Abstract
sfondo
cellule epiteliali gengivali sono la principale popolazione del tessuto gengivale, che agisce come la difesa di prima linea contro le intrusioni microbica e regolando l'omeostasi del tessuto parodontale nella salute e nella malattia attraverso NLR famiglia pirina dominio contenenti-3 (NLRP3) inflammasome, che riconosce modelli molecolari di patogeni e di pericolo associate (PAMPs e smorza) . Lo scopo di questo studio era di determinare se l'attivazione di NLRP3 inflammasome dipende l'infezione con il patogeno Porphyromonas gingivalis parodontale
(P. gingivalis
), o la stimolazione con P. gingivalis
lipopolisaccaride (LPS), e /o extracellulare adenosina trifosfato (ATP).
Metodi
Una linea di cellule epiteliali orali è stato trattato con P. gingivalis
, P. gingivalis
LPS e ATP. L'espressione di geni e proteine di componenti inflammasome NLRP3 sono stati quantificati dalla real time RT-PCR e immunoblot. La produzione di IL-1β e IL-18 è stata misurata mediante test ELISA.
Risultati
Non c'era nessun aumento NLRP3 espressione genica inflammasome dopo P. gingivalis
infezione a meno che pre-stimolato da ATP. incrementi evidenti di NLRP3 genica inflammasome è stata osservata dopo P. gingivalis
stimolazione con LPS, anche pre-stimolato da ATP a 2 ore.
Conclusioni
I risultati indicano che l'attivazione di NLRP3 inflammasome non si basa su P . gingivalis
infezione, a meno che stimolato da P. gingivalis
LPS e /o ATP extracellulare, suggerendo diverse vie di segnalazione sono coinvolti nella risposta immunitaria dell'ospite.
Parole
extracellulare adenosina trifosfato (ATP) NLRP3 inflammasome Porphyromonas gingivalis
(P. gingivalis
) P. gingivalis
LPS Sfondo
parodontite cronica, una delle malattie più comuni e diffusi negli esseri umani in tutto il mondo [1], è definito come un'infezione cronica-driven malattia infiammatoria del periodonto conseguente distruzione del tessuto gengivale, assorbimento di osso alveolare e infine perdita dei denti [2]. Quando si verifica l'infezione, il sistema immunitario innato sarà la prima linea di difesa contro gli agenti patogeni e attiva il sistema immunitario adattativo per la protezione sostenuta da tali invasioni [3].
Intracellulare complessi multi-proteine, conosciute come "inflammasoma NLR" giocare un ruolo centrale nella immunità innata. Tra inflammasoma, il dominio contenenti-3 (NLRP3) inflammasome pirina è il più studiato [4]. cellule epiteliali gengivali esprimono un inflammasome NLRP3 funzionale che può essere attivato da modelli molecolari di patogeni o di pericolo-associata (PAMPs o smorza) [4]. NLRP3 è assemblata con il ASC adattatore proteina (proteina speck-like apoptosi-associato) in un complesso multi-proteico che regola l'attivazione della caspasi-1 e successiva maturazione di citochine pro-infiammatorie interleuchina (IL) -1β e /o IL-18 nella risposta dell'ospite all'infezione parodontale [4]. cellule epiteliali gengivali possono percepire e riconoscere PAMPs o smorza [5] attraverso la stimolazione dei recettori di riconoscimento patogeno (PRR) [1, 3], con conseguente rilascio di citochine pro-infiammatorie IL-1b e IL-18 [6]. Il lavoro fondamentale da Bostanci et al. [7] prima indicato che inflammasoma NLR sono coinvolti nella malattia parodontale, che le risposte a P. gingivalis
infezione sia clinici e studi in vitro
.
Interleuchina-1b (IL-1β), una citochina proinfiammatoria appartenenza alla famiglia di iL-1, è fondamentale nella difesa dell'ospite contro infezioni microbiche [5] e regola le risposte immunitarie e infiammatorie innate. IL-18 è un'altra citochina proinfiammatoria comune [6] famiglia IL-1 ed è stata recentemente descritta come un elemento importante del sistema inflammasome che attiva caspasi-1 e porta all'attivazione del processo infiammatorio. Recenti evidenze hanno dimostrato che la maturazione e la secrezione di IL-1β e IL-18 sono regolati dal complesso inflammasome NLRP3 che contiene il patibolo NLRP3, caspasi-1 e apoptotica proteine speck contenente un dominio caspasi reclutamento C-terminale (ASC) [8 ]. Eccesso IL-1β e IL-18 contribuiscono ad un crescente numero di risposte infiammatorie umane [9]. Sebbene IL-1β e IL-18 appartengono alla stessa famiglia di citochine, la loro espressione genica e la secrezione sono differenzialmente regolati in cellule monocitiche umane in risposta a P. gingivalis
[10]. Pertanto, le citochine della famiglia IL-1 possono partecipare tramite
diversi percorsi nel complesso patogenesi della parodontite [10].
P. gingivalis
, un batterio anaerobico Gram-negativi [11], è stato confermato per essere un agente patogeno predominante parodontale [12] e produce un numero di potenziali fattori di virulenza di perturbare il sistema di difesa dell'ospite [13] e indurre una risposta infiammatoria in malattie parodontali [14]. Tuttavia, l'effetto di P. gingivalis
all'attivazione del inflammasome NLRP3 rimane controverso. Lipopolisaccaride (LPS), come principale componente della parete cellulare di P. gingivalis
[15], è considerato un importante fattore di virulenza suscitare la risposta infiammatoria nella malattia parodontale [16]. Sembra essere unanimemente convenuto che il trattamento LPS dei fagociti mononucleari, [17] [18] i macrofagi e le cellule epiteliali orali [19] induce in modo significativo l'espressione di NLRP3 e procaspase-1 sia a livello di mRNA che di proteine. Studi hanno dimostrato che qualsiasi funzionali polimorfismo in LPS recettori influisce sul processo infiammatorio e gli esiti clinici della malattia parodontale [20]. I risultati di cui sopra suggeriscono che intere P. gingivalis
e P. gingivalis
LPS possono avere effetti diversi sulla attivazione del sistema di inflammasome NLRP3.
Extracellulare ATP (adenosina trifosfato), uno dei primi attivatori descritte al indurre la formazione inflammasome NLRP3, è attribuita al gruppo dei smorza endogeni rilasciata dalle cellule morenti o feriti [21, 22]. La sua presenza è trascurabile nei tessuti sani, ma può salire ad alti livelli micromolari seguente danni ai tessuti nei siti di infiammazione [23]. Gli studi hanno dimostrato ATP indotta caspasi-1 attivazione e il successivo rilascio di IL-1β [24, 25]. Inoltre, Özlem et al. dimostrato che l'IL-1β non è stato secreto meno LPS-trattato o infetti gengivali cellule epiteliali (GECS) sono stati successivamente stimolati con ATP, e che l'ATP non ha avuto effetto aggiuntivo sul NLRP3 o l'espressione ASC in P. gingivalis
infettato GECS [26] . Questi risultati sottolineano la necessità di valutare ulteriormente il ruolo di ATP in attivazione inflammasome NLRP3.
Pertanto, l'attivazione del complesso inflammasome NLRP3 in un modello di cellule epiteliali orali colta da P. gingivalis
infezione, o P. gingivalis
LPS, o la stimolazione ATP è stato testato. Questo ha fornito ulteriori comprensione del meccanismo che sta dietro l'infiammazione parodontale.
Metodi
coltura delle cellule epiteliali orali
La linea di cellule epiteliali (H413) derivata da un carcinoma a cellule squamose umano orale [27], mostra stratificata morfologia delle cellule epiteliali in cultura. H413 linee cellulari clonati sono stati stabiliti utilizzando un metodo della diluizione limite come precedentemente descritto [28]. Le cellule clonate sono state coltivate in Essential Medium (JMEM, modifica Joklik, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) dell'Aquila minima, penicillina /streptomicina (100 UI /ml, Sigma) e il 10% di siero fetale bovino (FCS, CSL Limited , Victoria, Australia) a 37 ° C in 5% di CO
2 [29]. Le culture sono state raccolte con espresso tripla (sostituzione di tripsina, Invitrogen, tecnologie della vita, Carlsbad, CA, USA) in PBS e sub-coltura ogni 3 giorni.
Batterica di coltura cellulare
Porphyromonas gingivalis
(ATCC 33277) è stato coltivato in condizioni anaerobiche per 24 ore a 37 ° C in un brodo triptone soia integrato con emina (5 mg /ml, Sigma) e menadione (1 mg /ml, Sigma). Il giorno di trattamento con le cellule, batteri sono stati centrifugati a 5000 rpm, a 4 ° C per 15 minuti, lavate due volte e risospese in PBS freddo, pH 7,3. Trattamento
cellulare
colture cellulari confluenti H413 (5 × 10 6 cellule T-25 cm 2 flaconi) sono state lavate tre volte con PBS e infettati con P. gingivalis
ad una molteplicità di infezione (MOI) di 100 cellule batteriche per una cellula epiteliale [30 ] per 2 e 4 ore [31, 32], o stimolati con 1-mg /ml ultrapura lipopolisaccaride (LPS) da P. gingivalis
(Invivogen, San Diego, CA, USA) nei mezzi di crescita delle cellule per 2 e 4 h. cellule non infettate e non stimolate serviti come controlli.
Gli esperimenti sono stati effettuati anche dopo il pre-incubazione delle cellule con 5 mm di adenosina trifosfato (ATP) (Invivogen) per 3 ore prima di infezione da P. gingivalis
o la stimolazione con P. gingivalis
LPS per 2 e 4 ore. Le cellule pre-incubate con 5 mM ATP per 3 h erano come controlli per questi gruppi.
Isolamento RNA e quantitativa in tempo reale RT-PCR
Dopo il trattamento, le cellule sono state raccolte in 1 ml di reagente Trizol (Invitrogen) e RNA estratto come da protocollo Trizol. Per la trascrizione inversa, la prima-Strand cDNA sono stati sintetizzati con oligo (dT) 12-18 (Invitrogen), 10 mM dNTP (Promega, Madison, WI, USA), 5 × primo buffer supporto, RNaseOUT ™ ricombinante RNase Inhibitor (Invitrogen) e SuperScript ™ III trascrittasi inversa (Invitrogen) secondo il protocollo del produttore.
Primer per geni che codificano per i componenti inflammasome (NLRP3, ASC e caspasi-1) e le citochine iL-1b e iL-18 (Tabella 1) sono stati progettati utilizzando il software Oligo Explorer (1.1.0) e sintetizzati da Integrated DNA Technologies (IDT, Coralville, IA, stati Uniti d'America). In tempo reale analisi RT-PCR sono state eseguite mediante saggi basati SYBR Green utilizzano il MxPro-Mx3005P sistema Stratagene (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). reazioni di PCR sono state condotte con 2 ml di campioni di cDNA diluito, 200 Nm di ogni rispettivo avanti e retromarcia innesco in una miscela di reazione di 20 microlitri finale con Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG (Invitrogen). campioni di cDNA isolati da non manipolati H413 clone-1 le cellule sono state quantificate dal kit PicoGreen (Invitrogen) e quindi utilizzati per la costruzione di curve standard (2-2000 PG) con riferimento alla espressione della casa mantenendo gene che codifica per β-actina. Le reazioni di PCR per ogni gene sono stati eseguiti in triplicato in piastre a 96 pozzetti, e avviate mediante attivazione a 95 ° C per 2 min, seguiti da 40 PCR cicli di denaturazione a 95 ° C per 15 s, ricottura e estensione a 60 ° C per 30 s. I risultati sono stati analizzati utilizzando MxPro 4.10 software.Table 1 primer utilizzati per real-time RT-PCR
Geni
Oligos
Primers5'-3 '
ampliconi
atteso dimensione
numeri UniGene
NLRP3
F-primer
GCTGGACCTGAGTGACAAC
151 bp
Hs.159483
R-primer
GCTGAGTACCGAGGACAAAG
ASC
F-primer
AGGCCTGCACTTTATAGACC
174 bp
Hs.499094
R-primer
GCTGGTGTGAAACTGAAGAG
caspase-1
F-primer
GAAAAGCCATGGCCGACAAG
205 bp
Hs.2490
R-primer
GCCCCTTTCGGAATAACGGA
IL-1β
F-primer
GGCCCTAAACAGATGAAGTG
90 bp
Hs.126256
R-primer
GTAGTGGTGGTCGGAGATTC
IL-18
F-primer
GCATCAACTTTGTGGCAAT
161 bp
Hs.83077
R-primer
CCGATTTCCTTGGTCAAT
β-actin
F-primer
ACTCTTCCAGCCTTCCTTC
216 BP
Hs.520640
R-primer
GGAGCAATGATCTTGATCTTC
immunoenzimatico-ELISA per quantificare i livelli di IL-1β e IL -18
Un panino standard di test enzimatico immuno-assorbente (ELISA) è stato utilizzato per misurare la produzione di citochine di IL-1β e IL-18. In breve, surnatanti di prova (trattati con P. gingivalis
, P. gingivalis
LPS, ATP + P. gingivalis
o ATP + P. gingivalis
LPS) e colture cellulari di controllo sono stati raccolti a ogni ora ( 1, 2, 3, 4, 5, 6 h), poi particelle rimosse per centrifugazione e analizzato immediatamente o aliquotati e conservati a -20 ° C. Human IL-1β e IL-18 monoclonale specifico e policlonali (1 mg /ml) sono stati pre-rivestita con alta vincolante piastre a 96 pozzetti (Corning Incorporated, USA) in tampone carbonato (pH 9,0) a 4 ° C durante la notte. Dopo aver rimosso la soluzione di rivestimento e lavaggio del piatto tre volte con 200 microlitri di PBS /pozzetto, con la piastra è stata bloccata con albumina 3% di siero bovino (BSA, Sigma) a 4 ° C durante la notte. sono stati aggiunti i campioni di prova di triplicare pozzetti per 90 min a temperatura ambiente, seguito da lavaggio con 0,05% Tween20 /PBS (TPBS) tre volte; poi incubate con anticorpo secondario (goat anti topo /coniglio IgG, (DAKO, Glostrup, Danimarca) coniugato con fosfatasi alcalina (AP)) diluito 1: 1500 in TPBS per 2 ore a temperatura ambiente poi lavata con TPBS buffer di 3 volte. coniugati legati sono stati rilevati da pNPP (p-nitrofenil-fosfato) e l'assorbanza misurata a 405 nm in un lettore per micropiastre (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) dopo 15-30 minuti di incubazione a temperatura ambiente. Le reazioni sono state fermate aggiungendo un volume uguale di 1,00 M NaOH. L'IL-1β umana e IL-18 concentrazione dei campioni sono stati interpretati da una curva standard.
Immunoblots per NLRP3, ASC e caspasi-1 proteine
Per misurare l'espressione della proteina inflammasome, 2 e 4-H culture le diverse condizioni (trattate con P. gingivalis
, P. gingivalis
LPS, ATP 3 h + P. gingivalis
o ATP 3 h + P. gingivalis
LPS) sono stati estratti in tampone campione SDS e separati mediante PAGE usando gradiente da 5 a 12% mini-gel, trasferito su membrane di nitrocellulosa (Bio-Rad) e bloccate durante la notte con 3% BSA (Sigma) in 0,1 M Tris tamponata soluzione sali pH 7,4 (TBS). antigeni cancellati sono stati incubati con coniglio policlonali anticorpi anti-umani CIAS1 /NALP3, TMS1 /ASC, caspasi-1 (1 mg /ml, Abcam, Cambridge, UK), e β-actina (0,1 mg /ml, Gentex, Zeeland, MI , Stati Uniti d'America) come controllo di carico nel 0,05% Tween20 /TBS per 4 ore, lavato per tre volte e successivamente incubate con fosfatasi alcalina (AP) coniugata anticorpo secondario (di capra anti IgG di coniglio, DAKO) diluito 1: 1500 in Tween20 /TBS per 2 h. anticorpo legato è stato visualizzato con AP substrato (Bio-Rad) dopo lo sviluppo di reattività per proteine da anticorpo di controllo. Analisi statistica
Tutti i dati sono stati analizzati da paired t-test
(media ± SD, due coda , 95% gamma IC) di almeno tre esperimenti consecutivi per real-time RT-PCR ed ELISA. Per la quantificazione Western Blot, l'analisi densitometrica è stata eseguita l'intensità livello di grigio delle bande di destinazione relativi a controllare le bande beta-actina derivati da film digitalizzati, elaborati utilizzando Gene strumento di immagine software di analisi (GeneToos, versione 4.02, Syngene, Cambridge, UK) [33]. P
& lt; 0.05 è stato considerato statisticamente significativo.
Risultati
inflammasome (NLRP3, ASC e caspasi-1) espressione in risposta a P. gingivalis
, P. gingivalis
LPS e ATP oltre a P. gingivalis
/P. gingivalis
LPS
In tutti gli esperimenti, non vi erano differenze significative nell'espressione genica tra i gruppi di controllo non stimolate e gruppi di controllo pretrattati con ATP.
Come mostrato in fig. 1a, c'era down-regolazione dell'espressione genica NLRP3 dopo P. gingivalis
infezione a 2 e 4 ore rispetto al gruppo di controllo. Al contrario, vi è stato un aumento dell'espressione genica di NLRP3 a 2 h con P. gingivalis
stimolazione LPS. Inoltre, NLRP3 era significativamente up-regolati dopo il pre-incubazione con ATP per 3 ore quindi l'infezione da P. gingivalis
e stimolazione con P. gingivalis
LPS per 2 ore, ma è stato down-regolato a 4 ore. A livello della proteina (Fig. 2), mentre le cellule sono state incubate per 2 e 4 h con P. gingivalis P. gingivalis Comprare e vendere stimolazione LPS o pretrattamento con l'ATP per 3 ore, le tendenze della proteolisi di NLRP3 bande corrispondevano a quella della espressione genica. Ciò indica che l'attivazione di NLRP3 dipendeva P. gingivalis
LPS o /e ATP, ma non P. gingivalis
infezione. Figura. 1 espressioni gene NLRP3, ASC e caspasi-1. Cambiamenti significativi nei geni che codificano per inflammasome NLRP3 (a), adattatore proteina associata (ASC) (b), e caspasi-1 (c) con diversi trattamenti di P. gingivalis
infezione, P. gingivalis
LPS stimoli, e ATP oltre a P. gingivalis
o P. gingivalis
LPS nelle cellule epiteliali H413. * P
& lt; 0.05, ** P
& lt; 0,01, paired t-test
Fig. 2 Western Blot che mostra l'espressione della proteina NLRP3 nelle cellule epiteliali H413 trattate con diverse condizioni (P. gingivalis
, P. gingivalis
LPS e ATP oltre a P. gingivalis
o P. gingivalis
LPS). Le tendenze delle bande NLRP3 misurati corrispondevano alla espressione genica NLRP3. * P
& lt; 0.05, paired t-test
In Fig.1b, nel corso del tempo P. gingivalis
infezione, c'erano diminuzioni significative dei livelli di mRNA ASC (2 e 4 h) rispetto al gruppo di controllo, e un aumento significativo dei livelli di mRNA ASC sono stati osservati a 2 ore stimolazione con P. gingivalis
LPS. Per ATP oltre a P. gingivalis
infezione, non vi era up-regolazione di ASC a 2 ore, seguita da down-regolazione a 4 ore rispetto al gruppo di pre-trattamento ATP. Per ATP più P. gingivalis
stimolazione con LPS, c'è stata una marcata riduzione delle ASC a 4 h rispetto al gruppo pretrattamento ATP. Questi risultati suggeriscono che i cambiamenti ASC mRNA sono fondamentali in P. gingivalis
LPS e ATP attivazione indotta NLRP3 inflammasome. A livello di proteine, sono stati misurati i cambiamenti simili a proteine ASC (dati non mostrati).
Inoltre, come evidente in Fig. 1c, i dati hanno mostrato che non vi era alcun aumento della caspasi-1 espressione genica sia in P. gingivalis
infetti e P. gingivalis
LPS stimolati gruppi. Dopo che le cellule sono state pre-incubate con ATP per 3 ore, il livello di caspasi-1 nei due gingivalis P.
infezione (2 h) e P. gingivalis
stimolazione con LPS (2 e 4 h) gruppi era significativa up- regolata rispetto al gruppo pretrattamento ATP. Questi risultati indicano che la caspasi-1 attivazione dipende dalla stimolazione ATP di P. gingivalis
infetti o P. gingivalis
LPS cellule trattate. Non ci sono stati cambiamenti sul caspasi-1 livello di proteina mediante immunoblot (dati non riportati). Espressione
IL-1β in risposta a P. gingivalis
, P. gingivalis
LPS e ATP oltre a P. gingivalis
/P. gingivalis
LPS
Allo stesso modo, per determinare le variazioni di espressione di IL-1β attraverso l'attivazione di componenti inflammasome, l'espressione genica di IL-1β è stata misurata mediante real-time RT-PCR (Fig. 3a). Nel corso del tempo P. gingivalis
infezione, un aumento significativo del livello di mRNA pro-IL-1β è stata misurata a 2 h rispetto al gruppo di controllo, che poi diminuita al livello di controllo a 4 h. L'aumento dei livelli di mRNA pro-IL-1b sono state osservate anche dopo che le cellule pre-trattate con ATP per 3 h poi infettati da P. gingivalis
a 2 e 4 ore. Non ci sono stati cambiamenti con cellule stimolate con P. gingivalis
LPS e ATP oltre a P. gingivalis
LPS. In surnatanti di colture cellulari (Fig. 3b), c'era un'alta concentrazione di IL-1β maturo a 2 ore nelle P. gingivalis
gruppo infezione, e al 3 e 4 h in ATP più P. gingivalis
gruppo infezione, che corrispondeva con l'espressione del gene pro-IL-1β (Fig. 3a). Non c'era la secrezione di IL-1β rilevato nei P. gingivalis
gruppo stimolazione LPS, ma un notevole incremento in ritardo in risposta ad ATP più P. gingivalis
gruppo LPS a 5 h (Fig. 3b). Questi risultati indicano che P. gingivalis
infezione ha una maggiore capacità di indurre la secrezione di IL-1β di P. gingivalis
LPS. Figura. 3 a cambiamenti nei livelli pro-IL-1β mRNA nelle cellule H413 trattate con P. gingivalis
infezione e ATP pretrattamento. b dati ELISA mostrano maturo proteina IL-1β liberato dalla H413 cellule dopo diversi trattamenti. * P
& lt; 0.05, ** P
& lt; 0,01, paired t-test
IL-18 espressione in risposta a in risposta a P. gingivalis
, P. gingivalis
LPS e ATP oltre a P. gingivalis
/P. gingivalis
LPS
L'espressione genica di IL-18 è stata misurata anche mediante real-time RT-PCR (Fig. 4a). Non c'era alcun cambiamento nella pro-IL-18 misurato nei P. gingivalis
gruppo infezione, ma significativamente ridotto pro-IL-18 nei P. gingivalis
LPS gruppo stimoli a 2 ore. Inoltre, il pre-trattamento delle cellule con ATP per 3 h indotti l'up-regolazione di pro-IL-18 a tutti i tempi e significativamente aumentato IL-18 espressione sia nella gingivalis
infezione P. e P. gingivalis
LPS gruppi stimoli. In supernatanti di coltura cellulare (Fig. 4b), cellule stimolate con P. gingivalis
LPS avuto un aumento significativo matura di IL-18 secrezione che ha raggiunto un picco tra 4 ore e 5 ore. Questo non è stato evidente nella P. gingivalis
gruppo infezione. Questo livello di proteine di alta non corrispondeva con il basso livello di mRNA pro-IL-18 nei P. gingivalis
gruppo LPS, possibilmente come concentrazione di proteine è influenzata da diversi parametri - soprattutto la sintesi e la scissione [34]. Dopo che le cellule sono stati pre-trattati con ATP per 3 ore, la secrezione di IL-18 maturo in mezzi di coltura cellulare è stata misurata in ATP più P. gingivalis
gruppo infezione, e ha dimostrato un notevole aumento della concentrazione delle citochine. Tuttavia, nei ATP più P. gingivalis
gruppo LPS, una curva bifasica è stato dimostrato, che non riflette il livello di mRNA [34]. Questi risultati indicano che P. gingivalis
infezione non ha indotto maturo IL-18 secrezione, mentre P. gingivalis
LPS o stimolazione ATP ha portato ad un maturo IL-18 di produzione. Figura. 4 a cambiamenti nei livelli di pro-IL-18 mRNA nelle cellule H413 con diversi trattamenti di P. gingivalis
LPS stimoli e ATP oltre a P. gingivalis
infezione o P. gingivalis
LPS. b dati ELISA mostrano maturo IL-18 proteina rilasciata dalle cellule H413 dopo diversi trattamenti. * P
& lt; 0.05, ** P
& lt; 0,01, paired t-test
Cambiamenti nel complesso inflammasome NLRP3 dopo stimolazione con P. gingivalis
, P. gingivalis
LPS e ATP
Figura 5 mostra una sintesi della risposta immunitaria innata contro P. gingivalis
infezione, e P. gingivalis
LPS e la stimolazione ATP in questo modello cellulare. Quando le cellule non vengono pretrattati con ATP (pannello di sinistra), l'infezione da P. gingivalis
in questo modello non innescare l'attivazione del complesso inflammasome NLRP3, tra cui NLRP3, ASC e caspasi-1, fino a quando P. gingivalis
stimolazione LPS, anche se in breve tempo 2 h (tranne caspasi-1). In particolare, la produzione di IL-1β non ha invocato l'attivazione del inflammasome NLRP3 ed è coinvolto nelle prime fasi di infiammazione. IL-18 di produzione richiede sia NLRP3 e l'attivazione ASC dopo stimolazione con P. gingivalis
LPS. Quando le cellule sono pretrattati con ATP (pannello di destra), una rapida risposta di attivazione NLRP3 inflammasome stato mostrato (2 h), con conseguente produzione delle citochine IL-1 beta e IL-18 in cellule con P. gingivalis
infezione . Tuttavia, quando le cellule sono stimolate con P. gingivalis
LPS, la produzione di IL-1β richiesto caspasi-1 attivazione e ha mostrato un aumento del ritardo nella risposta al trattamento ATP (pannello di destra). I risultati indicano che P. gingivalis
, P. gingivalis
LPS e ATP tutti hanno effetti diversi sulle cellule epiteliali per produrre la risposta infiammatoria finale. Figura. 5 innata risposta immunitaria al P. gingivalis
infezione, o P. gingivalis
LPS e la stimolazione ATP nelle cellule epiteliali. Nel pannello di sinistra, quando le cellule sono stimolate con P. gingivalis
infezione o P. gingivalis
LPS senza ATP pretrattamento, il complesso inflammasome NLRP3 è inibito fino P. gingivalis
stimolazione LPS, fatta eccezione per la caspasi-1 . la produzione di IL-1β non NLRP3 inflammasome dipendente, tuttavia IL-18 si basa sulla secrezione NLRP3 e l'attivazione ASC. Nel pannello di destra, le cellule pretrattate con l'ATP, che attiva NLRP3 inflammasome, comporta la successiva liberazione di citochine IL-1b e IL-18 in P. gingivalis
infettate cellule. ATP può anche promuovere caspasi-1 attivazione su P. gingivalis
stimolazione LPS. La secrezione di IL-1β è sempre coerente con la caspasi-1 attivazione dopo stimolazione con P. gingivalis
LPS
Discussione
In questo studio, P. gingivalis
infezione down-regola componenti inflammasome NLRP3, tra cui NLRP3 , ASC e caspasi-1 in cellule epiteliali a tutti i punti di tempo, il che indica che P. gingivalis
può sia up-regolare o down-regolare l'espressione NLRP3, a seconda del tipo di cellula [35]. In questo modello, P. gingivalis
può smorzare l'endpoint risposte immunitarie innate inibendo l'attivazione di NLRP3 inflammasome e eludere la sorveglianza di accoglienza, offrendo un vantaggio di sopravvivenza di tutti gli organismi conviventi del biofilm [35]. Nel frattempo, up-regolata l'espressione genica di IL-1β dopo P. gingivalis
infezione, dimostra che l'IL-1β è una citochina fondamentale nella difesa dell'ospite contro P. gingivalis
infezione [5]. Inoltre, IL-1β non è NLRP3 o caspasi-1 dipendente [5, 36] e altri fattori possono influenzare la secrezione della proteina IL-1β. Pertanto, ipotizziamo che la secrezione di IL-1β nelle prime fasi di P. gingivalis
infezione avrebbe giocato un ruolo molto importante nella lotta contro il patogeno come parte della risposta immunitaria innata [37]. Questo è coerente con la conclusione di Dinarello che IL-1β è uno dei primi citochine essere secreto durante le fasi iniziali di infiammazione e partecipa a quasi tutti eventi coinvolti nell'attivazione e regolazione di infiammazione [36]. Questo tipo di attivazione IL-1β inflammasome-indipendente può contribuire in modo sostanziale alla infiammazione dei tessuti [38].
Nel presente studio, LPS provoca una risposta immunitaria che colpisce attraverso up-regolazione dell'espressione genica di NLRP3 e ASC, ma non caspasi -1, che indica che P. gingivalis
LPS sarebbe un fattore chiave per suscitare la risposta infiammatoria che porta allo stato malato [16] ed è considerato un importante fattore di virulenza nella patogenesi della malattia parodontale. Tuttavia, la ricerca Jain e Darveau di ha chiarito che l'attivazione di NLRP3 e ASC dopo stimoli proinfiammatorie quali LPS possono essere coinvolti nella apoptosi delle cellule ospiti, che sostiene l'idea di P. gingivalis
morte cellulare indotta [39], che sarebbe poi facilitare periodonto-agenti patogeni per invadere e distruggere i tessuti epiteliali. Inoltre, la caspasi-1 viene sintetizzata come zimogeno inattivo. La sua attivazione è strettamente regolato da inflammasoma e associata ad una forma rapida e litico di morte cellulare noto come pyroptosis [40]. Questo potrebbe spiegare il meccanismo che caspasi-1 attivazione viene inibita dopo P. gingivalis
stimolazione LPS fino attivata con stimoli ATP nel presente studio.
ATP è un segnale di soccorso extracellulare molto efficiente [41]. Come uno dei primi attivatori descritte di indurre la formazione inflammasome NLRP3, si è attribuita al gruppo dei smorza endogeni, che provengono da cellule morte [22]. In questo studio, dimostriamo che l'ATP attiva la inflammasome NLRP3, successivamente rilasciando citochine IL-1 β e IL-18, anche se l'effetto è molto transitorio e la concentrazione può non essere sufficiente a mantenere il livello di attivazione inflammasome NLRP3. Questi risultati sostengono che l'ATP extracellulare, come un segnale di pericolo, si traduce in assemblaggio di NLRP3 inflammasome e la secrezione di citochine maturi in P. gingivalis
cellule -infected [26]. Inoltre, un comune denominatore di ATP extracellulare attivazione NLRP3 ha la capacità di formare pori della membrana che inducono danni della membrana o causano perturbazione della concentrazione di ioni intracellulare [22].
Inoltre, dopo stimolazione con ATP e P. gingivalis
LPS, la riduzione dell'espressione genica ASC possono servire come meccanismo per spegnere l'infiammazione, evitando così risposte immunitarie overzealous [32]. Analogamente, la linea cellulare epiteliale (H413) utilizzato in questo studio ha la funzione di limitare l'attività e la secrezione di IL-1β [42] per proteggere la cella contro la distruzione dei tessuti. Questo può spiegare la nostra scoperta mostra un incremento posticipata di IL-1β in risposta alle ATP più P. gingivalis
stimolazione LPS.
Conclusioni
I risultati indicano che P. gingivalis
stimolazione LPS indotto una maggiore proinfiammatoria reazione di P. gingivalis
infezione, e questa azione si fa più intenso dopo il pre-trattamento di ATP. Questi risultati possono fornire nuove intuizioni in obiettivi per le strategie terapeutiche per il trattamento di malattie infiammatorie come la parodontite
Abbreviazioni
ASC:.
Apoptosi-proteina associata speck simile
ATP:
adenosina trifosfato
smorza:
Pericolo-associati modelli molecolari
NLRP3:
Nod recettore-like (NLR) della famiglia, il pirina dominio contenenti-3
PAMPs:
patogeni associati modelli molecolari
P . gingivalis
:
Porphyromonas gingivalis
P. gingivalis
LPS:.
lipopolisaccaride da P. gingivalis
Dichiarazioni
Ringraziamenti
ringraziamo il professor Neil Hunter e il dottor ping Ye per la loro tecnica e di laboratorio supporta. Ringraziamo anche il dottor Gao Jinlong e il dottor Zhou Xiaoyan per la fornitura di P. gingivalis
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