Abstract
sfondo
Un certo numero di malattie orali, tra parodontite, derivare da microbica biofilm e sono associati con una maggiore resistenza agli antimicrobici. Nonostante l'ampio uso di collutori essere utilizzato come misure aggiuntiva ai controllare questi biofilm, il loro uso prolungato non è raccomandato a causa di vari effetti collaterali. Pertanto, alternative antimicrobici ad ampio spettro che riducono al minimo questi effetti sono molto richiesti. Carboidrati derivato dell'acido fulvico (CHD-FA) è un acido organico che ha già dimostrato di essere igienizzante contro la Candida albicans
biofilm, di conseguenza, gli obiettivi di questo studio erano di valutare l'attività antibatterica di CHD-FA contro i biofilm per via orale e derivati per indagare gli effetti biologici adiuvanti.
Metodi
concentrazione minima inibitoria sono stati valutati per CHD-FA e clorexidina (CHX) contro una serie di batteri orali che utilizzano test microdiluizione standardizzato per planctonici e sessili. microscopia elettronica a scansione è stato anche utilizzato per visualizzare i cambiamenti di biofilm orali dopo il trattamento antimicrobico. La citotossicità di questi composti è stata valutata contro le cellule epiteliali orali, e l'effetto di CHD-FA sui marcatori infiammatori accoglienza è stata valutata misurando mRNA e l'espressione della proteina.
Risultati
CHD-FA è stato molto attivo contro tutti i batteri orali testato, compresi Porphyromonas gingivalis
, con una concentrazione minima inibente sessile del 0,5%. Questa concentrazione è stato mostrato per uccidere biofilm multispecie di circa il 90%, livelli comparabili a quella di clorexidina (CHX). In un modello di colture cellulari di mammifero, il pretrattamento delle cellule epiteliali con tamponata CHD-FA è stato dimostrato che significativamente down-regolare mediatori infiammatori chiave, tra cui l'interleuchina-8 (IL-8), dopo stimolazione con un biofilm multispecie.
Conclusioni
complesso, CHD-FA ha dimostrato di possedere un ampio spettro di attività antibatterica, con una funzione supplementare di poter down-regolare l'infiammazione. Queste proprietà offrono uno spettro interessante di funzione da un composto di origine naturale, che potrebbe essere utilizzato come una strategia di trattamento topico alternativa a malattie biofilm orali. Ulteriori studi in vitro e in vivo
sono necessari per determinare il meccanismo preciso con cui CHD-FA modula la risposta immunitaria dell'ospite.
Parole
Fulvic acido clorexidina biofilm antibatterico parodontite Infiammazione elettronico materiale supplementare
la versione online di questo articolo (doi:. 10 1186 /1472-6831-13-47). contiene materiale supplementare, che è disponibile per gli utenti autorizzati
Sfondo
carie dentale, gengiviti e parodontiti sono il maggior parte delle malattie microbiche comuni del cavo orale, con la maggior parte associata con un biofilm polimicrobica [1, 2]. Biofilm sono una raccolta di microrganismi multicellulari attaccati l'uno all'altro o su una superficie, e sono incapsulate da uno strato protettivo di matrice extracellulare (ECM) [3]. I biofilm sono di maggiore importanza clinica rispetto ai loro omologhi planctonici libero di fluttuare a causa della loro innata capacità di resistere di terapia e di accoglienza difese antimicrobiche. Ciò è dovuto alla produzione estensiva ECM e altri fattori quali l'aumento estrusione di antimicrobici attraverso l'attività della pompa di efflusso aumentata [3, 4].
Collutori antimicrobici sono una delle principali strategie terapeutiche e preventive attualmente utilizzati nella gestione del biofilm orale malattie, delle quali clorexidina (CHX) è ampiamente accettata come il 'gold standard' [5]. Questo agente antisettico ha un'attività superiore ai suoi comparatori, ed è sia Cidal e statico contro i microrganismi presenti nel biofilm orali con ruoli nella patogenesi della malattia orale. Inoltre, la sua sostantivita fornisce un'attività prolungata per la sua capacità di adsorbire sul pellicle trovato su superfici di smalto dei denti [6]. Tuttavia vari studi hanno dimostrato l'uso a lungo termine di CHX può non essere pratico in quanto è associato con colorazione dei denti e alterazioni del gusto [7, 8]. Inoltre, sono state descritte le recenti segnalazioni di eventi avversi, tra cui reazioni anafilattiche, a questo composto [9]. E 'stato anche dimostrato di recente di essere inefficace contro i biofilm cresciuti da isolati clinici [10].
La prevenzione e il trattamento delle malattie biofilm orali, come le malattie parodontali e infezioni delle mucose, possono beneficiare di un composto che ha la potenza di CHX con effetti collaterali minimi, ma suscita anche proprietà adiuvanti biologici, come alterazione delle vie infiammatorie, che sono chiaramente importante nella patogenesi della malattia biofilm orale [11, 12]. Un precedente studio ha dimostrato CHX è in grado di down-regolare mediatori infiammatori quando provocati con un stimoli batterici [13], anche se gli aspetti tossicologici di CHX può essere la ragione per la ridotta espressione. Abbiamo anche dimostrato il vantaggio di utilizzare agenti naturali nella gestione delle infezioni orali, in cui l'olio dell'albero del tè (TTO) è stato non solo non tossico, ma era in grado di smorzare la risposta immunitaria ad uno stimolo fungine [14]. Inoltre, il nostro gruppo ha precedentemente valutato l'attività antisettica di acido carboidrati di derivazione fulvico (CHD-FA), dove è stato dimostrato che il composto è stato altrettanto efficace contro la Candida albicans
cellule planctoniche e biofilm. Meccanicisticamente questo è stato identificato come un processo di rottura della membrana che non è stata influenzata da meccanismi definiti biofilm adattivi di resistenza [15]. CHD-FA è un acido organico colloidale, che è un importante costituente di acidi umici. Una forma purificata di CHD-FA è stato recentemente prodotto mediante un processo brevettato, che ha dimostrato di essere non tossici in un modello di ratto ferita, con i suggerimenti di attività anti-infiammatoria [16]. Inoltre, un recente studio randomizzato, in doppio cieco, controllato processo ha indicato che è stato ben tollerato in uno studio clinico di eczema [17].
Lo scopo di questo studio è stato quello di verificare se CHD-FA ha un ampio spettro di attività contro biofilm microbici rilevanti orale per determinare se potrebbe essere utilizzata come alternativa alla CHX collutori base, che sono noti effetti collaterali da uso prolungato. L'obiettivo secondario dello studio era quello di determinare se la concentrazione antibatterico di CHD-FA aveva alcuna proprietà immunomodulanti adiuvanti, come riportato altrove [16]. Si segnala che CHD-FA mostra attività igienizzante rapido contro i biofilm per via orale rilevanti, e che è anche in grado di down-regolare l'espressione di molecole pro-infiammatorie in via orale importanti cellule epiteliali.
Metodi
Cultura condizioni e standardizzazione
Una selezione di ceppi di laboratorio di commensali e batteri patogeni associati al morbo di biofilm orali sono stati utilizzati in questo studio, tra cui Porphyromonas gingivalis
ATCC 33277 e Fusobacterium nucleatum
ATCC 10596, che sono stati mantenuti a 37 ° C su anaerobi esigenti agar (FAA [Lab M, Lancashire, Regno Unito]) in condizioni anaerobiche (85% N
2, il 10% di CO 2 e il 5% H 2, [Don Whitley Scientific Limited, Shipley, Regno Unito] ). Streptococcus mutans
10449, Streptococcus mitis
NCTC 12261, Aggregatibacter actinomycetemcomitans
OSM 1123 e Enterococcus faecalis
NCTC 5957 sono state coltivate e mantenuta a 37 ° C sulla Colombia agar sangue (CBA [Oxoid, Hampshire, Regno Unito ] a 5% di CO 2. Tutti gli isolati sono stati conservati a tempo indeterminato in fiale Microbank® (Pro-Lab Diagnostics, Cheshire, UK) a -80 ° C.
P. gingivalis
e F. nucleatum
sono state propagate in brodo anaerobica 10 ml di Schaedler (Oxoid), S. mitis
e A. actinomycetemcomitans
sono state coltivate in 10 ml di Tryptic Soy Broth (TSB [Sigma-Aldrich, Dorset, Regno Unito]) integrato con 0,6% estratto di lievito e lo 0,8% di glucosio. E. faecalis
sia stata coltivata nelle TSB con 0,25% di glucosio, e S. mutans
è stato coltivato in 10 ml cuore cervello infusione (BHI [Sigma-Aldrich]), il tutto a 37 ° C e nelle appropriate condizioni atmosferiche. culture overnight sono state lavate per centrifugazione (1000 xg
) e risospese in 10 ml di PBS. Tutti i batteri sono stati poi standardizzate e regolate ad una concentrazione finale di lavoro di 5 × 10 4 e 1 × 10 7 cellule /ml rispettivamente per planctonici e test di suscettibilità sessili,.
antibatterico test di sensibilità delle cellule planctonici e biofilm
Nel corso di questo studio due composti attivi dai prodotti per l'igiene orale Dentracine (Fulhold Ltd, Città del Capo, Sud Africa) e Corsodyl (GlaxoSmithKline Consumer Health Care, UK) sono stati testati, vale a dire, rispettivamente, CHD-FA e CHX.
test antimicrobica per determinare stata eseguita concentrazioni minime inibenti (MIC) di cellule planctoniche (PMIC) utilizzando il metodo microdiluizione in brodo CLSI M11-A8 per i batteri anaerobici [18] e CLSI M7-A9 per i batteri coltivati in 5% di CO 2 [19]. concentrazioni minime battericide (MBC) sono stati determinati anche con metodi di placcatura standard. Compra di test standardizzati biofilm P. gingivalis
, F. nucleatum, S. mitis
e A. actinomycetemcomitans
sono state coltivate per 72 h ed E. faecalis
per 24 ore nei loro rispettivi mezzi e le condizioni atmosferiche, con l'eccezione di S. mutans
che è stato coltivato in BHI completato con il 2% di saccarosio per 48 ore. I biofilm sono state coltivate in modo statico in disponibili in commercio da 96 pozzetti piatti piastre da microtitolazione a fondo (Corning Incorporated, NY, USA) e test di suscettibilità sessili è stata eseguita come descritto altrove [20]. Dopo il trattamento antimicrobico, biofilm sono state lavate due volte con PBS e il 10% alamarBlue® (Invitrogen, Paisley, UK) è stato aggiunto al biofilm prima dell'incubazione per 4 h al buio [21]. Sessili concentrazioni minime inibenti (SMICs) sono state lette visivamente e nessun cambiamento di colore è stata definita come la SMIC. Test di tutti gli isolati planctonici e sessili è stato eseguito in quadruplicato in due diverse occasioni.
Antibatterico test di sensibilità di un multi-specie di biofilm parodontale
Un modello di biofilm parodontale multi-specie composto da P. gingivalis
, F. nucleatum, S. mitis
e A. actinomycetemcomitans
stato sviluppato per la prova antimicrobica. Tutte le specie di batteri sono stati standardizzati a 1 × 10 7 ufc /mL nella saliva artificiale (AS) come descritto in precedenza [22]. Questo comprendeva mucine stomaco suina (0.25% w /v), sodio cloruro (0,35 w /v), cloruro di potassio (0,02 w /v), cloruro di calcio diidrato (0,02 w /v), estratto di lievito (0,2 w /v ), laboratorio di polvere di LEMCO (0,1 w /v), peptone proteoso (0,5 w /v) in DDH 2O. Urea è stato diluito in PBS (40% w /v) ed aggiunto ad una concentrazione finale di 0,05% (v /v) in AS. I biofilm sono stati preparati in 24 pozzetti (Corning, NY, USA) contenenti coprioggetto Thermanox ™ personalizzati (13 mm di diametro, Fisher Scientific). Per l'aggiunta di ciascuna specie batteriche al biofilm una sospensione batterica standardizzato è stata preparata in 500 microlitri di AS. Inizialmente, S. mitis
biofilm sono state coltivate per 24 h. Media è stato poi rimosso e standardizzato F. nucleatum
aggiunto, che è stato incubato anaerobicamente per altre 24 h. Il surnatante è stato nuovamente rimosso e standardizzati gingivalis P.
e A. actinomycetemcomitans
in AS aggiunto al biofilm. Questo è stato poi incubato a 37 ° C in una camera anaerobica per altri 4 giorni; ogni giorno surnatanti sono stati sostituiti con fresco AS. Come CHD-FA ha dimostrato di essere attivo 0,5% v /v contro tutte biofilm batterici testati in questo studio, questa concentrazione è stato utilizzato in aggiunta al 0,2% v /v CHX per trattare multispecie biofilm per 30 minuti, prima accuratamente lavato con PBS e biofilm vitalità determinata utilizzando alamarBlue®. L'assorbanza è stata letta a 570 nm e la lunghezza d'onda di riferimento a 600 nm. La percentuale di riduzione del biofilm fattibilità è stato calcolato in base alle istruzioni del produttore. Questo studio è stato eseguito in tre diverse occasioni, in triplice copia.
A seguito del trattamento antimicrobico, biofilm sono stati conservati e utilizzati per quantificare il numero di ciascuna specie batteriche trovate dopo CHD-FA e il trattamento clorexidina rispetto al controllo non trattato. In breve, biofilm sono stati sonicato in 1 ml di PBS per 10 minuti e il DNA estratto utilizzando il Gram positivi DNA Purificiation Kit MasterPure (Epicentre®, Cambridge, UK), seguendo le istruzioni del fabbricante. 1 ml di DNA estratto è stato aggiunto a un Mastermix contenente 12,5 ml SYBR® Greener ™, 9,5 ml UV-trattati RNase-free acqua e 1 ml di 10 micron primer avanti /indietro per ciascuna specie batteriche. I primer utilizzati sono stati i seguenti:
A. actinomycetemcomitans
F - 5'GAACCTTACCTACTCTTGACATCCGAA3 ', A. actinomycetemcomitans
R - 5'TGCAGCACCTGTCTCAAAGC3', F. nucleatum
F - 5'GGATTTATTGGGCGTAAAGC3 ', F . nucleatum
R - 5'GGCATTCCTACAAATATCTACGAA3 ', P. gingivalis
F - 5'GCGCTCAACGTTCAGCC3', P. gingivalis
R - 5'CACGAATTCGCCTGC3 ', S. mitis
F - 5'GATACATAGCCGACCTGAG3' , S. mitis
R -. 5'CCATTGCCGAAGATTCC3 '
Tre repliche indipendenti di ciascun parametro sono stati analizzati in triplicato utilizzando la macchina MxProP PCR quantitativa e software MxProP 3000 (Stratagene, Amsterdam, Paesi Bassi). I campioni sono stati quantificati basati su una curva standard precedentemente stabilito composta da noti conta batterica.
Ultrastrutturali cambiamenti di biofilm batterici
microscopio elettronico a scansione (SEM) è stata eseguita su S. mutans
, E. faecalis
e le multispecie biofilm. Le cellule sono state standardizzate in mezzi appropriati, come descritto sopra, e coltivate direttamente sul coprioggetto Thermanox ™ (Nunc, Roskilde, Danimarca) per permettere la formazione di biofilm. A seguito di biofilm di maturazione sono stati accuratamente lavati con PBS prima che i loro rispettivi trattamenti. Biofilm sono stati poi accuratamente lavate due volte con PBS e poi fissate in 2% para-formaldeide, 2% glutaraldeide e 0,15 M cacodilato di sodio e 0,15% w /v Alcian Blu, pH 7.4, e preparato per SEM come precedentemente descritto [23]. I campioni sono stati sputtering rivestite con oro e hanno al microscopio elettronico a scansione JEOL JSM-6400. Le immagini sono state assemblate utilizzando Photoshop software (Adobe, San Jose, CA, USA).
Tossicità di CHD-FA su una linea di cellule epiteliali orali
OKF6 /TERT2 cellule (Donata da laboratorio Rheinwald, Brigham e dell'ospedale della donna, Boston, stati Uniti d'America), una linea di cellule cheratinociti orale umano immortalato, sono stati utilizzati per determinare la citotossicità di CHD-FA. Le cellule sono state coltivate a 90% di confluenza in cheratinociti terreno privo di siero (KSFM) a 37 ° C in 5% CO 2 e seminate ad una densità di 1 × 10 5 cellule /ml in una piastra 24 pozzetti. Una volta che le cellule hanno raggiunto 80-90% di confluenza, le cellule sono state accuratamente lavate con PBS prima del trattamento con 0,5% (v /v) CHD-FA al pH nativa 2.0 e un pH neutro di 7,0 e 0,2% (v /v) CHX per 30 min. Dopo 30 min, i composti sono stati rimossi e le cellule accuratamente lavate con PBS per rimuovere eventuali residui attivi. Le cellule sono state incubate in KSFM per 4 e 24 ore prima vitalità cellulare è stata valutata usando il saggio alamarBlue®, come descritto sopra. studi di fattibilità sono stati effettuati in triplice copia, in tre diverse occasioni.
Valutare proprietà immunomodulanti di CHD-FA
OKF6 /TERT2 cellule sono state coltivate al 90% di confluenza in 24 pozzetti in definito KSFM quindi pre-trattati con 0,5 % CHD-FA (pH 7,0) per 30 min. CHD-FA a pH 2.0 era tossico contro la linea cellulare utilizzato in questo studio e, pertanto, non poteva permettere di analizzare eventuali potenziali proprietà immunomodulanti di questo composto. Pertanto, CHD-FA tamponata a pH 7,0 è stato utilizzato per valutare eventuali ulteriori proprietà biologiche del composto. 0,5% CHD-FA a pH 2,0 e lo 0,2% clorexidina hanno dimostrato di essere tossici per le cellule epiteliali, quindi non sono state ulteriormente indagato. Le cellule sono state lavate con PBS per rimuovere residui CHD-FA. Come un agonista infiammatoria abbiamo usato i multispecie biofilm parodontale, come sopra descritto, che è stato fissato al lato inferiore di un inserto di coltura cellulare appeso (Millipore, Massachusetts, USA) utilizzando vaselina, poi gettato adiacente al monostrato cellulare. Le cellule sono state incubate con il biofilm parodontale per 4 e 24 ore a 37 ° C in 5% CO 2. Le cellule non pre-trattati con CHD-FA o non perseguite con biofilm, serviti controlli a seconda dei casi. A seguito di stimolazione, supernatanti e lisati cellulari sono stati mantenuto per valutare la regolazione di un gruppo di mediatori pro-infiammatori.
Iniziale analisi di espressione genica è stata effettuata utilizzando un personalizzato progettato RT 2 Profiler PCR Array (Qiagen, Crawley, Regno Unito ). RT 2 array Profiler sono in tempo reale basato SYBR® Greener ™ PCR che consentono l'individuazione di diversi geni di interesse, allo stesso tempo. In breve, 24 pl di una Mastermix contenente SYBR® Greener ™, cDNA sintetizzato utilizzando la RT 2 First Strand Kit (Qiagen) e acqua RNase-free è stato aggiunto a ciascun pozzetto del 2 piastra Profiler RT, che già conteneva i primer avanti e inversa per i geni di interesse (iL-1α, iL-1b, iL-6, TNF, QCS2, CSF3, iL-8, CXCL1, CXCL3, CXCL5, CCL1 e GAPDH). Due repliche di ogni condizione sono stati utilizzati in RT 2 Profiler, che è stata effettuata in due diverse occasioni.
IL-8 espressione del gene è stato analizzato utilizzando basato SYBR® verde qPCR (Invitrogen), utilizzando GAPDH come un servizio di pulizia gene. I primer utilizzati sono i seguenti: IL-8 F 5'CAGAGACAGCAGAGCACACAA3 ', IL-8 R 5'TTAGCACTCCTTGGCAAAAC3', GAPDH F 5'CAAGGCTGAGAACGGGAAG3 ', GAPDH R 5'GGTGGTGAAGACGCCAGT3'. In breve, l'RNA è stato estratto da lisati cellulari (Qiagen, Crawley, Regno Unito) e 55 ng /ml di cDNA sintetizzato utilizzando la RT 2 First Strand cDNA kit di sintesi (Qiagen, Crawley, Regno Unito), come da istruzioni del produttore. 1 ml di sintesi cDNA è stato aggiunto ad un Mastermix contenente 12,5 ml SYBR® verde ™, acqua RNase-free 10.5 ml UV-trattati e 0,5 ml di primer avanti /indietro. Tre repliche indipendenti di ciascun parametro sono stati analizzati in duplicato utilizzando macchina MxProP PCR quantitativa e software MxProP 3000 (Stratagene, Amsterdam, Paesi Bassi) e l'espressione genica normalizzato per la GAPDH gene housekeeping secondo il -ΔΔCT
metodo 2 [24 ].
interleuchina 8 (IL-8) immissione in sovranatanti di coltura cellulare è stata valutata mediante test ELISA (Invitrogen, Paisley, UK), secondo le istruzioni del produttore. I risultati sono stati calcolati utilizzando un 4 parametri della curva in forma, quantificare i cambiamenti colometric a 630 nm (BMG-Labtech, Ortenberg, Germania).
Analisi statistica
produzione Grafico, la distribuzione dei dati e l'analisi statistica sono state eseguite utilizzando GraphPad Prism (versione 4, La Jolla, CA, USA). Dopo aver valutato se i dati conformi ad una distribuzione normale prima e dopo la trasforma i dati, a senso unico analisi della varianza (ANOVA) e t test sono stati usati per studiare le differenze significative tra i gruppi indipendenti di dati che approssimata a una distribuzione gaussiana. Una correzione Bonferroni è stata applicata al valore p per tenere conto di confronti multipli dei dati. I dati non parametrici è stato analizzato utilizzando il Mann-Whitney U-test
per valutare le differenze tra i due gruppi di campioni indipendenti. Student t-test sono stati usati per misurare le differenze statistiche tra i valori Δ
Ct dei due gruppi indipendenti valutati in studi di espressione genica, anche se i dati possono essere rappresentati come percentuale o piegare cambiamento nelle figure. La significatività statistica è stata ottenuta se P & lt; 0.05
. Risultati
CHD-FA ha attività antibatterica rapida e ad ampio spettro
Corsodyl® (0,2% CHX) e Dentracine (0,8% CHD-FA) sono formulazioni orali contenenti i principi attivi CHX e CHD-FA, rispettivamente. Entrambi gli agenti hanno dimostrato di essere molto attivo contro tutti i planctonici e batteri orali sessili testati (dati non riportati). Gli studi descritti in questo manoscritto è concentrata sulla principi attivi CHX e CHD-FA ed entrambi hanno dimostrato di essere altamente efficace a inibire e uccidere tutti gli isolati orali testati quando coltivate sia planktonically e come biofilm (Tabella 1). PMIC per gli isolati orali variava da 0,0625% a 0,25% per CHD-FA e da & lt; 0,00,039 mila% a 0,00,078 mila% per CHX. Il rapporto /PMIC PMBC per CHD-FA e CHX erano ≤4, indicando entrambi i composti visualizzati attività battericida. Nessuna delle specie batteriche testate erano notevolmente più sensibili o resistenti a uno dei composti. Entrambi CHD-FA e CHX hanno mostrato attività contro biofilm maturi, con SMICs di 0,5% per CHD-FA e dal 0,003% al 0,025% per CHX. Curiosamente, sebbene CHX era efficace a concentrazioni inferiori, la variazione piega da PMIC al SMIC variava da solo 2 a 8 per CHD-FA, mentre per CHX questo variava da 2 a 64. In generale, P. gingivalis
è stato il più suscettibile organismo alle terapie antimicrobiche testate, in particolare per le cellule planctoniche. Inoltre, tutti i biofilm batterici sono stati ugualmente suscettibili di CHD-FA con SMIC dello 0,5% .table profilo 1 sensibilità dei batteri orali clinicamente rilevanti a quattro agenti antimicrobici
MIC (%)
CHD-FA
CHX
Organismo
PMIC
MBC
SMIC
Fold cambiare
PMIC
MBC
SMIC
Piegare cambiamento
(SMIC /PMIC)
(SMIC /PMIC)
A. a *
0.25
0.25
0.5
2
0.00078
0.00313
0.025
32
S. mitis
0.0625
0.125
0.5
8
0.00078
0.00156
0.0125
16
S. mutans
0.25
0.25
0.5
2
0.00039
0.00078
0.025
64
E. faecalis
0.125
0.25
0.5
4
0.00156
0.025
0.003
2
F. nucleatum
0.125
0.5
0.5
4
0.00039
0.00078
0.195
32
gingivalis P.
0.0625
0.5
0.5
8
≤0.00039
0.00078
0.0625
≥16
*UN. . Actinomycetemcomitans
CHD-FA - (Fulhold Ltd, Sud Africa), CHX -. (GlaxoSmithKline Consumer Health Care, UK)
maggiori analisi dell'impatto di CHD-FA sulla struttura cellulare fisica è stata valutata da SEM per biofilm rappresentativi. trattamento CHD-FA ridotto la quantità complessiva di S. mutans
ECM (Figura 1B) e anche causato perturbazioni della membrana cellulare, come dimostrato dalla comparsa perforato di E. faecalis
(Figura 1D). Figura 1 CHD-FA riduce ECM e compromessi struttura della membrana cellulare. S. mutans
(X2000) ed E. faecalis
(A e C, rispettivamente) (X5000) biofilm erano o non trattati o trattati con 0,5% (v /v) CHD-FA (B e D, rispettivamente) per 24 h su vetrini Thermanox ™. Questi sono stati poi elaborati e visualizzati su un microscopio elettronico a scansione JEOL JSM-6400 e immagini assemblati utilizzando il software Photoshop. Si noti la riduzione della matrice extracellulare (B) e la perturbazione delle membrane batteriche delle cellule (D), indicati dalle frecce sulle cellule sessili.
CHD-FA è efficace contro un multi-specie di biofilm parodontale
Dato che biofilm del orale cavità sono polimicrobica in natura, abbiamo sviluppato un semplice e riproducibile modello rappresentativo multi-specie di placca sub-gengivale per testare CHD-FA (Figura 2A). L'attività antimicrobica di CHD-FA a 1 x SMIC ha dimostrato di ridurre significativamente la vitalità cellulare a meno del 10% (p & lt; 0,0001), che era paragonabile alla CHX, che anche significativamente ridotto vitalità cellulare all'8% (p & lt; 0,0001). Tuttavia, dopo il trattamento il numero di ciascuna specie all'interno dei biofilm sono stati quantificati e non ha mostrato alcuna significativa riduzione della biomassa dopo CHD-FA o trattamento CHX, rispetto al controllo non trattato (Figura 2B). Figura 2 CHD-FA uccide e distrugge multi-specie biofilm parodontali. Multi-specie biofilm parodontali sono state coltivate su vetrini Thermanox ™ entro 24 pozzetti per un totale di 5 giorni, con AS mezzi cambiati ogni giorno. Dopo lo sviluppo del biofilm, le cellule sono state trattate con 0,5% (v /v) CHD-FA e 0,2% (v /v) CHX per 24 ore prima di essere lavate con PBS. Riduzione dell'attività metabolica è stata misurata usando il saggio alamarBlue® (A). Tutti i campioni sono stati analizzati in triplice copia, in tre diverse occasioni. Dati rappresenta media ± DS (*** p & lt; 0,0001). I biofilm sono stati mantenuti dopo il trattamento con CHD-FA o CHX e DNA è stato estratto per la quantificazione di ogni specie che utilizzano SYBR® verde ™ basato qPCR (B). I biofilm sono stati analizzati anche da SEM sia a 2000x (C, E, G) e 5000X (D, F, H). Questi sono stati elaborati e visualizzati su un microscopio elettronico a scansione JEOL JSM-6400 e immagini assemblati utilizzando il software Photoshop. multispecie non trattati biofilm sono stati confrontati a basso ingrandimento (C) per biofilm trattati con 0,2% (v /v) CHX (E) e 0,5% (v /v) CHD-FA (G) per 24 ore ed è stato dimostrato che biofilm trattamenti hanno causato disaggregazione. A maggiore ingrandimento biofilm trattati con 0,5% (v /v) CHD-FA per 24 h comportato un ECM fibroso, come indicato dalle frecce (H), rispetto al controllo (D) e CHX (F).
analisi SEM di questi biofilm è stata poi effettuata per valutare eventuali effetti sull'architettura biofilm (Figura 2C-H). A basso ingrandimento (X2000) sia CHX e CHD-FA sono stati mostrati per interrompere l'architettura biofilm (Figura 2E e G) rispetto al controllo non trattato (Figura 2C), come mostrato da aree di biofilm disaggregati sparse. Inoltre, ad alto ingrandimento (X5000) CHD-FA apparso anche per modificare l'aspetto fisico generale della matrice biofilm con maggiori quantità di ECM fibroso osservate come indicato dalle frecce (figura 2H), rispetto al controllo e CHX (Figura 2D e F).
CHD-FA altera l'espressione di mediatori pro-infiammatori
tossicità CHD-FA è stata valutata utilizzando una linea di cellule epiteliali per via orale rilevante per determinare se ci fossero effetti nocivi dei composti testati prima di indagini immunomodulatori. Sia CHX e CHD-FA, al suo pH nativa di 2.0, hanno dimostrato di essere altamente tossico nei confronti di cellule epiteliali, riducendo redditività a meno del 10% dopo 30 minuti di esposizione (figura 3). Tuttavia, quando CHD-FA è stata tamponata ad un pH neutro di 7,0, è stata osservata alcuna diminuzione significativa della vitalità cellulare. Figura 3 CHD-FA è atossico contro una linea cellulare epiteliale orale. Una linea di cellule epiteliali per via orale rilevante (OKF6 /TERT2) è stato coltivato per il 90% confluenza in 24 pozzetti per gli studi di tossicità. Le cellule sono state trattate con 0,5% (v /v) CHD-FA a pH 2.0 e 7.0 e 0.2% CHX per 30 min. Dopo il trattamento, le cellule sono state accuratamente lavate con PBS e vitalità cellulare valutati utilizzando il test alamarBlue®, con assorbanza leggere a 570 e 600 nm. Tutti i campioni sono stati analizzati in triplice copia, in tre occasioni indipendenti. Dati rappresenta media ± DS (*** p & lt; 0,0001).
Abbiamo poi deciso di determinare o meno CHD-FA è stato in grado di indurre una risposta biologica dalle cellule epiteliali, soprattutto misurando i cambiamenti nella mediatori immunitari. Per valutare questo, un modello biofilm quattro specie è stata sviluppata, dove sono stati osservati problemi di tossicità a contatto con la linea di cellule epiteliali a 4 h (dati non mostrati). Inoltre, abbiamo dimostrato che le cellule CHD-FA trattati non alterano significativamente il rilascio di IL-8 dopo 4 ore e 24 ore (dati non mostrati). I primi studi di espressione genica utilizzando la RT 2 Profiler sulle cellule epiteliali pre-trattati con CHD-FA prima sfida biofilm hanno mostrato un generale down-regulation di mediatori pro-infiammatori (figura 4a). Significativi i geni down-regolato inclusi IL-6 (8,5 volte [p = 0.018]), IL-1β (7,05 volte [p = 0.012]), TNF (5,22 volte [p = 0.013]) e IL-8 (4.24 volte [ ,,,0],p = 0,021]). Figura 4 CHD-FA modula mediatori infiammatori chiave in vitro. Una linea di cellule epiteliali orali (OKF6) è stato cresciuto al 90% di confluenza in 24 pozzetti per valutare l'effetto di CHD-FA sulla risposta immunitaria dell'ospite. Le cellule sono state pre-trattate con 0,5% (v /v) CHD-FA pH 7,0 per 30 minuti, lavate con PBS e stimolati con il multispecie biofilm parodontale per 4 e 24 ore. Sono stati inclusi anche controlli non trattati. I campioni sono stati analizzati in triplice copia e in tre diverse occasioni. RNA è stato estratto dai lisati cellulari 4 h, cDNA sintetizzato ed usato nella RT2 Profiler per analizzare l'espressione di un panel di mediatori pro-infiammatori (A). campioni in doppio da due esperimenti indipendenti sono stati utilizzati nel RT2 Profiler. Dati è rappresentata dalla media ± 95% CI, rispetto al controllo non trattato. I campioni sono stati analizzati anche per IL-8 espressione genica utilizzando basato SYBR® verdi ™ qPCR (B). L'espressione di IL-8 è rappresentata rispetto al gene housekeeping; GAPDH. supernatanti a nuovo sono stati utilizzati anche per misurare il rilascio della proteina IL-8 da ELISA (C). Tutti i campioni sono stati analizzati in triplice copia, in tre occasioni indipendenti. Dati rappresenta media ± SD (* p & lt; 0.05, ** p & lt; 0,01)
Abbiamo poi concentrati su IL-8 espressione, uno dei geni colpiti in maniera significativa e un mediatore chiave di infiammazione parodontale.. A livello di mRNA, IL-8 è stata significativamente down-regolato in cellule pre-trattate con CHD-FA dopo 4 h, rispetto al controllo non trattato (p = 0,0383) (Figura 4B). Nessuna differenza statisticamente significativa è stata osservata dopo 24 ore di stimolazione (p = 0,1712). Inoltre, a livello proteico, IL-8 rilascio è stato dimostrato di essere significativamente down-regolato quando le cellule sono stati pre-trattati con CHD-FA, dopo 4 h (p = 0,008) e 24 h (p = 0,0037) stimolazione biofilm ( Figura 4C). . CHD-FA da solo non ha avuto effetto sulla cellule epiteliali orali IL-8 mRNA o espressione della proteina (dati non riportati)
Discussione
malattie microbiche orali sono tipicamente mediata da biofilm; comunità di microrganismi che co-aggregazione come strutture appiccicose e tenaci e che tipicamente hanno una maggiore resistenza agli antimicrobici [25]. Abbiamo recentemente riportato che colluttori, tra cui CHX erano inefficaci contro una vasta gamma di ceppi di MRSA clinici [10], il che suggerisce che gli agenti antimicrobici alternativi dovrebbe essere indagato. Infatti, recenti studi in C. albicans
hanno dimostrato che l'uso di molecole di derivazione naturale sono efficaci sia contro gli isolati oralmente e sistemicamente derivati [14, 15]. Qui si segnala che CHD-FA, una molecola di derivazione naturale antisettico, mostra una rapida attività antimicrobica ad ampio spettro, e suscita anche l'attività immunomodulante.
In primo luogo abbiamo intrapreso una valutazione comparativa di CHD-FA e CHX contro una vasta gamma di batteri importanti associati con le infezioni orali biofilm.
