Abstract
sfondo
I risultati di studi su animali e umani hanno indicato che una sospensione di idrossido di calcio oleosa (OCHS ) può migliorare presto la guarigione delle ferite nel trattamento della parodontite. Idrossido di calcio come componente principale è ben noto per la sua attività antimicrobica, tuttavia attualmente l'effetto di OCHS sull'influenza parodontale cicatrizzazione /rigenerazione è ancora molto limitata. Lo scopo di questo studio in vitro è stato quello di studiare l'effetto di OCHS sui batteri periodontopathogenic nonché l'attaccamento e la proliferazione degli osteoblasti e fibroblasti del legamento parodontale.
Metodi
osteoblasti umani alveolare (HAO) e legamento parodontale (PDL ) fibroblasti sono stati coltivati su 3 concentrazioni di OCHS (2,5, 5 e 7,5 mg). Adesione e proliferazione sono stati contati fino a 48 ore e la mineralizzazione è stata determinata dopo 1 e 2 settimane. Inoltre potenziale attività inibitoria della crescita di microrganismi associati alla malattia parodontale (ad esempio Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsizia
, Aggregatibacter actinomycetemcomitans
), così come l'influenza di periodontopathogens e OCHS sui conti Hao e PDL fibroblasti sono stati determinati.
risultati
Più di un aumento di 2 volte in cellule aderenti HAO è stata osservata a 4 ore dopo l'applicazione di OCHS rispetto al gruppo di controllo (p = 0.007 per 2,5 mg). La proliferazione delle cellule HAO a 48 h è stata stimolata da concentrazioni moderate (2,5 mg, 5 mg) di OCHS (ogni p & lt; 0,001), mentre una concentrazione elevata (7,5 mg) di OCHS era inibitoria (p = 0,009). Mineralizzazione è stata osservata solo per le cellule trattate con HAO OCHS. OCHS non esercitava alcun effetto positivo sulla attaccamento o la proliferazione dei fibroblasti PDL. Anche se OCHS non ha avuto un effetto antibatterico, lo ha fatto influenzare positivamente l'attaccamento e la proliferazione delle cellule Hao e fibroblasti PDL in presenza di periodontopathogens.
Conclusioni
L'attuale dati suggeriscono che OCHS promotes attaccamento osteoblasti, la proliferazione e la mineralizzazione in un modalità e risultati concentrazione-dipendente sono mantenuti in presenza di agenti patogeni parodontali
Parole
grassa calcio sospensione di idrossido di osteoblasti alveolari umani parodontale fibroblasti del legamento Periodontopathogens elettronico materiale supplementare
la versione online di questo articolo (doi:. 10. 1186 /1472-6831-14-9) contiene materiale supplementare, che è disponibile per gli utenti autorizzati.
Sfondo
la parodontite è una malattia infiammatoria cronica indotta da batteri, e uno squilibrio del sistema immunitario di difesa innata contribuisce notevolmente alla distruzione del periodonto [1]. Un piccolo gruppo di anaerobica prevalentemente gram-negativi o batteri microaerofili all'interno placca è associata con l'inizio e la progressione della parodontite. Organismi fortemente implicati come agenti eziologici di parodontite includono Aggregatibacter actinomycetemcomitans
, Porphyromonas gingivalis
, Tannerella forsizia
e Treponema denticola
[2]. Inoltre, altre specie, come Campylobacter retto
, eubacterium nodatum
, Fusobacterium nucleatum
, Prevotella intermedia
, Parvimonas micra, Streptococcus constellatus
sostegno patogenesi della malattia [2, 3]. I batteri interagiscono con le cellule ospiti conseguente espressione di mediatori infiammatori, transizione dei neutrofili polimorfonucleati al gengivale [1, 4]. Host risposta contribuisce alla distruzione dei tessuti e il riassorbimento osseo con il meccanismo principale del rapporto di RANKL (recettore attivatore del nucleare-factor-kB ligando) per osteoprotegerina [1].
E 'stato ben documentato che la risoluzione dell'infiammazione e sosta della malattia progressione può essere prevedibile ottenuta con la terapia parodontale chirurgica non chirurgica e convenzionale [5]. L'obiettivo finale della terapia parodontale è comunque la rigenerazione delle strutture di sostegno del dente perso a causa di malattia parodontale e dovrebbe portare a formazione di nuovo cemento radicolare, legamento parodontale e osso [6]. Il trattamento con membrane barriera da solo o in combinazione con diversi materiali innesto, l'uso di sostanze attive biologiche come le proteine della matrice dello smalto o fattori di crescita hanno dimostrato di promuovere la rigenerazione parodontale e migliorare in modo significativo i risultati clinici rappresentati da sondare riduzione profondità, il guadagno di attacco clinico e riempimento difetti [7]. Alcuni dei materiali sono stati descritti per agire antimicrobica, ad es
., Derivati della matrice dello smalto inibiscono la crescita di P. gingivalis
[8]. Uno studio analizzando l'influenza di cinque diversi biomateriali utilizzato per la chirurgia parodontale rigenerativa contro due A. actinomycetemcomitans
mostrato attività antimicrobica dei due materiali contro uno dei due ceppi testati, più inibitorio era una sospensione di idrossido di calcio oleosa [9].
Questo oleosa idrossido di calcio contenente pasta (OCHS) (Osteora®, in precedenza Osteoinductal®, DFS-Diamon GmbH Riedenburg, Germania) è stato suggerito di possedere tali da poter influire positivamente parodontale la guarigione delle ferite /rigenerazione [10-14]. Si basa su idrossido di calcio (Ca (OH)
2) e utilizza una sostanza supporto costituito prodotta sinteticamente pedum oleum porcine e l'album vaselinum. Idrossido di calcio, una polvere bianca inodore con una bassa solubilità in acqua, ha proprietà antibatteriche nel rilascio di ioni ossidrili altamente reattivi in fluidi acquosi che danneggia membrane citoplasmatiche, proteine e DNA [15]. Nel trattamento endodontico viene usato come agente pulp-capping [16], come disinfettante per devitalizzazione [17] e per apexification dopo polpa morte [18]. Nella pasta, una necrosi superficiale indotta dall'elevato pH avviene con una leggera reazione infiammatoria e la formazione di tessuto duro nell'ambiente [19].
Diversi studi su animali che hanno valutato gli effetti di OCHS sulla rigenerazione ossea in vari tipi di difetti diversi esiti fruttati [10, 11, 20, 21]. In un modello di rigenerazione ossea guidata con calvaria cavia, OCHS non è riuscito a esercitare una proprietà osteoinduttive e guarigione ossea ostacolato se usato in combinazione con la rigenerazione ossea guidata [22]. Inoltre, la guarigione di impianti endossei non era migliorata quando queste sono state inserite insieme OCHS [21]. D'altra parte, l'applicazione della OCHS durante la fase osteotomia di distrazione osteogenesi migliorato formazione di nuovo osso [10] in sperimentalmente creati difetti parodontali infraossei, l'applicazione di OCHS in combinazione con la chirurgia sportellino promosso rigenerazione parodontale [11].
risultati variabili legate alla guarigione delle ferite e la rigenerazione sono stati trovati anche nei pochi studi clinici. In uno studio, OCHS migliorato presto la guarigione della ferita se usato in combinazione con la terapia non chirurgica [12]. In un altro studio clinico controllato valutare la guarigione di difetti intraossei trattati con chirurgia sportellino con e senza OCHS, tasca significativamente più alta Profondità riduzioni e aumenti livello clinico di attacco sono stati trovati nei difetti trattati pieni di OCHS rispetto ai controlli (vale a dire l'accesso lembo sola chirurgia ) [13]. Al contrario, un altro studio clinico controllato di recente con un design simile non ha dimostrato alcun risultati superiori a seguito dell'applicazione di OCHS quando rispetto alla sola chirurgia sportellino [23]. Anche se molto
indagine è stata ottenuta in modelli animali e clinici , conoscenza circa la sua modalità di azione ed effetti su (PDL), le cellule parodontale legamento, osteoblasti che formano l'osso così come i microbi orale è ancora limitata. Lo scopo del presente studio è duplice; 1) Per determinare una potenziale attività antimicrobica di OCHS compresi i suoi componenti nei confronti di specie batteriche coinvolte nella patogenesi della parodontite e 2) per determinare l'effetto sulla attaccamento e la proliferazione delle cellule ospiti (fibroblasti del legamento parodontale e osteoblasti).
Metodi
Le sostanze in esame
OCHS (Osteora®, DFS-DIAMON GmbH, Riedenburg, Germania) è stato utilizzato. Secondo le informazioni del produttore è composto da 20% w /w Ca (OH) 2, il 40% oleum pedum e il 40% Album vaselinum. Nel disegno sperimentale l'uso di OCHS stessa nonché Ca (OH) 2 e oleum pedum stati usati come sostanze di prova.
Determinazione di efficacia antimicrobica della sospensione di idrossido di calcio oleosa
I seguenti specie sono stati testati nei saggi antimicrobici: F. nucleatum
ATCC 25586, P. intermedia
ATCC 25611, P. gingivalis
(ATCC 33277 e tre isolati clinici), T. forsizia
ATCC 43037, A. actinomycetemcomitans
(Y4 e tre isolati clinici), C. retto
ATCC 33238, eichenella corrodens
ATCC 23834, E. nodatum
ATCC 33099, pag micra
ATCC 33270, e Capnocytophaga gingivalis
ATCC 33624. Tutti i ceppi sono stati precultivated a 37 ° C in condizioni adeguate (anaerobica eccetto A. actinomycetemcomitans
- 5% CO 2) 42 h prima degli esperimenti. Modificato soia agar trittico [24] è stato utilizzato come mezzo di coltura.
In primo luogo, la tecnica di diluizione micro-brodo è stato utilizzato per determinare le MIC. Dopo subcoltivazione di ceppi batterici, un inoculo definito (McFarland 0,5) è stato aggiunto in un rapporto di 1: 9 a brodo contenente le sostanze in esame. Oleum-pedum (solubilizzato con Tween 20 in un rapporto 1: 1) è stata testata in una concentrazione di 0,625% - 20%, Ca (OH) 2 in una concentrazione di 3,13 mg /ml - 100 mg /ml atto ad la concentrazione disponibile in OCHS. In esperimenti test oleum pedum, ciascuna provetta conteneva il 20% di Tween 20. Dopo un tempo di incubazione di 42 h (18 h aerobi), la crescita di microbi è stato analizzato mediante controllo visivo della torbidità e subcoltivazione. Per OCHS agenti come solvente DMSO, Tween 20 e oli diversi hanno dimostrato ma era impossibile per solubilizzare OCHS. Pertanto, i metodi standard per la determinazione di attività antimicrobica contro anaerobi e altri microrganismi a crescita lenta (microbroth-diluizione, agardilution) non erano applicabili. Infine un metodo di agar modificato è stato utilizzato come segue: Cento microlitri di sospensione di batteri (MacFarland 0.5) sono state diffuse su piastre di agar (Wilkins Chalgren agar integrato con il sangue del 5%). Poi, ogni due lacune sono state preparate utilizzando una sonda di carotaggio (diametro 7 mm). Dopo di che, il gap è stato riempito con 100 ml di agar seguita dalla sostanza in esame (50 mg e 100 mg di OCHS). Dopo incubazione a 37 ° C in atmosfera anaerobica per 42 ore, sono state misurate le zone di inibizione.
Per escludere un effetto di crescita di promozione di OCHS, sospensioni di ceppi batterici selezionati (P. gingivalis
ATCC 33277, pag gingivalis
M5-1-2, A. actinomycetemcomitans
Y4 e F. nucleatum
ATCC 255866) sono stati aggiunti a 200 ml di brodo nutriente addizionato con 50 mg di OCHS (20% w /v). Tubi erano state incubate per 24 ore in condizioni anaerobiche. Immediatamente prima di estrarre 25 ml di miscela, le sospensioni sono state mescolate con vortex e breve centrifugazione a 400 g
. I rimossi 25 ml sono stati diluiti e ogni 100 ml sono stati piastrati su piastre di agar. Il numero di batteri vitali sono stati determinati dal conteggio della colonia unità formanti (cfu).
Effetto della sospensione di idrossido di calcio oleosa sugli osteoblasti e fibroblasti del legamento parodontale
Nella seconda parte dello studio, osteoblasti alveolari umani (HAO) come così come i fibroblasti umani PDL sono stati utilizzati. Entrambi i tipi di cellule sono stati ottenuti da tre pazienti parodontalmente sani durante l'intervento chirurgico (estrazione dei denti per motivi ortodontici). frammenti ossei umani sono stati coltivati da un modello espianto come precedentemente descritto [25, 26]. Dopo la digestione collagenasi, le cellule sono state placcate HAO in T-75 flaconi contenenti mezzo di coltura cellulare (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA) supplementato con 10% di siero fetale bovino (FBS, Invitrogen). cellule PDL sono state raccolte dalla terza parte centrale del dente e messi in T-25 fiasche di coltura cellulare fino a confluenza delle cellule [27]. Il mezzo di coltura era DMEM supplementato con 10% FBS. Per gli esperimenti, entrambi i tipi cellulari sono stati utilizzati da passaggi 4-6. L'identità delle cellule è stata confermata come descritto di recente [26, 27]. Utilizzando il tessuto per scopi di ricerca è stato approvato dalla commissione etica del Cantone di Berna. Tutti i pazienti hanno dato il loro consenso.
Negli esperimenti, i vetrini sono stati posti in piastre da 24 pozzetti e ricoperti di sostanze in esame. Le sostanze in esame sono stati OCHS in tre diverse concentrazioni (1 U, U 2, 3 U). 1 U rappresentato 2,5 mg di materiale totale (cioè 2 U è equivalente a 5 mg e 3 U a 7,5 mg). Inoltre, idrossido di calcio in soluzione acquosa (1,5 mg corrispondente a 3 U di OCHS) e la sostanza oleum pedum (3 mg corrispondenti a 3 U di OCHS) sono stati utilizzati. scivoli Scoperti serviti come controlli negativi. Subito dopo, sono state aggiunte cellule HAO ad una densità di 10.000 cellule /pozzetto ed i pozzetti sono stati incubati a 37 ° C con 5% di CO 2. Le cellule sono state fissate e colorate per gli esperimenti di adesione e proliferazione a 2 ore, 4 ore, 24 e 48 ore con colorazione DAPI. la differenziazione delle cellule è stata analizzata dalla determinazione dell'attività della fosfatasi alcalina e mineralizzazione utilizzando 2% alizarin rosso S colorazione 1 e 2 settimane dopo la semina. Ogni 10 campi di 1 mm 2 sono stati contati. I campi sono stati selezionati equamente distribuiti da tutta la diapositiva. Una griglia di conteggio è stato utilizzato e ogni sottocampo (50 micron × 50 micron) con colorazione positiva per noduli di calcio è stato contato in relazione al numero totale dei sottocampi; il mezzo è stato utilizzato come unico valore per l'analisi. La mineralizzazione è stata misurata 1 e 2 settimane dopo l'inizio degli esperimenti. Per garantire che solo la mineralizzazione delle cellule è stato contato, OCHS e privo di celle è stato utilizzato come controllo negativo.
Analogamente alle cellule Hao, effetti su fibroblasti PDL sono stati determinati. I vetrini che sono stati inseriti in piastre da 24 pozzetti sono stati coperti con le sostanze di prova. fibroblasti PDL sono stati aggiunti ad una densità di 10.000 cellule /pozzetto. Le cellule sono state fissate e colorate per adesione e per esperimenti di proliferazione a 2 h, 4 h, 24 he 48 h con colorazione DAPI come descritto per le cellule HAO.
Determinazione effetto di sospensione di idrossido di calcio oleoso PDL fibroblasti e osteoblasti interazione con microrganismi
la concentrazione di 2 U (5 mg) OCHS stato selezionato e posto su ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti per esperimenti incentrati sull'interazione delle cellule ospiti con ceppi batterici.
cellule HAO e fibroblasti PDL rispettivamente sono state seminate nelle diapositive con e senza copertura di 2 U di OCHS. A. actinomycetemcomitans
Y4, così come la combinazione di P. gingivalis
ATCC 33277, sono stati aggiunti T. forsizia
ATCC 43037 e T. denticola
ATCC 35405. La carica batterica era sempre 10 6 per pozzetto. Le cellule Hao e fibroblasti PDL rispettivamente state fissate e colorate a 4 ore.
Statistica analisi
Fatta eccezione per la metodica antimicrobici (replica indipendenti) almeno sei esperimenti indipendenti sono state effettuate per gruppo. Più di due gruppi indipendenti sono stati confrontati con un ANOVA seguita da analisi post hoc LSD per il confronto con i controlli (l'attività di OCHS e dei suoi componenti sulle cellule Hao e fibroblasti PDL). L'analisi statistica è stata effettuata utilizzando il test t di Student per due campioni indipendenti (effetto di OCHS sulle cellule HAO interazione 'e PDL fibroblasti' di interazione con i batteri).
Risultati
grassa sospensione di idrossido di calcio non agisce
antibatterico i valori di MIC di oleum pedum e idrossido di calcio (i principali componenti di OCHS) sono riportati in Tabella 1. considerando pedum oleum non esercitava alcun effetto antibatterico, Ca (OH) 2 era inibitorio; i valori di MIC erano nel range di 6,25-25 mg /ml.Table 1 minime concentrazioni inibitorie dei componenti di OCHS (suina pedum oleum e idrossido di calcio) determinate dalla tecnica di diluizione micro-brodo
suina oleum-pedum
Ca (OH) 2
F. nucleatum
ATCC 25586
& gt; 20%
6,25 mg /ml
P. intermedia
ATCC 25611
& gt; 20%
6,25 mg /ml
P. gingivalis
ATCC 33277
& gt; 20%
12,5 mg /ml
P. gingivalis
M5-1-2
& gt; 20%
12,5 mg /ml
P. gingivalis
J430-1
& gt; 20%
25 mg /ml
P. gingivalis
Marl
& gt; 20%
25 mg /ml
T. forsizia
ATCC 43037
& gt; 20%
12,5 mg /ml
A. actinomycetemcomitans
Y4
& gt; 20%
12,5 mg /ml
A. actinomycetemcomitans
J1
& gt; 20%
12,5 mg /ml
A. actinomycetemcomitans
J2
& gt; 20%
12,5 mg /ml
A. actinomycetemcomitans
J7
& gt; 20%
25 mg /ml
C. retto
ATCC 33238
& gt; 20%
12,5 mg /ml
E. corrodens
ATCC 23834
& gt; 20%
50 mg /ml
E. nodatum
ATCC 33099
& gt; 20%
12,5 mg /ml
P. micra
ATCC 33270
& gt; 20%
25 mg /ml
C. gingivalis
ATCC 33624
& gt; 20%
12,5 mg /ml
Come indicato nei materiali e metodi, a causa della insolubilità OCHS, una tecnica di agar modificata è stata utilizzata per determinare un possibile effetto antimicrobico di OCHS. Questi esperimenti tuttavia non hanno rivelato alcuna zona inibizione da OCHS nei due concentrazioni testate. Gli esperimenti finali cultivating sospensioni batteriche in brodo nutriente sottolineato che OCHS non influenza la crescita di periodontopathogens in alcun modo. Né la crescita sopprimono né effetti promotori della crescita erano visibili; differenze ai controlli erano sempre al di sotto di 0,2 log 10 cfu (dati non riportati). Si deve notare che a causa della insolubilità OCHS, tubi contenevano due strati; uno dei OCHS e uno di brodo. Così solo i composti di interfaccia rilasciati da OCHS potrebbero interferire con i batteri.
Grassa sospensione di idrossido di calcio può favorire l'adesione degli osteoblasti e mineralizzazione ma non influenza l'adesione e la proliferazione dei fibroblasti PDL
aggiunta di OCHS promosso l'attaccamento delle cellule HAO . Dopo 2 h, 11.00 ± 4.90 cellule /mm 2 aderito a una superficie coperta con 2 U di OCHS. Utilizzando 3 U il valore era 11.67 ± 2.89 cellule /mm 2. Queste differenze erano significative rispetto al controllo, dove 6,57 ± 3,55 cellule HAO trovato per mm 2 sulla superficie. Dopo 4 ore, 20,33 ± 14,13 HAO cellule /mm 2 sono stati contati dopo la copertura con 1 U di OCHS e 18.11 ± 6.66 HAO cellule /mm 2 quando 3 U di OCHS sono stati utilizzati sia significativamente differente dai controlli ( 8.67 ± 3.50 cellule HAO /mm 2). proliferazione stimolata è stato trovato 48 ore dopo l'inizio gli esperimenti e la copertura con 1 U e 2 U di OCHS (1 U: 46.00 ± 13.11 HAO cellule /mm 2, 2 U: 46.67 ± 18.23 cellule HAO /mm 2 in confronto a controllare: 26.89 ± 7.25 cellule HAO /mm 2). In contrasto con la 1 U e 2 U di OCHS, l'alta concentrazione di 3 U significativamente inibito la proliferazione delle cellule HAO (13.44 ± 5.20 HAO cellule /mm 2). Una influenza del Ca utilizzato (OH) 2 concentrazione non è stato registrato. Copertura con oleum pedum è stato seguito da una diminuzione del numero di cellule 24 ore dopo l'aggiunta delle cellule. I risultati, tra cui valori significativi sono presentati nella Figura 1. Figura 1 allegato e la proliferazione di A) e B cellule HAO) fibroblasti PDL (media e deviazione standard) ciascuno dopo la copertura con diverse quantità di sospensione di idrossido di calcio oleosa (OCHS) e 1,5 mg Ca (OH) 2 e 3,0 mg pedum oleum (valori p rispetto ai controlli sono stati determinati mediante analisi post hoc LSD dopo ANOVA).
La differenziazione e la mineralizzazione delle cellule HAO è stato anche analizzato. In tutti gli esperimenti sono stati trovati solo le cellule HAO colorate positivamente per la fosfatasi alcalina. Senza aggiunta di OCHS, non mineralizzazione era presente sulla superficie. Quando la superficie è stata coperta con OCHS, mineralizzazione extracellulare di Hao era rilevabile dopo una settimana (5,57 ± 1,97% zona macchiata; Figura 2). La quantità non è cambiata significativamente dopo due settimane (4.12 ± 1.59%). Figura 2 cellule mineralizzazione macchiato di rosso alizarina una settimana dopo la semina cellule Hao. La mineralizzazione è visibile dal colore rosa (→), A), le cellule non trattate HAO, B) le cellule HAO seminato su OCHS.
Aggiunta di OCHS non ha avuto alcuna influenza significativa sulla attaccamento dei fibroblasti PDL. proliferazione ridotto è stato trovato 48 ore dopo l'inizio degli esperimenti e la copertura con 3 U di OCHS (13.22 ± 4.12 PDL fibroblasti /mm 2) rispetto ai controlli (33.89 ± 17.48 PDL fibroblasti /mm 2). Al contrario, Ca (OH) 2 stimolato la proliferazione dei fibroblasti PDL (53.44 ± 15.22 PDL fibroblasti /mm 2 rispetto ai valori di controllo al momento-point 48 h (Figura 1).
I risultati suggerito un possibile effetto citotossico. pertanto, le cellule Hao e fibroblasti PDL sono state seminate su vetrini rivestiti con le sostanze di prova come descritto sopra. le cellule sono state incubate per 4 he 48 h. Successivamente la percentuale di cellule vitali è stata determinata mediante test di esclusione del trypan blue.
Una notevole percentuale di cellule morte si trovava sempre dopo pre-trattamento con 1,5 mg di Ca (OH) 2 rispetto ai controlli (ogni p & lt; 0,001). La vitalità delle cellule determinati dal test di esclusione del trypan cambiato leggermente dopo pretrattamento con OCHS, la differenza di controlli non trattati è stata significativa per i fibroblasti PDL 4 ore dopo l'inizio esperimenti (Figura 3). Figura 3 percentuale di una valida) cellule Hao e B) fibroblasti PDL (media e deviazione standard), dopo la copertura con diverse quantità di oleoso sospensione di idrossido di calcio (OCHS) e 1,5 mg di Ca (OH) 2 e 3,0 mg pedum oleum determinato dal test di esclusione del trypan (p-valori rispetto ai controlli sono stati determinati mediante analisi post hoc LSD dopo ANOVA).
batteri non interferiscono con l'effetto di sospensione di idrossido di calcio oleoso adesione e proliferazione degli osteoblasti e fibroblasti PDL
L'aggiunta di batteri non modificare sensibilmente il numero di cellule HAO aderito quando i vetrini sono stati coperti con 2 U di OCHS. Se A. actinomycetemcomitans
Y4 era presente, con un incremento di cellule HAO con 2 U di OCHS (25,08 ± 10,04 HAO cellule /mm 2) era ancora significativo rispetto a quelli senza OCHS (controlli). Sorprendentemente, l'aggiunta di batteri potenziato il numero di cellule HAO allegato (A. actinomycetemcomitans
Y4: 16.00 ± 4.44 cellule HAO /mm 2, P. gingivalis
, T. forsizia
, T. denticola
in miscela: 14.56 ± 4.07 cellule HAO /mm 2) essendo significativamente più alto rispetto ai controlli (10,87 ± 8,43 HAO cellule /mm 2). Il contatto con i batteri non ha influenzato in modo significativo il numero di fibroblasti PDL allegate (figura 4). Figura 4 Attachment di A) cellule Hao e B) fibroblasti PDL (media ± SD) 4 h dopo riempimento con e senza sospensione oleosa idrossido di calcio (OCHS) e l'aggiunta di A. actinomycetemcomitans Y4 così come la combinazione di P. gingivalis ATCC 33277 , T. forsizia ATCC 43037, T. denticola ATCC 35405 (valori p rispetto ai controlli e senza OCHS rispettivamente ciascuno sono stati determinati dai test t).
Discussione e conclusioni
OCHS è una sospensione oleosa che contiene Ca (OH) 2, come componente attivo. Altri componenti sono i Tauri oleum pedum prodotto sinteticamente, un materiale di supporto contenente trigliceridi tra cui l'acido olio, acido palmitin, acido hexadecen e l'album vaselinum.
Un effetto antibatterico da OCHS non è stata osservata anche in concentrazioni estremamente alte eseguendo una modifica di agar test. Solo uno studio precedente ha riportato sugli effetti del OCHS su periodontopathogens. In questo studio, OCHS agito inibitoria su A. actinomycetemcomitans
ceppo ATCC 33384 (sierotipo C), ma nessun effetto antibatterico è stato osservato a seguito della cultura di A. actinomycetemcomitans
ceppo ATCC 43718 (sierotipo b) con OCHS [9]. Abbiamo anche incluso nel nostro studio un isolato clinico appartenente al sierotipo C. In contrasto con i risultati descritti in precedenza [9], non abbiamo osservato alcun effetto antibatterico seguente applicazione con OCHS nel presente studio su entrambi i ceppi testati di A. actinomycetemcomitans
.
Causa l'insolubilità del materiale, abbiamo sono solo in grado di determinare le concentrazioni inibitorie minime di singoli componenti OCHS mediante una tecnica di diluizione micro-brodo. È stato osservato che, sebbene oleum pedum non aveva alcuna proprietà antibatteriche, l'uso di idrossido di calcio in concentrazioni elevate come quelli presenti in OCHS agito come inibizione della crescita. L'idrossido di calcio è ampiamente utilizzato nel trattamento endodontico e in evidenza in vitro dimostra che sopprime la crescita di Candida albicans
[28] e di alcuni altri batteri che crescono in condizioni anaerobiche [29], anche se limitata efficacia antimicrobica si è tradotto in vivo a seguito dell'analisi dei canali radicolari posta -Trattamento [30, 31]. Nei nostri saggi in vitro, in contrasto con idrossido di calcio, OCHS non ha avuto alcun effetto antibatterico che può suggerire un effetto antagonista degli altri componenti di OCHS di idrossido di calcio. A causa della natura della terapia parodontale, batteri associati con periodontite dovrebbero essere eliminate o ridotte in qualsiasi modalità di trattamento. L'attività antimicrobica mancante OCHS suggerisce l'uso aggiuntivo di un antimicrobico, come clorexidina. Per queste ragioni, l'aggiunta di 0,4% CHX ad una pasta di idrossido di calcio non ha influenzato la biologia delle cellule osteoblastiche in vivo [32].
In questo studio, abbiamo studiato gli effetti del OCHS su HAO sull'attaccamento e la proliferazione cellulare. I nostri risultati hanno dimostrato un aumento comportamento delle cellule in seguito la cultura con OCHS e sensibilità la concentrazione dimostrata. Bassa a moderata concentrazioni di OCHS agito chiaramente stimolante, mentre l'applicazione con una concentrazione di 3U (7,5 mg) ha dimostrato in parte i risultati negativi. Per ritardare il rilascio di Ca (OH) 2, OCHS contiene un'alta percentuale di oleum pedum. Abbiamo studiato HAO conta coltivate in presenza di oleum pedum e abbiamo trovato una riduzione del comportamento delle cellule follwing sua applicazione. Oleum pedum sembra contrastare l'attività stimolante di Ca (OH) 2. In un modello animale utilizzando Open capsule Teflon, OCHS inibita la formazione di osso e di un riassorbimento attivo di OCHS non è stato osservato [20]. Si può ipotizzare che le proprietà degradabili mancanti sono certamente dal pedum oleum e un effetto più pronunciato sembra essere osservata con concentrazioni crescenti. Una seconda spiegazione logica potrebbe essere dovuto alla citotossicità di OCHS. Anche se oleum pedum previene la citotossicità di Ca (OH) 2, effetti tossici in una certa misura sono stati visti quando OCHS è stato utilizzato a concentrazioni elevate. Questa evidente sensibilità della concentrazione utilizzata potrebbe in parte spiegare i diversi risultati riportati negli studi clinici e animali. Di conseguenza, seguendo i nostri primi risultati serie di esperimenti, una concentrazione moderata è stato scelto per esperimenti in corso sulla base dei suoi risultati positivi. Utilizzando questa concentrazione, un aumento degli osteoblasti mineralizzazione è stata trovata 1 - 2 settimane dopo la semina con terreni di coltura contenenti OCHS. Recentemente è stato dimostrato che Ca (OH) 2 è in grado di stimolare l'espressione di mRNA di sialoproteina ossea e Runx2 [33]. Runx2 è un fattore di trascrizione essenziale per la differenziazione degli osteoblasti [34] e sialoproteina osso è un indicatore in ritardo per la differenziazione degli osteoblasti trovato durante il processo di mineralizzazione degli osteoblasti [35].
Nonostante gli effetti stimolatori di OCHS sugli osteoblasti, OCHS non esercita alcuna effetto positivo sulla attaccamento o la proliferazione dei fibroblasti PDL. Allo stesso modo per i nostri esperimenti Hao, la più alta concentrazione utilizzata di OCHS anche ridotto la proliferazione dei fibroblasti PDL dopo 48 ore. Proliferazione dei fibroblasti PDL è stata indotta da Ca (OH) 2 come descritto di recente; ma in contrasto con i nostri risultati, OCHS ha avuto anche un effetto stimolante sulla proliferazione in questo studio [36]. In uno studio simile [14] questi autori hanno scoperto alta attaccamento dei fibroblasti PDL su superfici radicolari OCHS trattati. La ricerca futura per determinare i meccanismi che influenzano l'attaccamento delle cellule via integrina vincolante e dei suoi meccanismi molecolari a valle in cellule ospiti (ad es
. percorsi cellulari) dovrebbe indagato.
seguito di prove sperimentali di OCHS con cellule dal parodonto, un co sistema -Culture stato progettato per determinare l'influenza di OCHS sulle cellule esposte agli agenti patogeni parodontali contemporaneamente per simulare un ambiente clinico. L'esposizione delle cellule Hao e fibroblasti PDL periodontopathogenic batteri non influenzano negativamente l'effetto promotore di OCHS sull'attaccamento e la proliferazione di queste cellule. Pertanto, i risultati di questo esperimento dimostrano l'uso potenziale di OCHS anche in presenza di patogeni parodontali senza alterare il potenziale beneficio da OCHS. Sorprendentemente, l'aggiunta di batteri migliorato il numero di cellule HAO allegate. Questo risultato deve essere preso con cautela e potrebbe essere associato con le condizioni di coltura in vitro. L'effetto è stato particolarmente pronunciato quando A. actinomycetemcomitans
è stato utilizzato. Il potenziale citotossico dei periodontopathogens è ben nota. Gingipains sono responsabili della maggior parte delle attività proteolitica di P. gingivalis
[37] e sono in grado di inibire la proliferazione degli osteoblasti provocando arresto G1 presto nel ciclo cellulare [38].
