sperimentale
Abstract
sfondo
gengivale crescita eccessiva (GO) è un lato comune effetto dell'uso cronico di ciclosporina (CsA), un immunosoppressore ampiamente usato per prevenire il rigetto nei pazienti trapiantati. Recenti studi hanno riportato elevati livelli di citochine specifiche nel tessuto gengivale proliferazione, in particolare TGF-beta, suggerendo che questo fattore di crescita gioca un ruolo nell'accumulo di materiali di matrice extracellulare. È stato anche dimostrato l'efficacia di azitromicina, un antibiotico macrolide, nella regressione di questo effetto collaterale indesiderato.
Metodi
In questo studio, abbiamo creato un modello sperimentale per valutare l'effetto terapeutico di roxitromicina in GO e l'espressione del fattore di crescita trasformante beta (TGF-beta2) mediante immunoistochimica. Abbiamo utilizzato quattro gruppi di ratti per un totale di 32 persone. GO è stata indotta nel corso di cinque settimane e il trattamento farmaco è stato dato il 6 settimane come segue: gruppo 1 ha ricevuto soluzione salina; gruppo 2 ha ricevuto CsA ed è stato trattato con soluzione salina il 6 settimane; gruppo 3 ha ricevuto CSA e, il 6 settimana, ampicillina; e il gruppo 4 ha ricevuto CsA per 5 settimane e, 6a settimana, è stato trattato con roxitromicina
. Risultati
I risultati hanno dimostrato che il trattamento roxitromicina era efficace nel ridurre GO ciclosporina-indotta nei ratti. Sia epiteliali e tessuto connettivo mostrato una diminuzione di spessore ed una significativa riduzione dell'espressione di TGF-beta2, con un minor numero di fibroblasti, riduzione delle aree fibrotiche e diminuzione infiltrato infiammatorio.
Conclusione
I dati attuali suggeriscono che la down-regolazione dell'espressione di TGF-beta2 può essere un importante meccanismo d'azione con cui roxitromicina inibisce GO
materiale supplementare elettronica
La versione online di questo articolo (doi:.. 10 1186 /1472-6831-9 -33) contiene materiale supplementare, che è disponibile per gli utenti autorizzati.
Sfondo
gengivale crescita eccessiva (GO) è un comune effetto collaterale di alcuni farmaci, come la fenitoina, calcio-antagonisti e ciclosporina [1, 2].
Ciclosporina (CsA) è stato ampiamente utilizzato per prevenire il rigetto di trapianto di organi e per il trattamento di varie immunodiseases [2]. Si sopprime selettivamente la funzione delle cellule T helper e modula la rete di citochine infiammatorie. Tuttavia, CsA è associata a diversi effetti negativi, come nefrotossicità, epatotossicità, irsutismo e crescita eccessiva gengivale (GO) [1, 3, 4]. La prevalenza media di pazienti sottoposti a trapianto dentati che sviluppano ciclosporina indotta GO è intorno al 30%, con variazione tra il 10 e l'85% [5-9]. Quando sono associati con altri farmaci, come antiipertensivi bloccanti dei canali del calcio, questa prevalenza aumenta, così come la gravità della complicazione, e, di conseguenza, il rischio [10-13].
Fibrosi, una delle scoperta più importante GO , è il risultato di una serie di segnali biochimici da molti tipi di cellule, comprese le cellule infiammatorie e fibroblasti, che stimolano la proliferazione dei fibroblasti e la produzione di matrice extracellulare [14]. Il fattore di crescita trasformante beta (TGF-beta) è una famiglia multifunzionale di citochine presenti in questo percorso e ci sono tre isoforme di mammiferi di TGF-beta (TGF-beta1, TGF-beta2 e TGF-beta3), che sono strutturalmente simili [15 ]. L'aumento dei livelli di TGF-beta1 sono stati associati a fibrosi renale ciclosporina-indotta [16]. La maggior parte degli studi sostengono a favore di TGF-beta1 in crescita eccessiva gengivale CsA-indotta. Tuttavia alcuni numero di studi ha studiato l'espressione del TGF-beta2 in questa condizione patologica [15, 17]. TGF-beta2 è considerata una citochina immunosoppressiva modulata da ciclosporina che svolge un ruolo centrale durante la formazione di fibrosi e reazione infiammatoria [18-20]. Recentemente, è stato dimostrato che roxitromicina ha un effetto inibitorio sulla produzione di TGF-βbeta dalle cellule mesangiali umane, e può essere efficace nel trattamento della glomerulosclerosi [21]. Pertanto, questo antibiotico macrolide con caratteristiche simili di azitromicina, è noto per avere anti-infiammatori, immunomodulatori e del tessuto effetti riparatori Oltre alla sua attività batteriostatica può essere un'alternativa terapeutica nel trattamento di proliferazione gengivale. Recentemente, abbiamo pubblicato uno studio con risultati interessanti nei pazienti trapiantati di rene in cui la crescita eccessiva gengivale è stato ridotto dopo il trattamento roxitromicina [22]. In questo studio abbiamo valutato l'effetto di roxitromicina su GO nei ratti trattati con ciclosporina. I nostri risultati indicano che roxitromicina riduce andare e down-regola l'espressione di TGF-beta2 nei tessuti gengivali.
Metodi
Trentadue 6 settimane di età ratti maschi Wistar (Rattus novergicus albinun
), del peso di 100 a 150 g. sono stati selezionati in modo casuale e divisi equamente in quattro gruppi di otto animali ciascuno. I ratti di controllo (gruppo 1) sono stati quotidianamente iniettati per via sottocutanea con soluzione salina. I topi sperimentali (gruppo 2) sono stati trattati con CsA iniettati per via sottocutanea in una dose giornaliera di 10 mg /kg per sei settimane e, all'inizio della 6a settimana, sono stati iniettati per via sottocutanea con soluzione salina. Gruppo 3 era simile al gruppo 2, ma nell'ultima settimana è stato trattato con 50 mg /kg ampicillina (un antibiotico ampiamente utilizzato in infezioni parodontali) tramite alimentazione gastrica. Nel gruppo 4, gli animali hanno ricevuto ciclosporina al giorno per 6 settimane e l'ultima settimana sono stati trattati con 40 mg /kg Roxithromycin per l'alimentazione gastrica. I ratti sono stati pesati settimanalmente e il dosaggio è stato adeguato di conseguenza. . La dieta e l'acqua potabile sono stati dati ad libitum
durante l'esperimento
macroscopia analisi
Al termine del periodo sperimentale, tutti gli animali sono stati sacrificati per mezzo di una dose eccessiva di anestesia (Kensol
® - 10 mg /kg e Vetanarcol ® - 90 mg /kg). Per studiare le alterazioni gengivali nel corso del tempo, modelli in gesso sono state fatte da impronte in silicone della regione mascellare anteriore. La larghezza buccale-linguale superiore e larghezza mesio-distale del segmento anteriore del mascellare superiore sono stati misurati utilizzando un calibro digitale.
Istopatologia e Istomorfometria
Tutti i campioni gengivali ottenuti sono stati fissati in formalina 10% tamponata (pH 7) per almeno 24 ore. Dopo la fissazione, i campioni sono stati gradualmente disidratati in concentrazioni crescenti di etanolo (70% al 100%), eliminato in xilene, bagnato e inclusi in paraffina, secondo metodi istologiche di routine.
I frammenti in paraffina sono stati tagliati con una " 820 "microtomo Spence e 4 micron sezioni spesse sono stati ottenuti. Tutti i campioni gengivali sono stati inclusi in paraffina con lo stesso orientamento. Le sezioni analizzati mostravano sempre l'epitelio, tessuto connettivo e muscolare. Le misurazioni sono state eseguite histometry dal momento che il ephitelium fino a quando il tessuto muscolare. I vetrini istologici sono stati tenuti in un incubatore a secco, e quindi le sezioni sono state colorate con ematossilina ed eosina per l'analisi istologica. Istomorfometria è stata effettuata utilizzando le immagini acquisite e valutate da un sistema di acquisizione delle immagini computerizzato Axion Vision (Zeiss, Berlino, Germania). Le immagini sono state catturate da quattro campi microscopici scelti a caso per ogni diapositiva istologica, utilizzando la macchina fotografica digitale (400 × e 100 × ingrandimenti) di un microscopio Axiostar più (Zeiss, Berlino, Germania) e il numero di cellule TGF-betapositive stati contati.
Le immagini sono state memorizzate e sottoposti ad un conteggio di cellule infiammatorie e di tutte le cellule fibroblasto-simili. misure lineari sono stati fatti per ottenere la maggiore diametro di epiteliale e del tessuto connettivo gengivale, utilizzando la marcatura digitale.
immunoistochimica
sezioni di paraffina (4 micron di spessore) di tessuto fissato in formalina sono state ottenute a diverse profondità da ogni blocco di tessuto. La presenza di proteine TGF-beta2 nei campioni gengivali è stata studiata in sezioni in paraffina utilizzando la procedura del complesso avidina-biotina-perossidasi (ABC) con un ulteriore passo per il recupero dell'antigene con una soluzione di recupero (Dakopatts, Copenhagen, Danimarca). In breve, le sezioni sono state incubate con anticorpo policlonale di coniglio anticorpo anti-TGF-beta2 diluito 1/20 e incubate per un'ora a temperatura ambiente (Santa Cruz, Santa Cruz, USA) seguito da un anticorpo di capra anti-IgG di coniglio biotinilato (Dakopatts, Copenhagen, Danimarca). Controlli per la procedura ABC state eseguite sostituendo anticorpo anti-TGF-beta2 con siero di coniglio normale, o omettendo l'anticorpo anti-TGF-beta2. Le sezioni sono state analizzate tramite microscopia ottica, e microfotografie sono state eseguite con un microscopio Zeiss Axiostar (Zeiss, Germania). Il numero di TGF-beta2 cellule immunoreattive per campo microscopico (400 × ingrandimenti) è stato contato nel tessuto connettivo.
Analisi statistica
I dati sono stati espressi come media e deviazione standard. ANOVA è stata utilizzata per la valutazione statistica e il test post-hoc di Bonferroni è stato utilizzato dopo ANOVA. La larghezza della mucosa gengivale, il numero di cellule infiammatorie, tutte le cellule fibroblasto-simili e le cellule immunoreattive TGF-beta2 sono stati confrontati tra i gruppi utilizzando di Student t-test
. Il livello di significatività è stato adottato p
& lt; 0.05.
Il manoscritto è stato eseguito con l'approvazione del comitato etico nella ricerca sperimentale su animali da Università Federale di Juiz de Fora /Brasile (protocollo n ° 039/2005).
Risultati in tutte le nazioni ratti trattati ciclosporina presentato GO che era evidente in tutte le localizzazioni gengivali. Grafico 1 mostra misurazioni macroscopiche della larghezza buccale-linguale e larghezza mesio-distale (p & lt; 0,05). L'analisi macroscopica evidenziato una significativa riduzione della larghezza buccale-linguale e larghezza mesio-distale nei ratti trattati Roxithromycin (gruppo 4) rispetto al gruppo 2 e 3 (grafico 1) (p & lt; 0,05). L'analisi istopatologica ha rivelato che GO è il risultato dell'ampliamento epiteliale e dei tessuti connettivi (figure 1A, 1B, 1C, 1D). Un acanthosis moderata è stato osservato in animali gruppi 2, 3 e 4. Nessuna differenza statistica è stata osservata rispetto allo spessore dell'epitelio rilevato in campioni gengivali ottenuti dai gruppi positivi di controllo con i gruppi trattati. Un grave iperplasia delle fibre di collagene sono stati osservati nei campioni gengivali ottenuti dai gruppi 2 e 3. Tuttavia, lo studio microscopico evidenziato una riduzione delle fibre collagene nei campioni gengivali dei ratti trattati rispetto ai campioni gengivali dei ratti di controllo. Non sono aree fibrotiche sono stati osservati in campioni gengivali del gruppo 1 (gruppo di controllo negativo). La fibrosi estesa è un riscontro comune nei campioni gengivali da gruppi 2 e 3, ma un limitato numero di aree fibrotiche sono stati osservati in tessuto gengivale di Roxithromycin trattati ratti (figura 2). misurazioni diametro dei tessuti epiteliali e connettivo sono stati ottenuti (figura 3). Le misure osservati nei ratti trattati Roxithromycin (gruppo 4) erano statisticamente inferiori a quelli osservati nei gruppi di controllo GO positivi (gruppo 2 e del gruppo 3). L'analisi istomorfometrica anche dimostrato che gli animali trattati con roxitromicina presentato un minor numero di fibroblasti per campo microscopico (figura 4). L'identificazione dei fibroblasti, in base a criteri morfologici, è stata fatta da due ricercatori differenti. Infine, un minor numero di cellule infiammatorie è stata osservata in campioni gengivali ottenuti dal gruppo trattato roxitromicina rispetto gruppo 2 e 3 (figura 5). colorazione citoplasmatica per TGF-beta2 è stato rilevato nella maggior parte dei tipi di cellule del tessuto connettivo. TGF-beta2 è stata espressa nel tessuto connettivo cellule infiammatorie, fibroblasti e cellule endoteliali (figura 6). La maggior parte dei fibroblasti e cellule endoteliali erano TGF-beta2 positivo e ha mostrato un pattern di colorazione variabile, generalmente debole o scuro positivo (figura 6). Analisi immunoistochimica ha mostrato un numero inferiore di cellule TGF-beta2 positivi (figura 7) - riconosciuti morfologicamente come fibroblasti, cellule endoteliali e cellule infiammatorie nei campioni di tessuto connettivo dalla roxitromicina ratti trattati rispetto GO ratti positivi controlli (gruppo 2 e gruppo 3 ) (figura 7). Nessuna differenza significativa è stata rilevata rispetto al numero di cellule positive TGF-beta2 in campioni gengivali ottenuti dal gruppo 1 e gruppo 4 (figura 7). Figura 1 misurazioni macroscopiche delle regioni mascellari vestibolo-linguale e mesio-distale. Risultati espressi come media e il livello di significatività statistica per analizzare sia p & lt; 0.05. G1 (n = 8 animali) - gruppo di controllo negativo - la somministrazione di soluzione salina. G2 (n = 8 animali) - gruppo di controllo positivo - somministrazione di CsA + soluzione fisiologica. G3 (n = 8 animali) - controllo positivo gruppo- - somministrazione di CsA + AMP. G4 (n = 8 animali) - gruppo trattato - somministrazione di CsA + ROX
Figura 2 campi microscopici rappresentativi.. A: tessuto connettivo normale nel gruppo 1 (controllo negativo); B-C: la fibrosi estesa nei gruppi 2 e 3 (controlli positivi); D: Poche zone con fibrosi nel gruppo 4 (gruppo trattato). magnificenza originale 400 ×.
Figura 3 Misure di mucosa gengivale (epitelio e lamina propria). I risultati espressi come media (p & lt; 0,05). G1 (n = 8 animali) - gruppo di controllo negativo - la somministrazione di soluzione salina. G2 (n = 8 animali) - gruppo di controllo positivo - somministrazione di CsA + soluzione fisiologica. G3 (n = 8 animali) - controllo positivo gruppo- - somministrazione di CsA + AMP. gruppo trattato - - G4 (n = 8 animali). somministrazione di CsA + ROX
Figura 4 Numero di fibroblasti per campi microscopici. Cinque campi microscopici con 400 × ingrandimenti sono stati studiati per vetrini istologici. I risultati espressi come media (p & lt; 0,05). G1 (n = 8 animali) - gruppo di controllo negativo - la somministrazione di soluzione salina. G2 (n = 8 animali) - gruppo di controllo positivo - somministrazione di CsA + soluzione fisiologica. G3 (n = 8 animali) - controllo positivo gruppo- - somministrazione di CsA + AMP. G4 (n = 8 animali) - gruppo trattato - somministrazione di CsA + ROX
Figura 5 Numero di cellule infiammatorie per campi microscopici.. Cinque campi microscopici con 400 × ingrandimenti sono stati studiati per vetrini istologici. I risultati espressi come media ± deviazione standard (p & lt; 0,05). G1 (n = 8 animali) - gruppo di controllo negativo - la somministrazione di soluzione salina. G2 (n = 8 animali) - gruppo di controllo positivo - somministrazione di CsA + soluzione fisiologica. G3 (n = 8 animali) - controllo positivo gruppo- - somministrazione di CsA + AMP. G4 (n = 8 animali) - gruppo trattato - somministrazione di CsA + ROX
Figura 6 campioni rappresentativi indicato elevata espressione di TGF-beta2 nelle cellule del tessuto connettivo (gruppi 2 e 3); C: Luce TGF-beta2 cellule colorate in gruppo 4. Red Arrows - cellule colorazione negativa. Le frecce blu: cellule colorazione positiva. magnificenza originale 400 ×.
Figura 7 Numero delle cellule colorazione positiva di TGF-beta2 nel tessuto connettivo per campo microscopico. Cinque campi microscopici con 400 × ingrandimenti sono stati studiati per vetrini istologici. I risultati espressi come media media ± DS (p & lt; 0,05). G1 (n = 8 animali) - gruppo di controllo negativo - la somministrazione di soluzione salina. G2 (n = 8 animali) - gruppo di controllo positivo - somministrazione di CsA + soluzione fisiologica. G3 (n = 8 animali) - controllo positivo gruppo- - somministrazione di CsA + AMP. gruppo trattato - - G4 (n = 8 animali). somministrazione di CsA + ROX
discussione
Ciclosporina (CsA) è una idrofobica polipeptide ciclico neutro composto da undici amminoacidi e realizzato dal fungo Tolypocladium inflatuns gams
. Esso agisce specificatamente nel sopprimere la risposta immunitaria mediata dalle cellule T. Si passa attraverso biotrasformazione nel fegato, causando 14 prodotti metabolici, di cui il 90% viene escreto nelle feci e il 10% viene eliminato dai reni [23]
. Crescita eccessiva gengivale è uno degli effetti collaterali causati dall'uso cronico di ciclosporina (CsA), che viene impiegato per prevenire il rigetto di organi trapiantati e per trattare diverse malattie autoimmuni, come il diabete mellito, malattia di Behcet, psoriasi, sclerosi multipla, lichen planus, lupus eritematoso sistemico, pemfigoide bolloso, artrite reumatoide, miastenia gravis , uveite, e vari glomerulopatie livelli elevati [3, 24, 25]
. diversi studi hanno dimostrato di citochine specifiche nel tessuto gengivale crescita eccessiva, soprattutto TGF-beta, un mediatore infiammatorio multifunzionale, il che suggerisce che questo fattore di crescita gioca un ruolo l'accumulo della matrice extracellulare [14, 25, 26], comprendenti le proteine collagene [27, 28]. Le isoforme di TGF-beta possono essere espresse con maggior parte delle cellule, comprese le cellule infiammatorie gengivali, cellule endoteliali e fibroblasti [17]. Elevata gengivale TGF-beta1 e TGF-beta2 sono stati suggeriti da studio immunoistochimico sul fenitoina e nifedipina GO-indotta [29]. ed i nostri dati indicano livelli di espressione TGF-beta2 su GO ciclosporina indotta elevati.
GO trattamento include la rimozione della placca batterica, il mantenimento di un'adeguata igiene orale, e comprende anche procedure invasive, come la gengivectomia. Il trattamento per questa complicanza, fino a poco tempo, era solo chirurgica. Attualmente, sono stati condotti diversi studi per determinare l'effetto del trattamento antibiotico sulla regressione della crescita eccessiva gengivale. Nel 1995, Wahlstrom, Zamora e Teichmann coincidenza utilizzati Azitromicina - un antibiotico sintetico semi, derivato dal eritromicina macrolide - per trattare le infezioni delle vie respiratorie in due pazienti sottoposti a trapianto renale che avevano indotto ciclosporina GO. Essi hanno osservato riduzione gengivale dopo l'uso. Il trattamento giornaliero con 500 mg per cinque giorni è semplice, poco costoso, conservatore, rapidamente efficace, ed evita la chirurgia gengivale. Esso agisce principalmente contro i batteri gram-positivi e negativi, ha rapido assorbimento per via orale, non altera i livelli sierici di ciclosporina o livelli di creatinina. Azitromicina è ben tollerato e associato un efficiente programma di igiene orale indurre una riduzione eccessiva gengivale [28], ma può produrre effetti collaterali, come la diarrea, dolori addominali, nausea e vomito [28-33].
Recentemente, abbiamo usato roxitromicina in quattro pazienti con trapianto renale ed i risultati suggeriscono che roxitromicina può essere uno strumento terapeutico importante utilizzato per ridurre GO ciclosporina-indotta [22]. Yamabe et al. (2006) suggerisce che l'uso di roxitromicina ha un effetto inibitorio sulla produzione di TGF-beta da cellule mesangiali umane, e può essere efficace nel trattamento di glomerulosclerosi. I meccanismi che roxitromicina produzione di TGF-beta inibito non sono chiari, ma in questo studio il farmaco non inibiscono l'attivazione della tirosina chinasi e MAP chinasi dalla trombina. Roxithromycin soppressa la traslocazione trombina indotta di proteine p65 NF-kB nel nucleo. Si suggerisce che l'attivazione di NF-kB regola la produzione di TGF-beta, quindi ROX ha inibito la produzione di TGF-beta tramite l'inibizione di NF-kB.
Conclusione
Nel presente studio, i risultati hanno dimostrato che il trattamento era roxitromicina efficace per ridurre GO ciclosporina-indotta nei ratti. Entrambi i tessuti epiteliali e connettivali mostrato una diminuzione di spessore in ratti trattati Roxithromycin in confronto con gli animali del gruppo di controllo. Inoltre, la riduzione significativa TGF- espressione beta2 in ratti Roxithromycin trattato è stato associato con un minor numero di fibroblasti, con riduzione delle aree fibrotiche e diminuzione infiltrato infiammatorio. Nel loro insieme, i nostri dati suggeriscono che la down-regolazione dell'espressione di TGF-beta2 può essere un importante meccanismo di azione con cui roxitromicina inibisce GO
Abbreviazioni
AMP:.
Ampicillina
CsA:
ciclosporina
GO:
crescita eccessiva gengivale
MAPPA quinase:
proteine quinase actived da mithogen
NF-kB:
fattore nucleare kappa B
ROX:
Roxithromycin
TGF-beta1:
fattore di crescita trasformante beta 1
TGF-beta2:
fattore di crescita trasformante beta 2
UFJF:
Università federale di Juiz de Fora
Dichiarazioni
Ringraziamenti
sostegno finanziario: FAPEMIG - Rede Mineira de Toxicologia; Rede Mineira de Bioterismo
autori fascicoli presentati originali per
di seguito sono riportati i link ai degli autori fascicoli presentati originali per immagini. 'file originale per la figura 1 12903_2008_142_MOESM2_ESM.jpeg Autori 12903_2008_142_MOESM1_ESM.jpeg autori file originale per la figura 2 12903_2008_142_MOESM3_ESM.jpeg Autori file originale per la figura 3 12903_2008_142_MOESM4_ESM.jpeg Autori file originale per il file originale figura 4 12903_2008_142_MOESM5_ESM.jpeg degli autori per la figura 5 'file originale per la figura 6 12903_2008_142_MOESM7_ESM.jpeg autori 12903_2008_142_MOESM6_ESM.jpeg autori file originale per la figura 7 interessi in competizione
Gli autori dichiarano di non avere interessi in gioco.
autori contributi
SC sono stati coinvolti nella stesura il manoscritto, l'acquisizione e l'analisi dei dati e effettuate l'immunoistochimica. MB partecipato alla progettazione dello studio e coordinamento, come eseguita l'analisi statistica. analisi BV e l'interpretazione dei dati. IM ha contribuito in fase sperimentale, che induce la crescita eccessiva gengivale. LV ha effettuato l'immunoistochimica. FA partecipato alla progettazione dello studio e coordinamento e hanno dato l'approvazione finale della versione da pubblicare. Tutti gli autori hanno letto e approvato la versione finale del manoscritto.
