogenously o anticorpi per uso farmaceutico. Inoltre, L-arginina è stato recentemente riportato a diminuire l'infettività del virus rivestiti come herpes simplex virus e virus dell'influenza, probabilmente a causa della funzione compromessa delle proteine nella busta [29].
Biofilm orale è un ecosistema complesso che è composto da batteri diversi, glucano insolubile, e glicoproteine salivari. La rimozione di questo solido placca biologica dalle superfici dei denti con un semplice risciacquo con acqua o anche con spazzolatura meccanica può essere difficile. placca residua serve anche come base per l'ulteriore formazione di biofilm. Poiché L-arginina è previsto per inibire la formazione di biofilm orale e destabilizzare aggregati complessi nella placca dentale, inclusione di questo aminoacido in un collutorio potrebbe facilitare la rimozione biofilm orale. In questo studio abbiamo valutato il potenziale di L-arginina come un detergente per rimuovere i biofilm orali già stabiliti.
Metodi
Uccidere saggio per Streptococcus mutans
glicerolo scorte di S. mutans
GS5 erano striati su Brain Heart Infusion (BHI) piastre di agar che sono state poi incubate anaerobicamente a 37 ° C per 48 h. coltura anaerobica è stata eseguita utilizzando un sistema AnaeroPack (Mitsubishi Gas Co., Ltd.). Diversi S. mutans
colonie GS5 sono stati inoculati in BHI brodo e coltivate a 37 ° C per 48 ore. Le colture sono state centrifugate a 15000 rpm per 5 minuti e risospese in soluzione salina. sospensioni batteriche (0,1 ml) sono stati aggiunti 0,9 ml di soluzione fisiologica, 10 mM citrato (pH3.5), o 0,5 M L-arginina in 10 mM citrato (pH3.5). Dopo incubazione per 5 min a 37 ° C, sono state preparate diluizioni seriali di 10 volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, pH7.4), e 0,1 ml della diluizione appropriata è stato diffuso su piastre di agar BHI. Dopo 72 h di incubazione anaerobica a 37 ° C, il numero delle colonie è stato conteggiato e confrontato con il numero nel trattamento salina.
Biofilm saggio di inibizione
Per valutare l'effetto inibitorio sulla S. mutans
GS5 biofilm formazione, 0,1 ml di soluzione salina, 10 mM citrato (pH3.5), o 0,5 M L-arginina pH3.5-7.0 (rettificato 10 mM tampone citrato) sono stati mescolati con un volume uguale di sospensione batterica (1% v /v di 48 ore la cultura) in 2 x BHI contenente il 2% di saccarosio. Le miscele sono state aggiunte alle piastre a 96 pozzetti e incubate anaerobicamente a 37 ° C. Dopo una coltura 24 h, i biofilm formatisi sul fondo e sono stati quantificati dalla colorazione cristallo viola come descritto di seguito.
La raccolta dei campioni salivari umane
Dopo consenso informato scritto è stato ottenuto da nove volontari sani (21-27 anni , di sesso maschile), che sono stati invitati a raccogliere la saliva escreta durante la masticazione cera da masticare per 5 min. I criteri di esclusione erano più giovani di 20 anni o che hanno ricevuto un trattamento antibiotico nei precedenti 4 settimane.
effetto di pulizia di L-arginina sui biofilm orale formata su dischi di plastica
biofilm orali umani sono stati formati su dischi di plastica sterile 13.5 mm (Sensi-Disc, Sumitomo Bakelite, Co., Ltd., Tokyo), ambientato in piatti della cultura 24 pozzetti. I dischi sono stati incubati in 0,5 ml BHI contenente 1% di saccarosio e 20% saliva umana raccolti da tre volontari sani (# 1- # 3). Dopo una coltura anaerobica 72 h, i dischi sono stati rimossi e lavati una volta con soluzione salina. I biofilm sui dischi sono stati ulteriormente lavate con 0,5 ml di 10 mM citrato (pH3.5), 0,5 M ciascuno di L-arginina, L-alanina, L-glicina o L-lisina (tutto regolato il pH a 3,5 per 10 mM citrato) agitando per 30 minuti a 37 ° C. I dischi sono stati poi nuovamente lavati con 0,5 ml di PBS (pH7.4), colorate con cristalvioletto 0,5 ml 0,01% per 20 minuti a temperatura ambiente. I dischi sono stati quindi lavati quattro volte con 1,0 ml di soluzione salina ed essiccato all'aria. Dopo aver preso fotografici, il colorante residuo è stato eluito con acido acetico 0,5 ml 33% in agitazione per 30 min a temperatura ambiente. L'assorbanza dei eluenti a 550 nm è stato poi misurato.
Saggio pulizia su salivare umana biofilm utilizzando i pozzetti
saliva umana raccolti da quattro volontari sani (# 4- # 7) sono stati aggiunti al BHI contenente 1% di saccarosio a 20 % (v /v). biofilm orale umano modificati sono stati preparati anche con l'aggiunta di 48 h S. mutans
GS5 culture (1% volume finale) per simulare biofilm cariogeni. Ogni miscela (0,1 ml) è stata quindi aggiunta alle piastre a 96 pozzetti e incubato anaerobicamente a 37 ° C. Dopo 72 h, le colture sono state rimosse, e il biofilm formata sul fondo delle piastre è stata lavata una volta con 0,2 ml di soluzione fisiologica. Ogni pozzetto è stato quindi lavato con 0,1 ml di soluzione salina (controllo), 10 mM citrato (pH3.5, solvente per L-arginina in questo studio), o 0,5 M L-arginina (pH3.5) agitando per 30 minuti a 37 ° C. I reagenti sono stati decantati e ciascun pozzetto è stato lavato tre volte con 0,2 ml di soluzione fisiologica. Il biofilm restante è stata trattata con cristal violetto 0,1 ml 0,01% per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo la colorazione, i pozzetti sono stati lavati quattro volte con 0,2 ml di soluzione salina, e il colorante residuo viene eluito con acido acetico 0,2 ml 33% in agitazione per 30 min a temperatura ambiente. L'assorbanza dei eluenti a 550 nm è stato quindi misurato. Sei pozzetti sono stati usati per ciascun campione in un singolo test. I dosaggi sono stati ripetuti tre volte in modo indipendente. Microscopio elettronico a scansione
biofilm orali umani sono stati formati su dischi di plastica sterile 13,5 mm utilizzando i campioni da 4 # per 7 #. I dischi sono stati incubati in 0,5 ml BHI contenente 1% di saccarosio e 20% saliva umana. Dopo una coltura anaerobica 72 h, i dischi sono stati rimossi e lavati una volta con soluzione salina. I biofilm sui dischi sono stati ulteriormente lavate con 0,5 ml di soluzione fisiologica, 10 mM citrato (pH3.5), o 0,5 M L-arginina (pH3.5) agitando per 30 minuti a 37 ° C. I dischi sono stati poi nuovamente lavati con 0,5 ml di PBS (pH7.4), e biofilm sui dischi sono state fissate con 2% glutaraldeide in 0,1 M tampone cacodilato (pH7.2). Dopo la fissazione, i biofilm sono stati disidratati in una serie graduata di etanolo ed essiccato in un PCP-2 dispositivo di asciugatura punto critico Hitachi. I dischi sono stati rivestiti con platino /palladio in un Hitachi E-102 sputter coater ed esaminati con un microscopio elettronico a scansione JEOL JCM-6000. L'area biofilm mantenuto dopo il lavaggio con ogni reagente è stata misurata utilizzando lo strumento di auto-selezione del colore in Photoshop CS6. I rapporti di valore di pixel della zona biofilm per un'area totale di osservazione sono stati calcolati da cinque campi selezionati in modo casuale a ingrandimento 100X.
Analisi della composizione microbica dal sequenziamento del 16S rDNA
Il salivare microbioma dei sei volontari sani (# 4- # 9 ) è stato caratterizzato da Illumina Miseq 16S rDNA analisi di sequenziamento del DNA estratto da 3 ml di saliva. Per identificare i gruppi microbici che erano sensibili a citrato o L-arginina risciacquo, umani biofilm saliva derivato formati su dischi di plastica 13.5 mm, sono state lavate con i reagenti sopra descritti. I reagenti sono stati poi recuperati e batteri dai lavaggi sono stati raccolti mediante centrifugazione (frazione lavato-out). I dischi sono stati lavati tre volte con 0,5 ml di soluzione salina, in pezzi con le forbici sterili, e quindi trasferiti al 0,5 ml di soluzione salina per sonicazione con un Bioruptor (Cosmobio, 3 x 1 min con intervallo di 1 minuto, impostare l'uscita H). I biofilm staccate sono state raccolte mediante centrifugazione (frazione sostenuto). DNA da due frazioni è stato anche purificato e la composizione microbica determinata 16S rDNA analisi di sequenziamento. Estrazione
DNA è stata eseguita secondo il metodo riportato da Morita et al. [30]. biblioteche sequenziamento sono stati preparati amplificando la regione V3-V4 del 16S rDNA utilizzando i primers descritti da Klindworth et al. [31]. Dopo l'amplificazione iniziale, una seconda PCR è stata effettuata per collegare gli adattatori Illumina così come i codici a barre che ha permesso per il multiplexing. Le amplificazioni sono state eseguite in 25 microlitri reazioni contenente 2,5 ml modello diluito, 12,5 ml 2x KAPA HiFi HotStart Ready Mix e 2,5 ml di ciascun primer. ciclismo termica consisteva in una fase iniziale di denaturazione (3 min a 95 ° C), seguito da 25 cicli di denaturazione (30 s a 95 ° C), ricottura (30 s a 55 ° C) e 30 s estensione a 72 ° C. Il passo estensione finale consisteva di 5 min a 72 ° C. Amplificati sono stati purificati utilizzando perline AMPure XP (Beckman Coulter). Il sequenziamento è stato eseguito sulla piattaforma Illumina MiSeq (MiSeq reagente Kit ver. 3, 600 cicli) in base alle specifiche del costruttore per generare abbinato-end legge di 300 basi in ogni direzione. Un totale di 10.381.210 2 x 300 coppie di basi legge con una media di 432.550 letture per campione è stato ottenuto. sequenze primer sono stati tagliati, e la fine accoppiato letture di fuse con FASTQ-join [32] con parametri di default ed elaborati con il QIIME 1.8.0 gasdotto [33]. Dopo un controllo chimera da Usearch, 20.000 Illumina legge per campione (punteggio medio di qualità superiore a 20) sono stati selezionati in modo casuale per ulteriori analisi. Utilizzando il UCLUST [34] algoritmo integrato nella pipeline QIIME, sequenze sono state raggruppate a & gt; 97% di identità con il database di riferimento Greengenes, producendo 635 unità tassonomiche operative (Otus). Utilizzando la pipeline QIIME, distanze UniFrac non ponderate sono state prodotte e utilizzate per studiare la diversità beta tracciando PCA coordinate
Nucleotide seqeunce
dati di sequenza sono stati depositati nella banca dati DDBJ (numero di accesso: DRA004109, PRJDB4298, SAMD00042426-SAMD00042441)..
Statistiche
l'analisi statistica dei dati è stata effettuata con StatFlex ver. 6.0 (Artech Co., Ltd., Tokyo) mediante analisi della varianza (ANOVA) per confrontare i mezzi di tutti i gruppi e seguita dal test di Tukey di confrontare i mezzi di ciascuno dei due gruppi. I dati sono stati considerati come significativamente differente se il valore p
2 coda è stata inferiore a 0,05
. Consenso etico e le autorizzazioni
saliva umana sono stati raccolti da nove volontari sani, dopo consenso informato scritto è stato ottenuto. l'approvazione etica è stata ottenuta dal Comitato Etico di Ricerca della Facoltà di Medicina, Università di Kagawa (numero di riferimento, 27-074).
consenso a pubblicare
Gli autori hanno ottenuto il consenso da parte di tutti i partecipanti di pubblicare i dati di analisi sotto con anonimato collegabile.
Risultati
effetto inibitorio di L-arginina in S. mutans
formazione di biofilm GS5
saggi biofilm sono state eseguite per determinare l'effetto di L-arginina in S. mutans
GS5 biofilm formazione in condizioni di pH che vanno da acido a neutro (pH3.5-7.0). In primo luogo, S. mutans
cultura GS5 inserito 2 x BHI contenente 2% di saccarosio al 2% (v /v). La sospensione batterica (0,1 ml) è stato poi mescolato con soluzione salina, 10 mM citrato (pH3.5) o 0,5 M ciascuno di soluzione L-arginina regolato il pH (3,5-7,0) e applicate ai pozzetti. Dopo 24 ore di coltivazione anaerobica, S. mutans
biofilm è stata quantificata mediante colorazione cristallo violetto. Come mostrato in Fig. 1, le soluzioni L-arginina (concentrazione finale, 0,25 m) che sono stati adeguati a pH3.5 significativamente inibite S. mutans
biofilm dopo 24 ore di coltura se confrontato con soluzione fisiologica o buffer di controllo (5 mm citrato, pH3.5) . L'effetto di L-arginina è pH-dipendente, in cui solo soluzioni L-arginina regolate pH3.5 formazione di biofilm significativamente inibito. Inoltre, questa inibizione è improbabile che sia dovuto ad un effetto battericida, perché 10 mM tampone citrato (pH3.5) e L-arginina regolato per pH3.5 ridotti S. mutans
numero di GS5 da solo 0,61 ± 0,30 e 0,49 ± 0.22 log
10 CFU /ml durante un contatto di 5 min, rispettivamente, e la densità ottica dei S. mutans
coltura dopo 24 h di incubazione non era diversa tra i campioni con e senza 0,25 M soluzione L-arginina (pH3.5). Questi risultati suggeriscono che acido L-arginina destabilizzato la struttura del biofilm e /o ridotta produzione glucano insolubile di S. mutans
. Sulla base di questi risultati, acidi soluzioni L-arginina rettificato per pH3.5 sono stati utilizzati per le successive analisi. Figura. 1 inibizione pH-dipendente di S. mutans
GS5 formazione di biofilm da L-arginina. Diluito S. mutans
culture GS5 e reagenti sono stati mescolati a 1: 1. Dopo le miscele sono state coltivate in condizioni anaerobiche a 37 ° C per 24 h, S. mutans
biofilm che si erano formate sul fondo dei pozzetti sono stati quantificati mediante colorazione cristal violetto. Saline (S), 10 mM pH3.5 citrato (CA3.5) o 0,5 M soluzione L-arginina regolato con 10 mM tampone citrato a pH compreso tra 3,5 e 7,0 (indicato come LA3.5-LA7.0) sono state usate come reagenti. I dati sono espressi come media ± deviazione standard. * Significativamente diverso da Saline (p
& lt; 0,05), ** significativamente diverso da 10 mm citrato (pH3.5) (p
& lt; 0,05)
effetto detergente della soluzione di acido L-amino su orale biofilm
biofilm saliva-derivato è stato preparato su dischi di plastica con i campioni di saliva da adulti sani (# 1, # 2 e # 3). Dopo il biofilm è stata lavata con 10 mM citrato (pH3.5), 0,5 M ciascuno di L-arginina, L-glicina, L-lisina o soluzioni L-alanina, che sono stati regolato il pH a 3,5. Come mostrato in Fig. 2a, le macchie cristallo viola su dischi lavati con L-arginina sono stati inferiori a quelli lavati con tampone citrato o gli altri tre L-amminoacidi testati. I coloranti viola di cristallo sono stati eluiti con acido acetico e l'assorbanza a 550 nm del eluizione è stata misurata quantificare i biofilm di fissaggio sui dischi. Come mostrato in Fig. 2b, L-arginina ridotto biopellicola salivare umana più efficace rispetto ad altri L-amminoacidi sebbene differenza significativa non è stata osservata. Figura. 2 effetto Purificazione di L-arginina sulla biopellicola salivare formata su dischi di plastica. una colorazione viola di cristallo del biofilm trattenere sui dischi dopo il lavaggio. Il biofilm formato sul disco di plastica è stato lavato per 30 minuti con 10 mM tampone citrato (pH3.5, Cit), 0,5 M ciascuno di L-arginina (Arg), L-glicina (Gly), L-lisina (Lys) o L-alanina (Ala), che sono stati adeguati il pH a 3,5 con 10 mM tampone citrato. b Quantificazione del ritegno salivare biofilm sui dischi. La viola cristallo è stato eluito dai dischi come da tabella A con acido acetico e loro assorbanza a 550 nm è stata misurata. I valori relativi a campione citrato sono mostrati
effetto destabilizzante di acido L-arginina sui biofilm orali
Per valutare ulteriormente l'effetto di destabilizzazione di acido L-arginina (pH3.5) su biofilm orale umana, i campioni di saliva sono stati raccolti da quattro volontari sani (# 4, # 5, # 6, e 7 °). Illumina a base di analisi di sequenziamento del 16S rDNA ha mostrato che questi campioni contenevano microbioma coerente con diversi precedenti relazioni sulla saliva umana [35, 36]: Streptococcus
(più predominante, 23,2-44,5% tasso di abbondanza in questo studio), Prevotella
, Neisseria
, Veillonella
, Rothia
, Fusobacterium
, Gemella
, Porphyromonas
, Haemophilus
, Granulicatella,
e Actinomyces
erano comunemente rilevato come abbondante generi (vedi file aggiuntivi 1, 2 e 3 per un riepilogo dettagliato dei tassi di abbondanza).
I campioni di saliva sono stati aggiunti a pozzetti contenenti BHI e l'1% di saccarosio (20% v /v), e biofilm si sono formate in seguito incubazione anaerobica per 72 h. È interessante notare che le caratteristiche biofilm differivano tra campioni, in cui i biofilm salivari da due individui (# 5 e 6 #) saldamente fissati ai pozzetti (definiti come biofilm solidi), mentre gli altri due (# 4 e # 7) sono stati facilmente staccato dalla lavaggio con soluzione salina (definito come biofilm fragili) (Fig. 3a). Il lavaggio dei pozzetti con acido L-arginina staccati più biofilm da 5 # e # 6 di fatto salina (p
& lt; 0,05), mentre 10 mM citrato (pH3.5) da solo era simile a quella di soluzione salina. Figura. 3 destabilizzazione dei biofilm orale di acido L-arginina. Pulizia effetto di soluzione salina, 10 mM citrato (pH3.5) o L-arginina in 10 mM citrato (pH3.5) sul biofilm fissati utilizzando saliva umana solo (a) o saliva umana mescolato con S. mutans
GS5 (1 % v /v) (b) è stato esaminato. I biofilm saliva di derivazione umana sono stati preparati in micropozzetto. Dopo aver lavato con i reagenti, i biofilm subite sono state colorate con cristal violetto. I numeri indicano gli ID di volontari. Saline, 10 mM citrato (pH3.5) e acido L-arginina (pH3.5) sono indicati da colonne blu, rosso e verde, rispettivamente. I dati sono espressi come media ± deviazione standard, e l'analisi statistica è stata effettuata mediante ANOVA seguito dal test di Tukey. Il p
-Valori meno di 0,05 sono stati considerati significativi
Per simulare il biofilm cariogeni, S. mutans
GS5 è stato aggiunto al 1% del volume bene finale. L'aggiunta di S. mutans
GS5 modificato la struttura del biofilm e aumentato l'attaccamento ai pozzetti, in particolare in campioni di saliva che formano biofilm fragili (Fig. 3 e aggiuntive di file 4). Simile al test pulizia biofilm senza S. mutans
GS5, acido L-arginina significativamente indipendente più biofilm derivato dalla saliva di 5 # e # 6 (Fig. 3a). Al contrario, biofilm contenente ceppo GS5 diventato sensibile a lavaggio con 10 mM citrato (pH3.5) (Fig. 3b). Nel frattempo, acido L-arginina (pH3.5) e 10 mm citrato (pH3.5) anche la tendenza a ridurre i biofilm formati da campioni di saliva biofilm di formazione fragili (# 4 e # 6) e S. mutans
GS5, ma nessuna differenza significativa è stata osservata
. biofilm struttura dopo il lavaggio con acido L-arginina
per confrontare ulteriormente la saliva umana (# 4 a # 7) biofilm -derived dopo il lavaggio con soluzione fisiologica, citrato (pH3.5), o acido L-arginina (pH3.5), microscopia elettronica a scansione (SEM) è stata eseguita. Biofilm stato preparato su un disco di plastica utilizzando ciascuno dei campioni di saliva e lavato con tre soluzioni (saline, 10 mM pH3.5 citrato, o 0,5 M L-arginina pH3.5). L'area di biofilm di sostegno dopo il lavaggio è stato quantificato in cinque campi SEM scelti a caso da un software Photoshop CS6. Come mostrato in Fig. 4, la massa biofilm è stato ridotto al massimo grado da acido L-arginina (pH3.5). Per i campioni lavati con soluzione salina e 10 mM citrato (pH3.5), di spessore, oggetti MAT-simile sono stati mantenuti dopo il lavaggio, mentre acido L-arginina rimossa la maggior parte di queste strutture (file supplementare 5). Figura. 4 Quantificazione dei sostenuta biofilm orale dopo la pulizia. biofilm orali sono state formate su dischi di plastica di coltivazione anaerobica in BHI brodo contenente saccarosio (1%) e saliva umana (10%). Dopo una coltura 72 ore a 37 ° C, i dischi sono stati lavati con 1 ml di PBS (pH7.4). I dischi sono stati ulteriormente lavate con 1 ml di soluzione fisiologica, 10 mM citrato (pH3.5) o 0,5 M L-arginina (pH3.5) per 30 minuti prima di fissare con 2% glutaraldeide in 0,2 M tampone cacodilato per microscopia elettronica a scansione. aree biofilm sono stati misurati utilizzando uno strumento di auto-selezione basata sul colore in Photoshop CS6, ed i rapporti relativi al campo di osservazione totale sono stati calcolati. Almeno cinque campi scelti a caso sono stati esaminati. I dati sono espressi come media ± deviazione standard, e l'analisi statistica è stata effettuata mediante ANOVA seguito dal test di Tukey. Il p
-Valori meno di 0,05 sono stati considerati significativi
Oral gruppi di batteri sensibili a risciacquo con acido L-arginina
Illumina a base di analisi di sequenziamento del 16S rDNA è stato eseguito per identificare i gruppi di batteri che sono stati sensibili alle risciacquo con acido L-arginina. Abbiamo testato biofilm salivare da campioni # 4 e # 5 per rappresentare biofilm solidi e fragili, rispettivamente. biofilm salivari sono stati preparati su disco di plastica e lavate con soluzione salina, 10 mM citrato (pH3.5) o 0,5 M L-arginina (pH3.5) per 30 minuti. I biofilm staccati nelle soluzioni di prova sono state raccolte mediante centrifugazione (frazione slavato). I biofilm di fissaggio sui dischi sono stati staccati per sonicazione e raccolte mediante centrifugazione (mantenendo frazione). I DNA sono stati purificati da entrambe le fazioni. Come mostrato in Fig. 5, Streptococcus
e Lactobacillus
condiviso 86,8-98,3% delle popolazioni biofilm sia mantenuto e frazioni slavati. biofilm solido (# 5) conteneva più Lactobacillus
di biofilm fragile (# 4). È interessante notare che il Streptococcus
proporzione nella frazione slavato con tampone citrato (10 mM, pH3.5) era più alto rispetto a quelli con soluzione salina o 0,5 M L-arginina (pH3.5). D'altra parte, Lactobacillus
tendeva a trattenere sui dischi dopo lavaggio con citrato (pH3.5). Questi risultati hanno indicato che il citrato (pH3.5) preferenzialmente lavato fuori Streptococcus
da entrambi i tipi biofilm. D'altra parte, il profilo microbica delle frazioni di lavaggio trattati con acido L-arginina è stata simile a quella osservata per salina, indicando che acido L-arginina (pH3.5) non specificamente batteri staccato dal biofilm formati su dischi di plastica. Figura. 5 Analisi microbiota comparativa delle frazioni sostenuta e slavati con acido L-arginina. Fragile (da 4 #) e biofilm solidi (# 5) sono formati su dischi di plastica, che sono stati poi lavati con soluzione salina (S), 10 mM tampone citrato pH3.5 (CA), o acido L-arginina (LA). La composizione microbica della frazione rimanente sui dischi e la frazione slavato stati confrontati dal Illumina analisi basata sul sequenziamento del 16S rDNA
Discussione
arginina deiminasi in batteri orali metabolizza L-arginina che a sua volta aumenta il pH del ambiente orale, che può sopprimere la formazione della carie dentale. Così, L-arginina è stata esplorata come un potenziale supplemento alla cura dell'igiene orale [37]. Inoltre, sono stati riportati elevate concentrazioni di L-arginina (5,0-10,0%) per inibire la formazione di biofilm di S. mutans cariogeni
[26]. In questo studio, abbiamo esplorato l'effetto di pulizia di L-arginina sui biofilm orali per dimostrare i benefici di questo aminoacido essenziale per la cura dell'igiene orale. inibizione L-arginina di S. mutans
formazione di biofilm era infatti dipendente dal pH (Fig. 1), perché tra la gamma di valori di pH testati (3,5-7,0), riduzioni significative nella formazione di biofilm sono stati osservati solo a pH3.5 . Pertanto, abbiamo testato concentrazioni relativamente elevate (0,5 M) di acido L-arginina (pH3.5) in questo studio, e ha mostrato l'efficacia di questa soluzione nel rimuovere biofilm orali già stabilite. Poiché L-arginina aumenta la solubilità delle proteine che interessano le interazioni proteina-proteina e questo effetto è evidente a condizioni acide [38, 39], l'effetto di pulizia sul biofilm orale di acido L-arginina che è stato osservato qui è probabilmente derivato da una destabilizzazione del batterica aggregazione.
Nel corso di questo studio, Kolderman et al. riferito l'effetto destabilizzante di L-arginina sui biofilm formati da saliva in pool da sei volontari sani [40]. Questo studio ha riportato che pH neutro L-arginina (0,1-0,5 M) in modo efficace destabilizzato biofilm orale. Qui, abbiamo dimostrato che il pH acido L-arginina non solo destabilizzato biofilm orale umana, ma anche la formazione di biofilm inibita da S. mutans
, anche se è difficile confrontare i risultati di entrambi gli studi a causa delle differenze nel sistema di analisi biofilm utilizzato: la Kolderman et al. studiare filtrato, saliva acellulare utilizzato come nutriente, mentre qui abbiamo usato BHI contenente 1% di saccarosio come mezzo di supporto per la formazione di biofilm. Il saccarosio è uno zucchero cariogena che aumenta il volume e la solidità del biofilm orale. L'effetto di saccarosio stradale di vitro formazione di biofilm orale è stata chiaramente osservata in questo studio, in cui saccarosio aggiunto apparentemente alterato la massa biofilm e la sua composizione con un marcato aumento del numero di batteri astiformi (file complementare 4). Considerando che Streptococcus
e Lactobacillus
erano i componenti principali dei biofilm orali testati in questo studio (Fig. 5), questi batteri a forma di bastoncello erano probabili lactobaclli. Tali solidi-biofilm formati in rich media possono essere difficili da rimuovere con neutro L-arginina, e condizioni acide possono facilitare la destabilizzazione degli aggregati da L-arginina. Infatti, Ikeda et al. rivelato che l'effetto antivirale di 0,7 M L-arginina al tipo di virus dell'influenza A è più evidente quando il pH era inferiore pH5.0 [41].
Abbiamo scelto tampone citrato per regolare il pH della soluzione di L-arginina perché questo L'acido ha attività chelante. L'effetto inibitorio di agenti chelanti in biofilm microbico è ben noto, come dimostra l'uso frequente di EDTA o citrato in soluzioni di blocco del catetere.
